全 文 :交互移动窗口因子方法在桂枝茯苓配伍前后
挥发油组分及溶出率变化研究中的应用
蔡文选,王贤亲,于晓敏,卫 涛,李艳霞,向 铮
(温州医学院 药学院,浙江 温州 325035)
[摘要] 目的:利用气相色谱质谱(GCMS)对药对桂枝茯苓及单味药桂枝的挥发油进行分析。方法:采用
色谱柱HP5MS(250μm×30m,025μm)分离,起始温度60℃,维持2min,以4℃·min-1升至130℃,再以1℃
·min-1升至160℃,维持2min,再以4℃·min-1升至240℃,维持20min,分流比1∶30,进样量1μL,结合新近提
出的化学计量学分辨方法交互移动窗口因子分析方法及 Kovats保留指数对两者挥发性成分中的共有组分、差异
组分及各成分溶出率进行比较分析。结果:分别定性了42和46种组分。结论:研究显示两者挥发性成分种类基
本保持不变,但各成分溶出率均有显著变化:少部分组分溶出率明显增加,大部分组分溶出率显著下降,甚至有个
别组分消失。研究表明药对桂枝茯苓的药效物质基础不仅是单味药有效成分的简单加和,还应考虑单味药在配
伍过程中发生的物理化学变化对药效的影响,具有较强的临床参考价值。
[关键词] 交互移动窗口因子分析法;Kovats保留指数;药对桂枝茯苓;气相色谱质谱联用;挥发油
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18205606
[收稿日期] 20080121
[通讯作者] 向铮,Email:xzh007@126.com,xiangzheng@
wzmc.net
配伍理论是中药复方的核心问题,药对是中医
临床上常用的、相对固定的2个单味药的配伍形式,
是复方的最小组成单位。药对着重阐述两药之间的
配伍关系,是复方的一种特殊形式[1],弄清构成药
对的单味药在配伍前后发生的物理化学变化,掌握
该药对产生临床疗效的药效物质基础,才能更准确
阐明中药复方的配伍机制,更深刻理解中药复方配
伍的思想精髓,并达到用现代医药理论来阐释“七
情”配伍理论。
桂枝茯苓源于张仲景的“伤寒方”,茯苓味甘
淡、性平,入心、肺、脾、肾经,味甘补土,健脾祛湿,
又淡能利窍,气味俱薄而升浮,可升津上行,又复
下降,可导浊下行[1]。桂枝,辛甘温热,主以通阳
化气[2],二者合用升降相反,则气化水行,共达相
反相成之用,临床用于脾胃阳虚水停中焦、心阳虚膀
胱气化不利水停下焦、肾阳虚水湿泛滥、妇科病。
《金匮要略心典》云:“桂枝得茯苓则不发表,而反行
水”。桂枝中挥发油为其主要药效成分[3],虽有相关
文献[45]报道过其挥发油的化学成分,但对桂枝与茯
苓合用后挥发性成分的含量和组成尚未见报道。
交互移动窗口因子分析法[6](alternativemov
ingwindowfactoranalysis,AMWFA)是多组分光谱相
关色谱法(MSCC)[7]和子窗口因子分析法(SFA)[8]
两者的结合和拓展。MSCC法的基本思想是:若2
个二维光谱色谱峰(簇)所含有的化学组分相关,那
么分别由这2个色谱峰(簇)的化学组分所构成的
光谱空间可以互相线性表示出来,据此可以判断2
个色谱峰(簇)在色谱流出区域是否存在共有组分。
SFA法的核心思想:从特征值为1或接近于1的特
征向量的色谱流出区域获得选择性信息,从而获取
相应的纯质谱或纯光谱。AMWFA法区别于SFA法
的特点在于[6,9]解析纯质谱过程中挖掘出了隐藏在
2个体系中的信息,这提供更多机会获取选择性信
息,因而AMWFA法可以获取2个体系存在的共有
组分的同时,还能最大程度的提取体系的选择性信
息,从而解析出对应的纯质谱。
作者采用 GCMS和新近提出的交互移动窗口
因子分析方法(AMWFA)并结合 Kovats保留指数
(KI)对比法检测解析药对桂枝茯苓的挥发性成分,
并比较了单味药与药对的挥发性成分,讨论了单味
药配伍后挥发性成分的组分数目和溶出率变化。
1 仪器与试剂
美国惠普公司 Aglient6890-5975BMSD型气
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相色谱仪质谱仪。茯苓、桂枝均购自温州市仁济堂
药店,经温州医学院中药教研室鉴定,分别为茯苓
Poriacocos(PC)的干燥茎、桂枝 Cinnamomumcasia
Presl(CCP)的干燥嫩枝。烷烃对照品(直链烷烃购
C7~C20)自SigmaAldrich(上海)贸易有限公司。
色谱柱HP-5MS(250μm×30m,025μm)。
程序升温:起始温度60℃,维持2min,以4℃·
min-1升至130℃,再以1℃·min-1升至 160℃,
维持2min,再以4℃·min-1升至240℃,维持20
min。载气He;进口温度250℃,分流比1∶30,进样
