全 文 ：#研究论文#
不同栽培居群广藿香的种内遗传多样性研究
潘超美t 3 o李 薇t o贺 红t o邓旺秋u o李泰辉u o徐鸿华t
kt1 广州中医药大学 中药学院 o广东 广州 xtswsz ~u1 广东省微生物研究所 o广东 广州 xtsszsl
≈摘要  目的 }探讨广藿香不同栽培居群的遗传多样性和种内分化水平 o寻找有效地鉴定不同居群广藿香
⁄‘„指纹特征方法 ∀方法 }从 {s个随机引物中筛选出 tw个具较高多态性检测能力的引物 ∀用这 tw个随机引物对
x个栽培居群的广藿香进行了的分析 o对得出的结果应用 °²³Š¨ ±vu软件进行计算和聚类分析 ∀结果 }实验测出 {w
个位点 o其中单态位点 tz个 o占 us1uw h ~多态位点 yz个 o占 z|1zy h ∀分析结果表明 o同一种内不同栽培居群间存
在明显的遗传分化 ∀结论 }应用 • „°⁄选择特定引物对广藿香遗传多样性的分析及不同居群的鉴定是可行的 ∀
• „°⁄技术为广藿香遗传种质资源的鉴定和分类提供了新的途径 ∀
≈关键词  广藿香 ~居群 ~• „°⁄分析 ~遗传多样性
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyls|2szuv2sw
≈收稿日期  ussw2sw2tx
≈基金项目  广东省科技计划社会发展攻关项目k„vstsuststl
≈通讯作者  3 潘超美 oר¯ } ksuslvyx{xwwz o ∞2°¤¬¯}³¤±¦° ƒ
ª§¤¶1¤¦1¦±
广藿香 Πογοστεµον χαβλιν k…¯¤±¦²l …¨ ±·«1 是唇
形科刺蕊草属植物 o多年生草本 o全草药用 ∀其味
辛 !微温 o归脾 !胃 !肺三经 o具有芳香化浊 !开胃止
呕 !发表解暑的功能≈t  o是我国大宗常用道地中药及
外贸出口商品和著名的/十大广药0之一 ∀近年来对
不同栽培居群的研究发现 o广藿香各居群间的形态 !
解剖结构上明显存在着 w种不同的类型≈u2w  ∀挥发
油成分的研究也显示了广藿香可能出现了种内的分
化现象≈x2y  ∀广藿香的商品药材也因产地和品质的
不同分为石牌广藿香k牌香l !高要广藿香k肇香l !湛
江广藿香k湛香l和海南藿香k南香l≈z  ∀目前对广藿
香种质资源的研究及鉴定的手段还十分有限 ∀传统
常规的鉴定方法不能准确地反映各个不同居群间分
化的可能性和水平 ∀本研究的目的在于运用 • „°⁄
技术对广藿香种内的遗传多样性进行分析 o深入地
了解广藿香不同居群间的种内分化水平 o以期为广
藿香育种及其药材质量标准的制定提供理论依据 ∀
1 材料与方法
111 材料 试验材料取自广东和海南各个不同产
地k见表 tl ∀每个样品在产区随机选 us个单株 o每
个植株顶芽上摘取幼嫩的叶片 u片 o洗净 o经硅胶干
燥后提取总 ⁄‘„ ∀
表 t 不同居群广藿香的主要形态特征
编号 样品来源 形 态 特 征
t 广州萝岗黄登k牌香l 植株高 vs ∗ ys ¦° o曲折 o密被
短毛茸 ∀长宽比为 t1uv o厚纸质 o
叶面皱缩 ∀气清香
u 广州萝岗黄登组培苗 植株高 {s ∗ tss ¦° o毛茸稍稀
疏 ∀长宽比为 t1x{ o薄纸质 o气香
v 肇庆高要莲塘k肇香l 植株高 {s ∗ tss ¦° o毛茸较密
集 ∀长宽比为 t1v{ o薄纸质 o气香
w 湛江吴川长歧k湛香l 高 {s ∗ tss ¦° o稍扭曲 o毛茸细
长而稀疏 ∀长宽比为 t1zx o薄纸
质 o气香
x 海南万宁县k南香l 植株高 tss ¦° o分枝多 o多弯
曲 o毛茸较稀疏 ∀长宽比为 t1|| o
薄纸质 o叶面平坦 ∀气香浓郁
112 ⁄‘„ 的提取与检测 ⁄‘„ 提取采用 ≤ׄ…
法≈{  o并稍作适当改进 ∀取经硅胶干燥的叶片组织
s1u ∗ s1x ªo在液氮中研磨成糊状或粉末状 ~取适量
粉末转入 t1x °∞°管中 o管内先加入 zxs ˏyx ε
的 u ≅ ≤ׄ…提取液 o振荡均匀 oyx ε 温浴 wx °¬±~
