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Study function of endophytic fungus in parasitism process of mistleto

槲寄生内生真菌在槲寄生寄生过程中的作用



全 文 :槲寄生内生真菌在槲寄生寄生过程中的作用
丁志山,蒋福升,金 波,徐 莉,陈铌铍,吕圭源
(浙江中医药大学,浙江 杭州 310053)
[摘要] 目的:研究槲寄生内生真菌在槲寄生寄生过程中的作用。方法:将槲寄生8个不同部位的组织进行
外植体培养,分离纯化其内生真菌,利用CMC平板培养和DNS法筛选出具有较高纤维素酶活性的菌株;将槲寄生
寄生的膨大部位进行组织切片,染色观察其内生真菌的组织分布。结果:槲寄生体内分布着丰富的真菌菌丝;从槲
寄生各组织部位共分离出83株内生真菌;初步筛选得到38株可降解纤维素的菌株,19株降解纤维素能力较强,其
中10株分离自槲寄生寄生的膨大部位。结论:内生真菌分泌纤维素酶可降解枫杨树的细胞壁及细胞间隙组织,协
助槲寄生的吸器穿透枫杨树组织,帮助槲寄生在枫杨树上寄生。
[关键词] 槲寄生;内生真菌;寄生;纤维素酶
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)11124304
[收稿日期] 20070925
[通讯作者] 吕圭源,Tel:(0571)86613601,Email:lv.gy@
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  槲寄生 Viscumcoloratum(Komar.)Nakai是桑
寄生科的常绿半寄生小灌木,是近年天然药物研究
的热点。但槲寄生特殊的繁殖和生长方式限制了槲
寄生不能像其他药用植物那样可以人工快速大批量
种植,影响了槲寄生的进一步深入开发利用。
槲寄生和宿主枫杨树经过长期协同进化,槲寄生
已分化出吸器来获取无机盐和养分,吸器是寄生植物
与宿主植物间形态结构和生理功能的桥梁。但吸器
是如何侵入宿主并从宿主中获取水分和无机盐的,有
哪些具体因素在起作用,至今尚没有文献报道。
作者在进行槲寄生组织培养的研究中偶然发现
槲寄生中有大量的内生真菌存在,槲寄生内生菌同
槲寄生具有同样的药理作用[1]。本实验对内生菌
在槲寄生分布及槲寄生产纤维素酶活性等进行初步
研究,探讨内生菌在槲寄生寄生过程中的作用。
1 材料
1.1 槲寄生
槲寄生采自杭州植物园,寄生于枫杨树上,经胡
绍庆高级工程师鉴定为黄果槲寄生 V.coloratum
(Kom.)Nakaif.lutescensKitag。
1.2 仪器设备
超净工作台(SW-CJ-2FD型)、恒温培养箱
(KYC-100C)、高速冷冻离心机(HERAEUS)、分
光光度计(Uitrospec3300pro)等。
1.3 培养基
外植体培养基(PDA培养基):马铃薯200g,去
皮切碎,用双蒸水煮烂,过滤,加20g蔗糖,02%纯
化琼脂粉,溶于1000mL蒸馏水,116℃,25min灭
菌备用。
分离培养基(g·L-1):CMCNa20,KH2PO4
15,Na2HPO425,蛋白胨25,琼脂20,pH70,116
℃,25min灭菌备用。
测定培养基 (g·L-1):KH2PO405,MgSO4
025,CMCNa188,刚果红02,琼脂14,明胶20,
pH70,116℃,25min灭菌备用。
液体发酵培养基:KH2PO404%,CaCl2·2H2O
003%,MgSO4·7H2O003%,CMCNa20%,116
℃,25min灭菌备用。
2 方法
2.1 槲寄生组织切片染色
2.1.1 槲寄生组织酸性复红乳酸染色[2] 槲寄生
组织做成徒手切片,分别保存于盛有 FAA溶液的
安瓿瓶中进行酸性复红乳酸染色。将槲寄生组织置
于10% KOH溶液中,于高压蒸气灭菌锅(压力
105kg·cm-2)中蒸4~15min,自来水洗。加碱性
H2O2浸10min脱色。加001%酸性复红乳酸液于
105kg·cm-2压力下加压热染色10min左右,置
于二甲苯中透明2min,显微镜下观察。
2.1.2 槲寄生组织乳酸石炭酸棉蓝染色 苯胺蓝
是碱性染料,可染真菌的原生质。将枫杨树正常组