量1μL。质谱条件:EI源电子能量70eV,离子源温
度230℃。电离电压1428kV,扫描范围 m/z30~
500;溶剂延迟5min。
挥发油的提取:称取干燥的茯苓和桂枝各10g,
混合,按《中国药典》2005年版挥发油提取法提取[10]。
另称取干燥桂枝10g,按照上法相同条件提取。
数据分析:在 PentiumIV28Hz(Intel)计算机
上进行,程序用Metlab65编写,部分计算程序由中
南大学中药现代化所提供,所分辨的质谱在 NIST05
标准质谱库中检索。
2 结果与讨论
2.1 挥发油化学成分的定性及定量分析 通过优
化色谱柱及设定程序升温等条件,分别得到了桂枝
和药对桂枝茯苓的GCMS总离子流图(TICs,图1
A)。其中大部分色谱峰都达到了基线分离,但也
有部分色谱峰发生重叠现象。以下以保留时间为
2730~2780min的峰族为例简要说明此方法的解
析全过程,详细过程可参阅文献[6,9],该区域的桂
枝和桂枝茯苓的总离子流图见图2,这是典型的重
叠峰。NIST05谱库搜索的匹配度分别为 80%和
50%,难以确定物质的成分,为此采用AMWFA法解
析该峰族:首先考察2个峰族体系的组分数,图3为
组分秩评估图,交互验证显示当组分数为2时,残余
标准偏差最小,故二者均为两组分体系;然后利用
MSCC考察两者是否存在共有组分,图4为共有秩
分析的结果,图中前2个F值接近零,而第3个值迅
速增大,据此可推断二者体系包含 2个共有组分。
图5的质谱自相关曲线显示2个平台[分别是 C1
(2740~2755),C2(2667~2772)],且相似度
几乎为1。可从这2个平台中的任意一点分别提取
共有组分的纯质谱,即得组分1或2的纯质谱。解
析出的质谱与 NIST05库中的标准质谱比较(见图
6),匹配度分别提高到 98%和 95%。采用 GCMS
与交互移动窗口因子分析法对整个谱图进行解析,
由于重叠峰解析后获得纯质谱,定性的准确性也大
大提高。
A.流出时间5~93min;B.流出时间5~20min;
C.流出时间20~40min;D.流出时间40~93min
图1 实线和虚线分别代表桂枝和
桂枝茯苓的总离子流图
图2 桂枝(A)和桂枝茯苓(B)在流出时间
2730~2780min总离子流图
图3 桂枝(A)和桂枝茯苓(B)秩图
图4 共有组分秩图
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图5 质谱自相关曲线
2.2 挥发油化学成分的质谱库与保留指数联合定
性 总离子流图在20~40min内的物质大部分都
是异构体,由于质谱不能分辨构象异构等异构体,为
样品中异构体的定性带来了很大的干扰,造成定性
不准。Kovats保留指数[11]是化学物质在相应类型
分离柱中对应正烷烃的一种比较稳定的性质。
只要用于分离的色谱柱性质相同,气相色谱条
件相近,同种组分在不同仪器上所计算出来的 KI
值通常为常数。因此,同时考虑色谱峰的质谱匹配
度和 KI匹配度可大大提高鉴定结果的准确性。
bicyclo[3.1.1]hept2ene,2,6dimethyl6(4methyl3pentenyl)
图6 分辨后的质谱与NIST标准质谱
用线性升温公式计算各个组分的KI值:
KI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)
式中,tx,tn,tn+1分别为被分析的组分和碳原子
数处于n和n+1之间的正烷烃(tn<tx<tn+1)的流
出峰保留时间(min)。
质谱库与色谱保留指数联合化学结构鉴定程序
为:选取质谱匹配度高于90%的可能分子,分别检
索其相应文献KIs值,以质谱匹配度和 KI值匹配度
最高的化学结构为最佳鉴定结果。经质谱和保留指
数联合定性鉴定结果见表1。
2.3 配伍前后挥发油溶出率的变化规律 为了便
于观察各组分的溶出率的变化,将桂枝及桂枝茯苓
的GCMS的总离子流图(图1)按色谱流出时间分
为5~20min,20~40min,40~90min3个区域。图
B显示5~20min的流出时间内,组分数目未见变
化,但配伍后药对的大部分组分溶出率增加,个别组
分略有下降。从积分面积上可知,benzaldehyde,3
phenyl2propenal,cinnamaldehyde,acetophenone等
组分溶出率增加近3倍,考察溶出率增加的组分结
构,发现其苯环上的取代基团均与苯环构成共轭体
系,而取代基团未共轭的取代基团溶出率则略有下
降,如 benzenepropanal,1,3dimethyl1cyclohexene。
观察图1C,组分种类无变化,含量上药对中除组分
copaene略有增加外,其余成分溶出率均显著下降:
大部分溶出率下降了2~3倍,该总离子流出时
间内分子结构大部分类似为同分异构体,下降幅度
基本相同。但也存在个别物质下降幅度显著,如3
(2methoxyphenyl)2propenal,该物质为不饱和醛,
性质较为活泼,配伍后加热过程中,部分可能发生了
物理化学变化而使浓度显著下降。图1D显示的是
40~90min流出时间内二者成分溶出率和组份数变
化情况,此时间段中,组分数较少且含量甚微,在仅
有的几个组分中,药对桂枝茯苓挥发油中2phenyl
ethylesterbenzoicacid、nhexadecanoicacid消失,为
了进一步探索组分消失的原因,在与单味药和药对
同样的检测色谱条件下,同样提取10g单味药茯苓
的挥发性组分,茯苓属于菌科,挥发性组分很少且含
量甚微,但有趣的是同样的流出时间,茯苓的 GC
MS总离子流图中也出现了 nhexadecanoicacid峰
(图7),尽管桂枝和茯苓都含有该组分,但药对桂
枝茯苓该组分不仅没有叠加,反而消失,这个现象
提示该组分在药对挥发油的提取过程中可能发生了
某种物理化学变化,以致该组分峰完全消失。
图7 a,b,c分别代表茯苓、桂枝、桂枝-茯苓总离子流图
通过对单味桂枝和药对桂枝茯苓挥发油的对
比发现,发现都包含4种共同的物质:分别是3phe
nyl2propenal,cinnamaldehyde,3(2methoxyphe
nyl)2propenal,2propenoicacid3phenylmethyl,4
种物质总含量分别占其挥发油总的体积比9086%
和9675%。其中:前二者的溶出率显著增加,后二
者的溶出率却显著下降。3phenyl2propenal,cin
namaldehyde为桂枝的主要药效活性物质[3],与茯苓
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表1 桂枝和桂枝茯苓的主要挥发油成分
名称/分子式
CCP
SQ(×105)/RC
CCPPC
SQ(×105)/RC
KIi
/KTS
benzaldehyde/C7H6O 1106/0102 2947/0207 980/982
acetophenone/C8H8O 244/0022 1035/0073 1069/1072
ethanone,1(3methylphenyl)/C9H10O 020/0018 276/0019 1142/-
3cyclohexene1methanol,α,α,4trimethyl/C10H18O 241/0022 101/0007 1180/1185
2propenal,3phenyl/C9H8O 9880/0909 31904/2238 1189/-
benzenepropanol/C9H12O 358/0033 1503/0105 1200/1200
benzaldehyde,2methoxy/C8H8O2 556/0051 874/0061 1211/-
cinnamaldehyde,(E)/C9H8O 948165/8728 1336632/9378 1289/1283
2methoxyphenylacetone/C10H12O2 637/0059 486/0034 1292/-
copaene/C15H24 1848/0170 2617/0184 1377/1379
benzene,[3(methoxymethoxy)1propenyl]/C11H14O2 290/0027 134/0009 1381/-
2propenoicacid3phenylmethyl/C10H10O2 11715/1078 6880/0483 1397/-
cadala1(10),3,8triene/C15H22 3936/0362 1358/0095 1420/-
caryophylene/C15H24 1580/0145 1171/0082 1422/1420
naphthalene,1,6dimethyl4(1methylethyl)/C15H18 1735/0160 460/0032 1430/1423
bicyclo[3.1.1]hept2ene,2,6dimethyl6(4methyl3pentenyl)/C15H24 5911/0544 2569/0180 1455/1456
αmuurolene/C15H24 1373/0126 610/0043 1460/-
2Hisoindole,4,5,6,7tetramethyl/C12H15N 474/0044 248/0017 1471/-
aromadendrene/C15H24 1714/0158 1168/0082 1476/1474
naphthalene,1,2,4a,5,6,8ahexahydro4,7dimethyl1(1methylethyl) 691/0064 279/0020 1479/1479