ts sss ≅ γ 离心 ts °¬±~取上清至新管 o加入等体积
的氯仿2异戊醇kuwΒtl 振荡均匀 ots sss ≅ γ 离心 ts
°¬±~取上清液 o再重复抽提 u次 ~取上清液 o加入 tru
ktrxl体积的 x °²¯#pt的 ‘¤≤¯ 溶液 ourv体积的冰
冷异丙醇 op us ε 放置 vs °¬±以上 ~ts sss ≅ γ 离心
ts °¬±o去掉上清液 o收集沉淀 ~用 zs h的乙醇洗涤
⁄‘„沉淀 ∀xs ε 烘干 o加 tss ˏ×∞缓冲液溶解 ∀
用 s1{ h琼脂糖凝胶电泳检测 ∀
113 • „°⁄2°≤• k⁄‘„l扩增 扩增体系k条件l为每
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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ux ˏ反应体积含 u1x ˏts ≅ °≤• 缓冲液 ou1s °°²¯
#pt ªun os1u °°²¯#pt的 §‘×°¶k上海生工公司l o
tx ±ª寡聚核苷酸引物k’³¨µ²±公司l ots ±ª模板
⁄‘„ ot1x ˜ פ´ ⁄‘„聚合酶k上海生工公司l ∀每一
反应均设阴性对照 ∀扩增程序为 |w ε 预变性 x
°¬±~wx个循环 o|w ε 变性 vs ¶ovy ε 退火 wx ¶ozu ε
延伸 u °¬±ozu ε 最后延伸 ts °¬±∀扩增后 o取 y ˏ
°≤• 产物于 t1x h琼脂糖凝胶上电泳 o∞…染色 o紫外
成像系统观察并照相 ∀
114 数据处理与分析统计 选取扩增结果稳定性
较好的 tw个引物在 x个样品中的扩增图谱 o同一位
点上有 ⁄‘„带的记为/ t0 o无带的记为/ s0 o形成原
始数据 ∀数据采用软件 °²³Š¨ ±¨ ∂1 t1vt≈| 计算
‘¨¬≈ts 相似系数及分子距离 o并选用 ˜°Š„聚类方
法在分子距离的基础上自动生成聚类图 ∀
2 结果
211 随机引物的筛选与 • „°⁄扩增图谱的多态性
分析 本试验选用 ’³¨µ²± 公司生产的编号为
’°„st ∗ us o’°…st ∗ us o’°⁄st ∗ us o’°Šst ∗ us组
的随机引物共 {s个 o对样品进行扩增 ∀从中反复筛
选出稳定性好 !条带清晰的引物共 tw个 ∀引物编号
及序列见表 u ∀
表 u tw个随机引物的碱基序列及扩增结果
编号 引物 序列 xχ2vχ 总位点 多态性位点
t ’°„sw „„×≤ŠŠŠ≤׊ x v
u ’°„sz Š„„„≤ŠŠŠ×Š x w
v ’°…sw ŠŠ„≤׊Š„Š× y v
w ’°…ts ≤׊≤׊ŠŠ„≤ y x
x ’°…tt Š×„Š„≤≤≤Š× w v
y ’°…t{ ≤≤„≤„Š≤„Š× y x
z ’°⁄su ŠŠ„≤≤≤„„≤≤ y x
{ ’°⁄sv Š×≤Š≤≤Š×≤„ ts |
| ’°⁄sz ×׊Š≤„≤ŠŠŠ x x
ts ’°⁄s{ Š×Š×Š≤≤≤≤„ w v
tt ’°⁄us „≤≤≤ŠŠ×≤„≤ { y
tu ’°Šsv Š„Š≤≤≤×≤≤„ y x
tv ’°Šts „ŠŠŠ≤≤Š×≤× x w
tw ’°Št| Š×≤„ŠŠŠ≤„„ { z
合计 {w yz
分析所选 tw个随机引物对 x个不同居群的广
藿香总 ⁄‘„ 的 • „°⁄扩增图谱 o共扩出 {w条谱带
k位点l o分子质量为 txs ∗ t xss ¥³∀不同引物扩增
条带数 !大小 !强弱不同 o强带 u ∗ x条 o平均每个样
品扩增出谱带k位点l的数目为 w ∗ ts个 ∀具多态性
的片断有 yz条 o多态率为 z|1zy h o扩增结果说明来
自于不同地区的广藿香居群 ⁄‘„ 指纹图谱显示出
良好的多态性水平k见图 t oul ∀
图 t 引物 ’°⁄us o ’°Šsv o ’°Št|
k从左到右l扩增的 • „°⁄谱带
t1牌香 ~u1 组培苗 ~v1 肇香 ~w1 湛香 ~x1 南香k图 u同l
图 u 引物 ’°⁄su o’°⁄sz o’°⁄s{