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    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
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织和槲寄生寄生的膨大组织徒手切片;用50%的乙
醇浸润,滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液镜检。
2.2 槲寄生与枫杨树内生真菌的分离与纯化培养
将槲寄生的不同部位用自来水洗净,加入洗衣
粉冲洗1h,用蒸馏水洗净槲寄生。分别用75%乙
醇消毒 10s,无菌水洗 2次;01% HgCl2消毒 10
min,无菌水洗6次,将各组织切成薄片,贴于 PDA
培养基上。同时做无菌对照。培养1~4d后,挑取
槲寄生组织周围长出的菌丝体,进行连续划线,放于
270℃的恒温箱培养得纯菌种。同样做枫杨树茎
内生真菌的分离培养。
2.3 产纤维素酶内生菌的筛选
2.3.1 产纤维素酶菌株的初步筛选 挑取菌丝接
种于分离培养基;待长出明显的菌落,将其刮去,浸
于05mg·L-1的刚果红中染色1h;倒去染液,脱
色1h,测定透明圈的大小。
2.3.2 产纤维素酶菌株酶活性的初步测定 挑取
筛选出的单菌落,接种于测定培养基,270℃培养。
待长出明显的菌落,将其刮去,脱色1h,测定透明
圈[3]的大小。根据透明圈的大小可初步测定纤维
素酶活力大小。
2.3.3 产纤维素酶菌株酶活性的精确测定 将
232测定的具有较强纤维素酶活的菌,分别接种
于CMCNa、滤纸、稻草、棉花发酵培养基中,每隔24
h采用管斌等的方法[4]测定培养基中的还原糖含
量,计算出纤维素酶的活性。
2.4 枫杨树槲寄生寄生的膨大部位和非寄生部位
还原糖含量测定
将枫杨树上槲寄生寄生的膨大部位和非寄生部
位的木质部采用植物粉碎机磨碎,测定木质部中的
还原糖含量。
3 结果与分析
3.1 槲寄生组织切片染色观察
槲寄生寄生膨大部位经乳酸品红染色观察证实
槲寄生膨大部位内有丰富的内生真菌,膨大部位切
片乳酸石炭酸棉蓝染色可见典型泡囊(图1)。
3.2 槲寄生内生真菌的分离纯化结果
从槲寄生茎、叶、芽、靠近芽的茎、果实、槲寄生
寄生的膨大部位等8个部位分离得到83株内生真
菌,各部位内生真菌的数量(表1)以寄生的膨大部
位和果实中最多。分离出的 83株内生真菌中有
325%存在于槲寄生的寄生膨大部位,靠近膨大部
  
图1 槲寄生寄生膨大部位组织切片
1.酸性复红乳酸染色(示膨大部位横切);2.膨大部位酸性复红
乳酸染色(示菌丝);3.膨大部位棉蓝染色(示菌丝和泡囊);4
膨大部位酸性复红乳酸染色(示菌丝)
位的茎占157%,果实部位占180%。从分离结果
可以看出槲寄生内含有丰富的内生真菌。而同样条
件下从槲寄生寄生的枫杨树枝条中只分离出6株内
生真菌。
表1 槲寄生不同部位筛选出的菌数 株
组织部位 总菌数 CMCNa 刚果红纤维素
膨大部位 27 17 10
靠近膨大部位的茎 13 8 4
节结 6 2 0
节间 2 0 0
靠近芽的茎 7 3 0
叶 8 1 0
果实 15 10 5
芽 5 0 0
3.3 产纤维素酶菌株初步筛选结果
将分离出的83株真菌在 CMCNa平板上进行
纤维素酶活性的初步测定,共筛选出 38株可降解
CMCNa,且透明圈的直径大于15cm。筛选出的
各部位菌株数量见表 1中的 CMCNa筛选出的菌
数。槲寄生的膨大部位、果实、靠近膨大部位的茎能
降解CMCNa的内生真菌的数量远多于其他部位。
3.4 产纤维素酶菌株产酶活力初步测定结果
经过初步筛选得到的38株内生真菌,通过利用
刚果红纤维素平板对其纤维素酶活力进行再次测
定,27℃培养3d,测其透明圈的直径并计算其相对
酶活力(cm·d-1)(表2)。其中 M菌来自膨大部
位,H菌来自果实,L菌来自靠近膨大部位的茎。对
于枫杨树的6株内生真菌也进行了纤维素酶活力的
测定,但未出现透明圈,说明其不产纤维素酶或产纤
维素酶的能力不强。
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 表2 产纤维素酶内生真菌的酶活力初步测定  cm·d-1
菌种号 CMC 菌种号 CMC