(1α,4aα,8aα)/C15H24
benzene,1(1,5dimethyl4hexenyl)4methyl/C15H22 3529/0325 1502/0105 1483/1483
naphthalene,1,2,4a,5,6,8ahexahydro4,7dimethyl1(1methylethyl) 2972/0274 1274/0089 1485/1485
(1α,4aα,8aα)/C15H24
naphthalene,1,2,4a,5,6,8ahexahydro4,7dimethyl1(1methylethyl) 3567/0328 1357/0095 1490/1490
[1R(1α,4aα,8aα)]/C15H24
1,3cyclohexadiene,5(1,5dimethyl4hexenyl)2methyl[S(R,S)]/C15H24 482/0044 317/0022 1495/1493
βguaiene/C15H24 1119/0103 377/0026 1500/1499
naphthalene,1,2,3,5,6,7,8,8aoctahydro1,8adimethyl7(1methylethenyl) 1379/0127 519/0036 1504/1503
[1R(1α,7α,8aα)]/C15H24
naphthalene,1,2,3,5,6,8ahexahydro4,7dimethyl1(1methylethyl)(1Scis)/C15H24 7338/0675 3007/0211 1505/1506
cyclohexene,1methyl4(5methyl1methylene4hexenyl)(S)/C15H24 4160/0383 1583/0111 1507/1507
2propenal,3(2methoxyphenyl)/C10H10O2 17295/1592 3533/0248 1512/1512
naphthalene,1,2,3,4,4a,5,6,8aoctahydro7methyl4methylene1(1methylethyl) 2890/0266 1446/0101 1514/1513
(1α,4aα,8aα)/C15H24
naphthalene,1,2,3,4,4a,7hexahydro1,6dimethyl4(1methylethyl)/C15H24 1534/0141 534/0037 1530/1528
1Hcycloprop[e]azuLen7ol,decahydro1,1,7trimethyl4methylene 2827/0260 1513/0106 1532/-
[1ar(1aα,4aα,7α,7aβ,7bα)]/C15H24O
naphthalene,1,2,4a,5,6,8ahexahydro4,7dimethyl1(1methylethyl)/C15H24 2547/0234 625/0044 1533/1530
naphthalene,1,2,3,4,4a,5,6,8aoctahydro7methyl4methylene1(1methylethyl) 1308/0120 184/0013 1537/1538
(1α,4aα,8aα)/C15H24
caryophyleneoxide/C15H24O 476/0044 ND 1570/1571
2propenoicacid,3(2hydroxyphenyl)/C9H8O3 313/0029 567/0040 1577/-
1Hcycloprop[e]azuLene,decahydro1,1,7trimethyl4methylene/C15H24 1666/0153 289/0020 1587/1589
1Hcycloprop[e]azuLene,decahydro1,1,7trimethyl4methylene 477/0044 138/0010 1590/1593
[1aR(1aα,4aβ,7α,7aβ,7bα)]/C15H24
1H3a,7methanoazuLene,2,3,4,7,8,8ahexahydro3,6,8,8tetramethyl 1493/0137 438/0031 1606/1604
[3R(3α,3aα,7α,8aα)]/C15H24
tetradecanal/C14H28O 2513/0231 426/0030 1609/1609
epicedrol/C15H26O 3593/0331 1605/0113 1613/1611
3cyclohexen1ol,1(1,5dimethyl4hexenyl)4methyl/C15H26O 477/0044 ND 1669/1671