k从左到右l扩增的 • „°⁄谱带
212 遗传相似性及聚类分析 综合 tw个引物对 x
个居群的 ⁄‘„扩增结果 o采用软件 °²³Š¨ ±¨ ∂1 t1vt
分析得到 x个不同广藿香居群之间的相似性系数和
遗传距离k见表 vl ∀选用 ˜°Š„ 聚类方法在分子
距离的基础上进行聚类分析 o得到树状图k见图 vl ∀
表 v 广藿香居群间的遗传距离与相似性
遗传距离 遗传一致性牌香 组培苗 肇香 湛香 南香
牌香 p s1xvx z s1yt| s s1ysz t s1yvt s
组培苗 s1yuw u p s1v|u | s1{s| x s1xss s
肇香 s1wz| y s1|vw v p s1xx| x s1yz{ y
湛香 s1w|| s s1utt v s1x{s z p s1yyy z
南香 s1wys x s1y|v t s1v{z { s1wsx x p
注 }对角线上方为相似性 o下方为遗传距离
图 v 广藿香 x个居群的聚类图
由表 v 可知 o各不同居群间相似系数在
s1v|u | ∗ s1{s| x o|s h集中在 s1xss以上 o总体相似
程度较高 ∀从植物遗传学分化的角度来看 o供试材
料均属于唇形科刺蕊草属 Πογοστεµον 同 t个种 o亲
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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缘关系十分接近 o其中肇香与牌香相似系数最小为
s1v|u | o二者 • „°⁄图谱分析也显示较大差异 o说明
u居群间亲缘关系较其他居群要远 o种内遗传发生
了较大的分化 ∀相似性系数最大的 u居群是组培苗
与湛香ks1{s| xl o分子遗传距离最小ks1utt vl o而
与其他居群的遗传距离较大 o这表明组培苗离体繁
殖时的外植体材料k原始实验记录丢失l很可能是湛
香 ∀从聚类树状图来看 o广藿香的 x个居群共聚为
u大类 o一类为组培苗和湛香 o另一类是牌香 !肇香
和南香 ∀
3 讨论
综合上述遗传多样性的参数来看 o各居群内的
基因多态性程度和遗传变异水平都较高 ∀目前普遍
认为广藿香不同居群的形态差异主要是地理环境因
素造成 ∀作者前期的工作发现 o肇香 !南香和湛香 v
个居群与牌香的形态特征与解剖结构存在着较大的
差异≈u ov  ∀如在叶片的特征上 o前者叶面平展 o后者
叶面较皱缩 ∀再者 o广藿香引种到中国栽培后 o一直
未能开花结实 o传统的种植上都是用无性扦插繁殖 o
这样造成了同一地域内基因流动机率较低 o居群间
遗传相似性相对较高 ∀但由于各地的生产管理水平
不相一致 o导致了群体间个体的变异 ∀除了形态上
的表现外 o植物体内的化学成分也发生了变异 o不同
居群挥发油含量及其组成成分的分析研究证实了这
一点≈y oz  ∀通过对电泳结果的观察 o在排除 ⁄‘„ 不
纯和不同个体 ⁄‘„ 浓度差别等实验技术误差后 ox
个不同居群的扩增指纹图谱差异较大 o这是由于广
藿香仅以无性生殖进行繁殖 o一个居群实为一个无
性系 o个体间遗传特性一致 o居群间则出现了较大的
差异 o可以说无性生殖加速了广藿香的种内分化 o加
上各居群均属于栽培类型 o在栽培过程中 o由于不同
地区的土壤 !气候等外界条件的差异 o也加速了广藿
香的种内分化 ∀组培苗在经过多代的继代培养后 o
生长发育过程中发生的遗传分化可能性更大 o这从
组培苗与其他居群的遗传相似性及其栽培过程的生
长优势反映出来 ∀此外 o通常认为居群间隔离程度
大 o或生境条件差别越大 o可导致不同居群间遗传结
构的显著差异≈ts  ∀但聚类结果来看 o肇香和南香 u
居群虽地理距离远 o但二者遗传相似性很高 o居群间
分化并不显著 ∀因此在今后广藿香的遗传育种中 o
应注意选择居群内单株的遗传差异从而选育新品种
与类型 o这将比选择优良群体更加有效 ∀
应用 • „°⁄选择随机引物对广藿香遗传多样性