M1 067 L1 052
M2 050 L2 050
M3 065 L3 060
M4 065 L4 057
M5 070 H1 035
M6 050 H2 080
M7 053 H3 086
M8 067 H4 083
M9 100 H5 063
M10 057    
3.5 产纤维素酶菌株酶活性的精确测定结果
综合3.3和3.4的筛选结果,将槲寄生各部位
分离出的内生真菌中产纤维素酶活性较高的11株
利用DNS法分别进行了稻草酶、棉花酶、滤纸酶和
CMCNa酶活的精确测定(表3)。
表3 产纤维素酶内生真菌的酶活力精确测定 U
菌株号 滤纸 稻草 CMCNa
C1 01353 01162 11730
H3 00000 01272 15720
F2 00000 01272 15720
G1 00785 00709 10958
H4 00000 00593 11695
J1 00588 01052 10831
K1 07223 01719 25006
L3 00000 06359 00530
M3 00000 00000 13655
M5 00570 00053 05268
M9 00709 00773 00733
  注:棉花酶活为0
从表3数据可以看出,来自槲寄生膨大部位、靠
近膨大部位的茎以及果实中的内生真菌相比其他部
位分离得到的内生真菌有较强的降解纤维素的能
力。其中M3(膨大部位),H3(果实),K1(靠近膨
大部位的茎)有较强的 CMCNa酶活,L3(膨大部
位)有强的稻草酶活。
3.6 枫杨树槲寄生寄生的膨大部位和非寄生部位
还原糖含量测定
膨大部位还原糖为241mg·g-1,非寄生部位
还原糖为142mg·g-1。
4 讨论
寄生植物通过吸器从宿主植物中吸取自身生长
发育所需要的水分、矿物质和有机物。黄建中等[5]
通过对全寄生植物日本菟丝子吸器生长机制进行研
究后认为,在日本菟丝子吸器前端的细胞中可能含
有酸性磷酸酶等酶类,这些酶能使寄主植物的细胞
壁软化并水解,有利于寄生。到目前为止只是对全
寄生植物寄生机制的一种推测。
本研究发现,槲寄生中有大量的内生真菌存在。
但宿主枫杨树中却很少。将槲寄生的寄生部位进行
了组织切片染色,清楚地看到了槲寄生吸器周围布满
了菌丝。内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中
与宿主协同进化,彼此构成了稳定的生态关系[6]。本
研究从槲寄生各部位组织中分离出83株内生真菌,
其中槲寄生的寄生膨大部位占27株。有38株菌具
有不同程度的降解纤维素的能力,其中的19株内生
真菌分泌的纤维素酶平均活性是其他菌株的2~3
倍。这19株菌中有10株分离自寄生的膨大部位,5
株分离自果实,靠近膨大部位的茎则占4株。各部位
分离出的菌株降解纤维素的能力不同。
研究表明,植物寄生的吸器侵入宿主,穿透宿主
的维管束,是由于机械压力和酶的共同作用[7]。因
此根据产纤维素酶菌株在槲寄生寄生膨大部位和种
子中分布比较多现象,作者认为槲寄生的内生真菌
分泌纤维素酶降解了宿主细胞的纤维素,为半寄生
的槲寄生吸器侵入宿主提供了帮助。槲寄生寄生的
膨大部位还原糖含量较高也提供了证据。说明内生
真菌在槲寄生繁殖与寄生过程中起了重要作用。
前期研究发现在根瘤菌与其宿主植物识别的过
程中,存在于豆科植物的凝集素(lectin)和存在于根
瘤菌细胞表面的多糖类起着关键作用[8]。槲寄生
中有大量凝集素存在,因此作者推测凝集素可能和
内生真菌表面多糖互补,二者特异性结合后,诱导内
生菌产生纤维素酶使槲寄生侵入宿主枫杨树形成侵
入线,最终形成类似于根瘤的枫杨树寄生膨大部位;
另一方面,内生菌本身也分泌一些植物生长激素,内
生菌分泌的生长激素进一步促进槲寄生寄生部位膨
大和促进槲寄生生长发育。因此内生菌为槲寄生的
繁殖、生长和发育提供了理想的条件。当然这需要
实验进一步验证。
[参考文献]
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Studyfunctionofendophyticfungusinparasitismprocessofmistleto
DINGZhishan,JIANGFusheng,JINBo,XULi,CHENNipi,LVGuiyuan
