全 文 ：天然虫草与虫草菌丝体的 ＨＰＬＣ指纹图谱研究
武彦舒１，２，周丹蕾１，３，鄢 丹１，任永申１，２，方艺霖１，２，肖小河１，
杜晓曦４，王 建２
（１．解放军３０２医院 全军中药研究所，北京 １０００３９；２．成都中医药大学 药学院，四川 成都 ６１１１３７；
３．昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 ６５０２２４；
４．国家食品药品监督管理局 药品审评中心，北京 １０００３８）
［摘要］ 目的：建立虫草及虫草菌丝体的 ＨＰＬＣ指纹图谱，为其质量控制提供参考依据。方法：采用 ＨＰＬＣ
法，以磷酸缓冲盐（ｐＨ６５，Ａ）甲醇（Ｂ）为流动相，梯度洗脱，检测波长 ２６０ｎｍ；对指纹图谱进行相似度评价、聚类
分析。结果：所建立的指纹图谱分析方法的方法学考察符合规定标准，确定了１０个共有峰；该方法能很好的鉴别
不同产地虫草及虫草菌丝体。结论：该方法简便可靠，重复性好，可作为目前虫草内在质量控制的有效方法之一。
［关键词］ 虫草；虫草菌丝体；ＨＰＬＣ指纹图谱；相似度评价；聚类分析；质量控制
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１９２２１２０４
［收稿日期］ ２００８０２１３
［基金项目］ 国家杰出青年科学基金（Ｃ０３０５０２０４）
［通讯作者］ 肖小河，Ｔｅｌ：（０１０）６６９３３３２２，Ｅｍａｉｌ：ｐｈａｒｍａｃｙ
３０２＠１２６．ｃｏｍ；杜晓曦，Ｅｍａｉｌ：ｄｕｘｘ＠ｃｄｅ．ｏｒｇ．ｃｎ
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌
Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．寄生在蝙蝠蛾科昆虫
幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体［１］。为我国传
统名贵中药，始载于《本草从新》，谓其能保肺，益肾
止血，化痰止劳嗽。冬虫夏草主产于我国青海、西
藏、四川、云南等省海拔３５００～５０００ｍ的高原高寒
草甸，因其生长环境的限制，野生虫草资源奇缺，价
格昂贵，形成了“越贵越挖，越挖越贵”的恶性循环。
为解决天然虫草资源紧张问题，人们采用液体深层
培养法来生产冬虫夏草菌丝体［２］，近年来人工培养
冬虫夏草菌丝体获得成功，冬虫夏草人工培养物制
剂已广泛用于临床，并取得可喜疗效。但是有关冬
虫夏草及虫草菌丝体的质量控制，目前国内外没有
统一的方法可循，国外多测定腺苷、多糖等成分的含
量；《中国药典》２００５年版冬虫夏草项下以单一成分
腺苷的含量来控制虫草的质量。再者，由于虫草价
格昂贵，一些不法商人为了谋取利益，市场上伪品甚
多，可以说已是鱼目混珠、真伪难辨。本实验同时对
天然虫草和虫草菌丝体的ＨＰＬＣ指纹图谱进行了研
究，避免了单一成分控制中药质量的不足，并通过相
似度评价、聚类分析将不同产地虫草及虫草菌丝体
很好的鉴别。该方法可以作为目前虫草及虫草菌丝
体内在质量控制的有效方法之一。
１ 仪器与试药
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ｓｅｒｉｅｓ高效液相色谱仪（包括四元
泵、二极管阵列检测器、在线脱气机），Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎｓ
色谱工作站（美国 Ａｇｉｌｅｎｔ有限公司）；ＤｉａｍｏｎｓｉｌＴＭ
（钻石）Ｃ１８柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；ＭＥＴＴＬＥＲ
－ＡＥ１６３型电子天平（１／１０万）；飞鸽Ａｎｋｅ－ＴＧＬ－
１６Ｃ离心机；甲醇为色谱纯、水为娃哈哈纯净水；
ＮａＨ２ＰＯ４，Ｎａ２ＨＰＯ４为分析纯；
西藏虫草、青海虫草为市售一等品，经中国人民
解放军３０２医院全军中药研究所肖小河研究员鉴定
为麦角菌科真菌冬虫夏草菌 Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ寄生在蝙蝠
蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体；金水
宝胶囊（江西济民可信金水宝制药有限公司）；百令
胶囊（杭州中美华东制药有限公司），见表１。
腺苷（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ，８７９２００２０２）、尿苷（ｕｒｉｄｉｎｅ，