的分析及不同居群的鉴定是可行的 ∀ • „°⁄技术为
广藿香遗传种质资源的鉴定和分类提供了新的途
径 ∀但 • „°⁄分析易出现假阳性现象 o因此采用
• „°⁄进行分子鉴别时一定要设阴性对照 o而且需
要进行重复实验 ∀
≈参考文献 
≈t  江苏新医学院 q中药大辞典 q上册 q上海 }上海科学技术出版
社 ot|{y quzts q
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讨 q华南师范大学学报 oussv ot }{u q
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版社 ot||w qtv q
≈{  ⁄²¼¯¨q ⁄‘„ ³µ²·²¦²¯¶©²µ³¯¤±·¶2≤ׄ… ·²·¤¯ ⁄‘„ ¬¶²¯¤·¬²±qŒ±}
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Νατ ot||s otvy }tsx q
Στυδψ ον ιντρασπεχιφιχ γενετιχ διϖερσιτψιν διφφερεντ πλαντ
ποπυλατιονσ οφ Πογοστεµον χαβλι
°„‘≤«¤²2° ¬¨t oŒ • ¬¨t o ‹∞ ‹²±ªt o⁄∞‘Š • ¤±ª2 ¬´∏u oŒ פ¬2«∏¬u o ÷˜ ‹²±ª2«∏¤t
(t . Χολλεγε οφ Πηαρµαχψ, Γυανγζηου Υνιϖερσιτψ οφ Τραδιτιοναλ Χηινεσε Μεδιχινε , Γυανγζηου xtswsz , Χηινα ;
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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u . Γυανγδονγ Ινστιτυτε οφ Μιχροβιολογψ, Γυανγζηου xtsszs , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦³²¯¼°²µ³«¬¶° ¤±§¬±·µ¤¶³¨¦¬©¬¦ª¨ ±¨ ·¬¦§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ²©§¬©©¨µ¨±·³²³∏¯¤·¬²±¶²© Πογοστε2
µον χαβλιν , ¤±§©¬±§²∏··«¨ ©¨©¨¦·¬√¨° ·¨«²§·²§¬¶·¬±ª∏¬¶«⁄‘„ ©¬±ª¨µ³µ¬±·²©§¬©©¨µ¨±·³²³∏¯¤·¬²±¶²© Π. χαβλιν q Μετηοδ : ƒ¬√¨³¯¤±·³²³∏¯¤2
·¬²±¶²© Π. χαβλιν º µ¨¨ ¤±¤¯¼½¨ §¥¼ • „°⁄ °¤µ®¨µ¶q°²³Š¨ ± vu ¶²©·º¤µ¨ ©²µ¦¯∏¶·¨µ¬±ª¤±¤¯¼¶¬¶¤±§¦¤¯¦∏¯¤·¬±ªqƒ²∏µ·¨ ±¨ ²©·«¨ {s µ¤±§²°
³µ¬° µ¨¶º µ¨¨ ·¨¶·¨§·²³²¶¶¨¶¶·«¨ ¶·µ²±ª¨µ§¨·¨¦·¬±ª ©¨©¨¦·²©³²¯¼°²µ³«²∏¶¦«¤µ¤¦·¨µq Ρεσυλτ : „ ·²·¤¯ ²©{w ¥¤±§¶º¤¶¤°³¯¬©¬¨§¥¼·«¨ ts
³µ¬° µ¨¶o¤°²±ª·«¨ ° tz ¥¤±§¶º µ¨¨ °²±²°²µ³«¬¦qyz ²©·«¨ ° º µ¨¨ ³²¯¼°²µ³«¬¦q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¬±§¬¦¤·¨§·«¤··«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²±¶ ¬¨¬¶·¨§º¬·«2