αbisabolol/C15H26O 5370/0494 1875/0132 1682/1684
benzoicacid,2phenylethylester/C15H14O2 432/0040 ND 1833/-
2ethyl2phenyl1,3dioxan4,6dion/C12H12O4 936/0086 567/0040 1978/-
nhexadecanoicacid/C16H32O2 1364/0126 ND 1988/1986
注:RC为相对含量(%);SQ为修正面积;KIi为保留指数;KIs为文献保留指数;ND未检测出
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配伍后溶出率显著增加,提示茯苓与桂枝配伍后对
3phenyl2propenal,cinnamaldehyde这 2种成分有
助溶作用,但是对 3(2methoxyphenyl)2propenal,
2propenoicacid3phenylmethyl可能有减溶作用。
3 结论
用GCMS测定桂枝、药对桂枝茯苓的挥发性
成分,并利用新近提出的交互移动窗口因子分析方
法对两者色谱峰进行分辨比对,分别定性了 42和
46种组分。研究了配伍前后的各组分溶出率和组
分数目的变化,研究表明配伍过程中,虽然没有发现
新组分产生,但绝大部分物质的溶出率变化显著:少
数组分配伍后溶出率显著增加,但大部分溶出率明
显下降,甚至个别组分消失。这反应了2个单味药
配伍形成药对,合煎时发生了化学反应与物理变化,
进一步证明药对桂枝茯苓不是单味药的简单加和,
它与单味药在成分量与质方面均存在差别,从而通
过药对的使用扩大了单味药的适应症。
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(SchoolofPharmacy,WenzhouMedicalColege,Wenzhou325035,China)
[Abstract] Gaschromatography/massspectrometry,chemometricresolutionmethodAlternativemovingwindowfactoranalysis
thatwereproposedrecentlyandtheKovatsretentionindexwereusedtoanalyzetheessentialcomponentsofherbalpairCinnamomum
cassiaPreslandPoriacocos(CCPPC)andcomparethemwiththoseofsingleherbalCinnamomumcassiaPresl(CCP).46and42es
sentialcomponentsinessentialoilofCCPandCCPPChavebeenidentifiedindividualyResultsshowsthatthenumberofessential
componentsofCCPandCCPPCwerealmostthesame,butextractiveratioesofthemhavechangedsignificantly,someofthemwerein
creasedobviously,mostofthemweredeclinednotablyinsteadandevenseveralingredientsofCCPPCweredisappearedduetoCCPPC
'sinteractionprobaloly.ThemainpharmacodynamicingredientsofCCPPC,3phenyl2propenalandCinnamaldehydewereobviously
highercontentsthanthatofsingleCCP.Itsuggestedthatthereexistcertaininteractionsofthechemicalingredientsincompoundmedi
cineratherthantheirsumefectofsinglemedicines.Thereisaliterdiferenceinqualityandquantitybetweensinglemedicinesand
pairmedicines,sotheapplicationofpairmedieinescanexpandsinglemedicine'sadaptivediseaseandhasagoodclinicalreferenced
valuation.
[责任编辑 鲍 雷]
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