８８７２００２０２）、腺嘌呤（ａｄｅｎｉｎｅ，８８６２００００１）、尿嘧啶
（ｕｒａｃｉｌ，１００４６９２００４０１）、胸腺嘧啶（ｔｈｙｍｉｎｅ，１４７０８
２００４０１）、次黄嘌呤（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ，１４０４４１２００４０２）、
虫草素（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ，８５８２００２０２）对照品皆购于中国
药品生物制品检定所；鸟苷（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ，Ｇ８２５０，北京
索莱宝科技有限公司）。
２ 方法
２．１ 色谱条件 ＤｉａｍｏｎｓｉｌＴＭ（钻石）Ｃ１８色谱柱
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２００８年１０月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １９
Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００８
表１ 样品来源
Ｎｏ． 样品 Ｎｏ． 样品
Ｓ１ 西藏虫草Ａ Ｓ６ 百令胶囊Ａ（０５１２２１）
Ｓ２ 西藏虫草Ｂ Ｓ７ 百令胶囊Ｂ（０６０３１１）
Ｓ３ 西藏虫草Ｃ Ｓ８ 青海虫草Ａ
Ｓ４ 金水宝胶囊Ａ（０５１１３７） Ｓ９ 青海虫草Ｂ
Ｓ５ 金水宝胶囊Ｂ（０５０８１３） Ｓ１０ 青海虫草Ｃ
（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相 磷酸缓冲盐（ｐＨ
６５）（Ａ）［取００１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＨ２ＰＯ４６８５ｍＬ与
００１ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２ＨＰＯ４３１５ｍ，混合（ｐＨ６５）］甲
醇（Ｂ）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为０ｍｉｎ，９８％
Ａ；１２ｍｉｎ，９８％ Ａ；１５ｍｉｎ，９２％ Ａ；２５ｍｉｎ，９２％
Ａ；３０ｍｉｎ，８０％ Ａ；３５ｍｉｎ，６５％ Ａ；４０ｍｉｎ，６５％
Ａ。进样量５μＬ；体积流量０８ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温２５
℃；检测波长２６０ｎｍ。精密吸取２０％甲醇５μＬ，注
入液相色谱仪，３０ｍｉｎ内基线平稳，３２～４０ｍｉｎ基线
略向上波动，但整体较平稳，表明溶剂对样品分析基
本无影响。尿苷峰面积较大，出峰时间居中，且与其
他色谱峰分离度良好，符合参照色谱峰要求，故选尿
苷色谱峰作为参照色谱峰。
２．２ 样品的制备 对照品溶液的配制：分别精密称
取腺苷、尿苷、鸟苷、腺嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、次黄
嘌呤、虫草素适量，用２０％甲醇分别配制成２７，２８，
３３，３２，３３，３１，２９，２７ｍｇ·Ｌ－１的混合对照品溶液，
０２２μｍ微孔滤膜过滤，５℃冷藏备用。
供试品溶液的配制：精密称取各样品０２０８６ｇ
（西藏虫草、青海虫草粉碎，过６０目），分别置于２０
ｍＬ具塞锥形瓶中，加入２０％甲醇５ｍＬ，称重，超声
提取４０ｍｉｎ，取出放冷，再称重，用体积分数为２０％
甲醇补足减重，摇匀，离心１５ｍｉｎ（１万 ｒ·ｍｉｎ－１），
取上清液过０２２μｍ微孔滤膜，弃去初滤液，取续
滤液，即得供试品溶液。５℃冷藏备用。
２．３ 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样５
次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的
ＲＳＤ均＜３０％。采用中药色谱指纹图谱相似度评
价软件（国家药典委员会，２００４Ａ版）进行数据分析
处理，其相似度大于０９，表明仪器精密度良好。
２．４ 重复性试验 取同一批药材样品共５份，精密
称定，按供试品溶液配制项下方法制备供试品溶液，
在上述色谱条件下，注入液相色谱仪，测得各共有峰
相对保留时间和相对峰面积的 ＲＳＤ值均小于
３０％，相似度大于０９，表明重复性良好。
２．５ 稳定性试验 取同一供试品溶液在１２ｈ内间
隔２ｈ进行考察，测得各共有色谱峰相对保留时间
和相对峰面积的 ＲＳＤ值均小于 ２％，相似度大于