(ZhejiangTraditionChineseMedicalColege,Hangzhou310053,China)
[Abstract] Objective:ToresearchthefunctionofendophytesofmistletoeinparasitismprocessofmistletoeinPterocarya
stenoptera.Method:Endophytesfromeightdiferentpartsofthemistletoewereseparatedbyexplantculture,andfurtherscreenedby
diferentCMCplatescultureandDNSmethodtogetcelulasehighproductivestrains.Thedistributionoftheendophyticfungusparasit
izedinmistletoewerepreparedandstainedtodemonstratebyhistologicalsectionoftheintumescentiapartoftheP.stenoptera.Re
sult:Thehistologicalsectionindicatedthataboundentofhyphasmaweredistributedaroundthehaustoriumofthemistletoe.Eighty
threestrainsofendophyticfunguswereseparated,38ofthemwereabletodegradecelulose,19strainsshowedhighcelulaseactivity
and10ofwhichwereseparatedfromtheparasiticposition.Conclusion:Endophyticfungusofmistletoecansecretecelulaseandassist
thehaustoriumofmistletoetobreakthroughthecelwalsaswelasintercelularspacetissuesoftheP.stenoptera,thus,theendophyt
icfungusplaysanimportantroleintheparasitismprocessofmistletoinPstenoptera.
[Keywords] mistletoe;endophyticfungus;parasitism;celulase [责任编辑 张宁宁]
[收稿日期] 20061128
[基金项目] 国家中医药管理局项目(2004ZX061);国家科技
支撑计划课题(2006BAI06A1109);重庆市巫溪县远帆药业公司合
作研究项目
[通讯作者] 孙年喜,Tel:(023)89029062,Email:sunnx2008
@163.com
川党参种子发芽检验规程的研究
孙年喜,彭 锐,李隆云,钟国跃
(重庆市中药研究院,重庆 400065)
[摘要] 目的:探讨温度、光照、发芽床等因素对川党参种子发芽的影响。方法:常规发芽试验方法进行试验。
结果与结论:川党参种子发芽最适温度为25℃,需光照,发芽床选纸上或纸间均可,发芽初次计数时间为置床后第
10天,末次计数时间为置床后第18天。以赤霉素处理可显著提高川党参种子的发芽率。
[关键词] 川党参;种子;发芽
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)11124603
  川党参CodonopsistangshenOliv.为桔梗科多年
生草本植物,以根入药,其性味甘平、无毒,为药食两
用药材,有补中益气、生津止渴等功效,主治脾胃虚
弱,中气不足,肺气亏虚,热病伤津,气短口渴,血虚
萎黄,头晕心慌等症[1],是我国常用的中药材,在东
南亚则被做为保健食品使用。野生党参主要分布于
黑龙江、吉林、辽宁、山西、陕西、甘肃、宁夏、四川等
省区,近年来因掠夺式的采挖,野生党参资源迅猛减
少,故人工栽培党参具有很好的市场前景[2]。党参
栽培中使用播种育苗,两年生党参的新鲜种子发芽
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