全 文 ：#研究报告 #
°≤法测定中药中黄曲霉毒素含量的色谱适应性考察
金 钺 o刘慧灵 o杨美华 o陈建民 3
k中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|wl
≈收稿日期 ussx2tu2t|
≈基金项目 国家 /十五 0重大科技专项 kusst
zstxzl~外
经贸技三函 kusst2t{l
≈通讯作者 3 陈建民 o ר¯} kstsl yu{||zvso ƒ¤¬} kstsl
yu{||zvso∞2°¤¬¯}¦«¨ ±¬¤±°¬± «²·°¤¬¯1¦²°
黄曲霉毒素
t o
u ot ou是黄曲霉 Ασπεργιλλυσ
φλαϖυσ和寄生曲霉 Ασπεργιλλυσ παρασιτιχυσ的二次代谢
产物 o这些毒素具有高毒性和高致癌性 ∀笔者已报
道了用 ≤净化 !过溴化溴化吡啶柱后衍生 o高效
液相色谱 2荧光检测器检测中药中黄曲霉毒素的方
法 ≈t o为考察其色谱适应性 o选用了 u种厂家的免疫
亲合柱及 v种品牌的色谱柱进行了比较 ∀
1 仪器与试药
水为重蒸水 ~甲醇 !乙腈为色谱纯 ~过溴化溴化
吡啶为分析纯 kƒ¬¶«¨ µ公司 l~黄曲霉毒素混合对照
品溶液购自 ≥°∞≤公司 o纯度 ∴ ||h o其中黄曲
霉毒素
t为 s1||y Λª# °pt o
u为 s1vvy Λª#
°pt ot为 t1szx Λª# °pt o u为 s1vs| Λª#
°pt ∀免疫亲合柱 t}©¯¤× ¶¨·µ °柱 k∂ ¬¦¤°公司 lo
免疫亲合柱 u}∞≥2∞÷× ≤×× ƒ×÷ kµ2
¬²³«¤µ° «²± 公¨司 l∀液相色谱系统 }• ¤·¨µ¶yss
泵 o• ¤·¨µ¶uwzx多波长荧光检测器 ∀柱后衍生系
统 }• ¤·¨µ¶xst泵 o• ¤·¨µ¶柱后反应器 ∀
2 方法
211 色谱条件 色谱柱 t}¬≤«µ²¶³«¨ µtss °2t{¨
kx Λ°lo色谱柱 u}³«¨ ±²° ±¨ ¬¨∏±¤≤t{ kw1y °° ≅
uxs °°ox Λ°lo色谱柱 v} ³«¨ ±²° ±¨ ¬¨∏±¤°«¨ ±2
¼¯ 2 ¬¨¼¯ kw1y °° ≅ uxs °°ox Λ°l~流动相乙腈 2甲
醇 2水 ktΒtΒwl~流速 t1s °# °¬±pt ~柱温 ux ε ~衍
生柱温 ws ε ~衍生剂流速 s1v °# °¬±pt ~荧光检
测器波长 Κ¨¬ vyx ±°o发射波长 Κ¨° wxs ±°~进样量
us Λ∀
212 溶液的配制 黄曲霉毒素混标溶液的配制 }吸
取 s1x °黄曲霉毒素混标对照品溶液 o定容于 ts
°量瓶中作为储备液 ∀吸取储备液 t °定容于
ux °量瓶中 o即得黄曲霉毒素稀释液 ∀
衍生剂的配制 }称取 xs °ª过溴化溴化吡啶于
小烧杯中 o用 t °甲醇溶解 o量取 t sss °水 o用
少量的水将甲醇溶解的过溴化溴化吡啶溶液转移至
试剂瓶中 o少量多次洗涤 o全部转移后获得 s1sx °ª
# °pt的过溴化溴化吡啶水溶液 ∀将此水溶液超
声后过滤 ∀衍生剂需每日新鲜配制 ∀
213 免疫亲合柱净化 精密吸取黄曲霉毒素稀释
液于蒸发皿中 o置于 ws ε 水浴锅上 o氮气吹 o使溶液
浓缩至 u ∗ v °∀在此浓缩液中添加 txh ׺¨¨ ±2
us水溶液 o混合均匀 o用 ts °注射器吸取上述溶
液以 t滴 r¶的速度通过免疫亲合柱 o再用 ts ∗ tx
°水以 t ∗ u滴 r¶的速度通过免疫亲合柱 o洗涤完
后 o让空气进入免疫亲合柱中 o将水全部挤出柱子 o
最后添加甲醇洗脱黄曲霉毒素 o收集并定容于 t °
量瓶中 o即得 ∀
3 结果
311 ∂ ¬¦¤°公司免疫亲合柱载样量实验 为了考
察该免疫亲合柱对黄曲霉毒素吸附能力的大小 o对
其载样量进行了研究 ∀本实验在免疫亲合柱上添加
了 u个水平的混标溶液 o水平 t}总黄曲霉毒素的量
为 ux1w{ ±ªo其中黄曲霉毒素
t o
u ot ou的量分
别为 |1you1{{otsov ±ª∀水平 u}总黄曲霉毒素的
量为 yv1z ±ªo其中黄曲霉毒素
t o
u ot ou的量分
别为 uwoz1uouxoz1x ±ª∀即相当于进行样品测定时
每克样品含总黄曲霉毒素 ux1w{ ±ª和 yv1z ±ª∀精
密吸取按 213项中方法制备的样品溶液 us Λo注
入高效液相色谱仪 ∀每个水平做 u个实验 o实验结
果见表 t∀
312 不同免疫亲合柱载样量实验 为了考察不同
免疫亲合柱对黄曲霉毒素吸附能力的差异 o在 u种
免疫亲合柱上分别添加了 u个水平的混标溶液 o水
平 t}总黄曲霉毒素的量为 ts1{yw ±ªo其中黄曲霉
#wywt#
第 vt卷第 tz期