０９，表明样品在１２ｈ内稳定性良好。
３ 结果
３．１ 指纹图谱分析 按照２．１项下色谱条件，对各
样品进行了测定。采用中药色谱指纹图谱相似度评
价系统（国家药典委员会，２００４Ａ）对不同样品色谱
图进行分析，确定了１０个共有峰，保留时间分别为
４０９，５２９，８９２，１４８４，１８４１，２７２７，３２９３，
３６１８，３６９１，３８５９ｍｉｎ，见图１。
１．尿嘧啶；２．次黄嘌呤；３．尿苷；４．胸腺嘧啶；
５．腺嘌呤；６．鸟苷；７．腺苷；８．虫草素
图１ 混合对照品指纹图谱
通过与混合对照品、样品及样品 ＋混合对照品
的图谱比较，同时比较出各产地虫草及虫草菌丝体
所含成分的差异性。除含有以上１０个共有成分外，
青海虫草尚含有胸腺嘧啶、腺嘌呤、虫草素几个成
分；而西藏虫草则只含有腺嘌呤，其他成分未检测
出；金水宝胶囊也含有胸腺嘧啶、腺嘌呤、虫草素几
个成分；百令胶囊种也只检测出腺嘌呤，见图２。
３．尿嘧啶；４．次黄嘌呤；５．尿苷；６．鸟苷；８．腺苷；
１，２，７，９，１０为未知成分
图２ 虫草及虫草菌丝体的ＨＰＬＣ图谱
３．２ 聚类分析 以１０批样品ＨＰＬＣ指纹图谱与对
照指纹图谱相似度为聚类指标，运用 ＳＰＳＳ１３０ｆｏｒ
Ｗｉｎｄｏｗｓ统计分析软件进行分析，结果见图３。计
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算机辨识结果表明：Ｓ８Ｓ９Ｓ１０为一类，为青海虫草；
Ｓ１Ｓ２Ｓ３为一类，为西藏虫草；Ｓ６Ｓ７为一类，为百令
胶囊；Ｓ４Ｓ５为一类，为金水宝胶囊。这与实际完全
吻合，表明该方法能很好地鉴别不同产地虫草及虫
草菌丝体，可作为虫草内在质量控制的一种方法。
图３ 样品相似度聚类分析图
４ 讨论及展望
本实验曾考察了乙腈水、０５ｍｏｌ·Ｌ－１醋酸乙
腈２种不同的流动相体系，梯度洗脱，发现个别成分
峰分离度始终欠佳，最后改用本试验使用的流动相
体系，总体分离度较好，且方法的重复性好；同时选
择了２４０，２５４，２６０，２８０ｎｍ４个波长进行扫描，发现
样品在２６０ｎｍ处吸收好、分离度高，故选２６０ｎｍ作
为检测波长，建立了虫草及其菌丝体的指纹图谱。
将样品图谱与混合对照品及样品＋混合对照品
的图谱比较，发现各产地虫草及虫草菌丝体所含成
分的差异性，其药效是否存在差异有待研究。
聚类分析结果与实际完全吻合，表明本研究所
建立的方法适用于不同产地虫草及虫草菌丝体的鉴
别，可以作为虫草内在质量控制的一种有效方法。
指纹图谱技术运用到中药质量控制，避免了利
用单一成分含量测定控制中药质量的不足，在一定
程度上反应了中药的“真实面目”。国外对植物药
及其制剂的质量控制均采用全景质量控制技术
（ＴｏｔａｌＱｕａｌｉｔｙＰｒｏｆｉｌｉｎｇ），即指纹图谱技术［３］。但是
由于中药成分极其复杂，“谱效”关系不能得到体
现，中药指纹图谱质量控制方法只能是一种过渡性
质量控制方法，建立谱效关联的活性指纹图谱才是
解决中药质量控制的出路。但指纹图谱技术在区分
中药材方面，甚至是不同产地的药材鉴定方面有着
显著的优点，这对目前中药材的鉴定和分类在很大
程度上还依赖于经验和表观分析意义重大。
［参考文献］
［１］ 中国药典．一部［Ｓ］．２００５：７５．
［２］ 徐 飞．我国深层培养虫草菌丝体的药用研究［Ｊ］．中国药学
杂志，１９９２，２７（４）：１９５．
［３］ 冯雪松，董鸿晔．中药指纹图谱中的数据挖掘技术［Ｊ］．药学进
展，２００２，２６（４）：１９８．
ＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓａｎｄｍｙｃｅｌｉｕｍｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｄｙ
ＷＵＹａｎｓｈｕ１，２，ＺＨＯＵＤａｎｌｅｉ１，３，ＹＡＮＤａｎ１，ＲＥＮＹｏｎｇｓｈｅｎ１，２，ＦＡＮＧＹｉｌｉｎ１，２，
ＸＩＡＯＸｉａｏｈｅ１，ＤＵＸｉａｏｘｉ４，ＷＡＮＧＪｉａｎ２
（１．ＰＬＡＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，３０２ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３９，Ｃｈｉｎａ；
２．ＰｈａｒｍａｃｙＣｏｌｅｇｅ，ＣｈｅｎｇｄｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００７５，Ｃｈｉｎａ；