¬±·«¨ §¬©©¨µ¨±·³¯¤±·³²³∏¯¤·¬²±¶²©·«¨ ¶¤°¨¶³¨¦¬¨¶qΧονχλυσιον : Œ·¬¶©¨¤¶¬¥¯¨¥¼ • „°⁄·¨¦«±¬´∏¨ º¬·«¶³¨¦¬©¬¦¤¯ ¼¯ ³µ¬° µ¨·²¤±¤¯¼½¨ ·«¨ ª¨2
±¨ ·¬¦§¬√ µ¨¶¬·¼ ¤±§¬§¨±·¬©¼ x ³¯¤±·³²³∏¯¤·¬²±¶²© Π. χαβλιν . • „°⁄·¨¦«±¬´∏¨ «¤¶³µ²√¬§¨§¤ ±¨ º ³¤·«©²µ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ¤±§¦¯¤¶¶¬©¬¦¤·¬²± ²©
Π. χαβλιν ª¨ ±¨ ·¬¦ª¨µ°³¯¤¶° q
[ Κεψ ωορδσ] Πογοστεµον χαβλιν ; ³²³∏¯¤·¬²±~ • „°⁄¤±¤¯¼¶¬¶~ª¨ ±¨ ·¬¦§¬√ µ¨¶¬·¼ ≈责任编辑 张宁宁 
≈收稿日期  ussx2su2ut
≈基金项目  国家重点科技攻关计划项目k||2|u|2st2svwl
≈通讯作者  3谭洪根 oר¯ }kstslywstwwtt2u|{w
高效液相色谱法测定续断药材中
川续断皂苷 √的含量
谭洪根 3 o林 生 o张启伟 o吉 力
k中国中医科学院 中药研究所 o北京 tsszssl
≈摘要  目的 }建立中药续断中川续断皂苷 √ 的含量测定方法 o为续断质量标准建立提供依据 ∀方法 }采用反
相高效液相色谱法 oŽµ²°¤¶¬¯ ’⁄≥色谱柱 o流动相为乙腈2水kvsΒzsl o检测波长为 utu ±° ∀结果 }续断中川续断皂苷
√在该色谱条件下获良好分离 o线性范围为 s1x{u x ∗ |1vu Λªoρ€ s1||| | o平均加样回收率为 tss1v h o重复性 • ≥⁄
为 u1v h ∀结论 }该方法方便 o快速 o准确 o可作为续断药材及其制剂质量控制的方法 ∀
≈关键词  续断 ~川续断皂苷 √ ~‹°≤
≈中图分类号  • u{w1t ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyls|2szuy2sv
续断始载于5神农本草经6 o列为上品 o具有补肝
肾 !强筋骨 !续折伤 !止崩漏 !安胎等功效 ∀用于腰膝
酸软 !风湿痹痛 !崩漏 !胎漏 !跌扑损伤等≈t  ∀川续断
∆ιπαχυσασπεροιδεσ ≤1≠ ≤«¨ ±ª ·¨×1 1„¬是中药续断
的主要基原植物 ousss年版5中国药典6将其收载 ∀
笔者已对川续断的化学成分进行了比较深入的研
究 o从川续断提取分离鉴定了 tz个化合物 ∀其中川
续断皂苷 √为主要的有效成分 o具有抗骨质疏松 !增
加骨密度的作用 ∀因此 o以其为指标 o建立了川续断
皂苷 √的含量测定方法 ∀该方法分离度好 !快速 !准
确 o可作为续断药材及其制剂质量控制的方法 ∀
1 仪器与试药
‹°ttss高效液相色谱仪 oŠtvtt„ 四元泵 o
Štvtv„自动进样器 oŠtvty„ 柱温箱 o⁄tvtx„ 二极
管矩阵检测器 o‹°≤‹∞ 工作站 ∀
川续断皂苷 √ 对照品从川续断中分离得到 o经
光谱确定结构 o且与文献报道一致≈u  ∀经 ‹°≤ 面
积归一化测定 o纯度为 tss h ∀续断药材由产地采
集或购自各地药材公司 o经北京大学医学部艾铁民
教授鉴定为续断科植物 ∆1 ασπεροιδεσ的干燥根 ∀甲
醇为优级纯 o乙腈为色谱纯 o纯水 ∀
2 方法与结果
211 色谱条件
Žµ²°¤¶¬¯ ’⁄≥色谱柱kw1y °° ≅ uxs °° ox Λ° ~北
京分析仪器厂填充l o柱温 vx ε o流动相为乙腈2水
kvsΒzsl o检测波长为 utu ±° o流速 t °#°¬±pt o进样
量 us ˏ∀对照品和样品 ‹°≤图谱见图 t ∀
#yuz#
第 vt卷第 |期
ussy年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ |
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