ussy年 |月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφΧηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vto¶¶∏¨ tz
≥ ³¨·¨°¥¨ µoussy
表 t ∂ ¬¦¤°公司免疫亲合柱载样量实验 kcξ ? σ, ν ul h
水平 黄曲霉毒素
t 黄曲霉毒素
u 黄曲霉毒素 t 黄曲霉毒素 u
t tsxqt ? zqz {|q| ? vqx ttxqx ? wqu |sq{ ? wqz
u zvqu ? vqu {xqv ? yqy tsuqx ? sqz |tq| ? wqu
毒素
t o
u ot ou的量分别为 v1|{wot1vwwow1vo
t1uvy ±ª∀水平 u}总黄曲霉毒素的量为 uz1ty ±ªo
其中黄曲霉毒素
t o
u ot ou的量分别为 |1|yo
v1vyots1zxov1s| ±ª∀即相当于进行样品测定时每
克样品含总黄曲霉毒素 ts1{yw ±ª和 uz1ty ±ª∀精
密吸取 213项中方法制备的样品溶液 us Λo注入
高效液相色谱仪 ∀每个水平做 u个实验 o实验结果
见表 u∀
表 u 不同免疫亲合柱载样量实验 kcξ ? σ, ν ul h
免疫柱 水平 黄曲霉毒素
t 黄曲霉毒素
u 黄曲霉毒素 t 黄曲霉毒素 u
t t |sqs ? sqz tsvqz ? sqy |tqz ? uqx {xqt ? tqs
u zvqu ? tqz {xqv ? wqs tsuqx ? sqx |tq| ? uqz
u t |uqz ? sqv ts|qy ? uqz {xqz ? sqt |uq| ? sqx
u z{qs ? vqs {{qw ? tq| |uqu ? vqy |zqw ? sqz
313 不同色谱柱平均峰面积比较 按 211项所
规定的色谱条件吸取 212项中黄曲霉毒素稀释液
us Λo注入高效液相色谱仪 o重复 v次 o结果见表
v∀
表 v 不同色谱柱平均峰面积比较 kν vl
色谱柱
黄曲霉毒素
t 黄曲霉毒素
u 黄曲霉毒素 t 黄曲霉毒素 u
平均峰面积 ≥⁄rh 平均峰面积 ≥⁄rh 平均峰面积 ≥⁄rh 平均峰面积 ≥⁄rh
t ux |tt tqx vx {v{ squ z {uu squ | xyu squ
u uy {xy sqx vy vxt sqz z wtt vqt | zz| sqv
v uy |ws tqu vx {z| tqy z tzx tq| | {xu tqs
314 不同色谱柱保留时间比较 按 211项所规定
的色谱条件吸取 212项中黄曲霉毒素稀释液 us
Λo注入高效液相色谱仪 o重复 v次 o结果见表 w∀
表 w 不同色谱柱出峰时间比较 kν vl °¬±
色谱柱
黄曲霉
毒素
t
黄曲霉
毒素
u
黄曲霉
毒素 t
黄曲霉
毒素 u
t txqs t|qz utqy u{q{
u utqx u{qy vsq| wtqy
v vwqy xsqv wzqw y|qy
4 讨论
411 依据欧盟对花生中黄曲霉毒素的限量规定 o总
黄曲霉毒素不超过 w Λª# ®ªpt o其中黄曲霉毒素
t
不超过 u Λª# ®ªpt o我国原外经贸部 /药用植物及
制剂进出口绿色行业标准 0 k• u 2usstl中规定进
出口药用植物及制剂中黄曲霉毒素
t不得超过 x
Λª# ®ªpt o从表 t和表 u可以看出对于中药中黄曲
霉毒素的检测 ou种免疫柱均有足够的载样量 o而且
免疫亲合柱处理后检测结果差异较小 o说明 u种免
疫亲合柱均适用 ∀但由于免疫亲合柱 u直径略大 o
洗脱时液体流速较快 o应增加洗脱液的体积 o经实验
证明用甲醇洗脱时接收体积增加至 t1x °时 o黄曲
霉毒素可被全部洗脱 ∀
412 根据表 v和表 wo无论是色谱峰的分辨率或是
峰面积的重复性均可以看出 v种色谱柱都适用于
≤净化 !柱后溴衍生化高效液相色谱法检测中药
中黄曲霉毒素 o但色谱柱 v ©¯¤·²¬¬±
u和 ©¯¤·²¬¬±
t的顺序有所变化 o依据峰面积认为是顺序发生了
变化 o由于未购到单一的对照品无法进一步验证 ∀
另外 o在早期实验中还曾使用过
÷ ≥
2≤t{
色谱柱 o对于该方法也同样适用 ∀还可根据中药材
化学成分干扰情况的不同 o适当改变流动相的配比 o
缩短保留时间并保持足够的分辨率 ∀
≈参考文献
≈t 张雪辉 o陈建民 q免疫亲合柱净化 °≤柱后衍生化方法检测
中药中黄曲霉毒素 ≈ q中国中药杂志 oussxovskvl}t{uq
≈u 中国药典 ≈≥ q一部 q ussx}附录 ½ ¬ q
≈责任编辑 张宁宁
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第 vt卷第 tz期
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