３．ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｌｅｇｅ，ＫｕｎｍｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ；
４．ＣｅｎｔｒｅｆｏｒＤｒｕｇＥｖａｌｕａｔｉｏｎ，ＳＦＤＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３８，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｏｆｃｏｒｄｙｃｅｐｓａｎｄｍｙｃｅｌｉｕｍｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｄｙｆｏｒｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｃａｒｉｅｄｏｕｔｏｎａＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８ｃｏｌｕｍｎｅｌｕｔｅｄｗｉｔｈｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｅｒ（ｐＨ６５）ａｎｄｍｅｔｈａｎｏｌａｓｍｏｂｉｌｅ
ｐｈａｓｅ，ｔｈｅｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍｗａｓｕｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ２６０ｎｍ；Ｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄ，
ｔｈｅｎ，ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｖａｌｉｄａｔｅｄａｎｄｉｎｋｅｅｐｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅ
ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ．ＴｅｎｃｏｍｍｏｎｐｅａｋｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ．Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｆｒｏｍｄｉｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓａｎｄｍｙｃｅｌｉｕｍｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｄｙｃｏｕｌｄ
ｂｅｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｂｙｔｈｅＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａｌｒｅｓｕｌｔｓａｂｏｖｅｅｘｈｉｂｉｔｔｈａｔｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｐｒａｃｔｉｃａｂｌｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ，ａｎｄ
ｒｅｌｉａｂｌｅａｓａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃｏｒｄｙｃｅｐｓａｎｄｍｙｃｅｌｉｕｍｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｄｙａｔｐｒｅｓｅｎｔ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ；ｍｙｃｅｌｉｕｍｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｄｙ；ＨＰＬＣｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ；ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ；ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｃｌｕｓｔｅｒ
ａｎａｌｙｓｉｓ；ｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ ［责任编辑 王亚君］
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