全 文 :槲寄生内生真菌在槲寄生寄生过程中的作用
丁志山,蒋福升,金 波,徐 莉,陈铌铍,吕圭源
(浙江中医药大学,浙江 杭州 310053)
[摘要] 目的:研究槲寄生内生真菌在槲寄生寄生过程中的作用。方法:将槲寄生8个不同部位的组织进行
外植体培养,分离纯化其内生真菌,利用CMC平板培养和DNS法筛选出具有较高纤维素酶活性的菌株;将槲寄生
寄生的膨大部位进行组织切片,染色观察其内生真菌的组织分布。结果:槲寄生体内分布着丰富的真菌菌丝;从槲
寄生各组织部位共分离出83株内生真菌;初步筛选得到38株可降解纤维素的菌株,19株降解纤维素能力较强,其
中10株分离自槲寄生寄生的膨大部位。结论:内生真菌分泌纤维素酶可降解枫杨树的细胞壁及细胞间隙组织,协
助槲寄生的吸器穿透枫杨树组织,帮助槲寄生在枫杨树上寄生。
[关键词] 槲寄生;内生真菌;寄生;纤维素酶
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)11124304
[收稿日期] 20070925
[通讯作者] 吕圭源,Tel:(0571)86613601,Email:lv.gy@
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槲寄生 Viscumcoloratum(Komar.)Nakai是桑
寄生科的常绿半寄生小灌木,是近年天然药物研究
的热点。但槲寄生特殊的繁殖和生长方式限制了槲
寄生不能像其他药用植物那样可以人工快速大批量
种植,影响了槲寄生的进一步深入开发利用。
槲寄生和宿主枫杨树经过长期协同进化,槲寄生
已分化出吸器来获取无机盐和养分,吸器是寄生植物
与宿主植物间形态结构和生理功能的桥梁。但吸器
是如何侵入宿主并从宿主中获取水分和无机盐的,有
哪些具体因素在起作用,至今尚没有文献报道。
作者在进行槲寄生组织培养的研究中偶然发现
槲寄生中有大量的内生真菌存在,槲寄生内生菌同
槲寄生具有同样的药理作用[1]。本实验对内生菌
在槲寄生分布及槲寄生产纤维素酶活性等进行初步
研究,探讨内生菌在槲寄生寄生过程中的作用。
1 材料
1.1 槲寄生
槲寄生采自杭州植物园,寄生于枫杨树上,经胡
绍庆高级工程师鉴定为黄果槲寄生 V.coloratum
(Kom.)Nakaif.lutescensKitag。
1.2 仪器设备
超净工作台(SW-CJ-2FD型)、恒温培养箱
(KYC-100C)、高速冷冻离心机(HERAEUS)、分
光光度计(Uitrospec3300pro)等。
1.3 培养基
外植体培养基(PDA培养基):马铃薯200g,去
皮切碎,用双蒸水煮烂,过滤,加20g蔗糖,02%纯
化琼脂粉,溶于1000mL蒸馏水,116℃,25min灭
菌备用。
分离培养基(g·L-1):CMCNa20,KH2PO4
15,Na2HPO425,蛋白胨25,琼脂20,pH70,116
℃,25min灭菌备用。
测定培养基 (g·L-1):KH2PO405,MgSO4
025,CMCNa188,刚果红02,琼脂14,明胶20,
pH70,116℃,25min灭菌备用。
液体发酵培养基:KH2PO404%,CaCl2·2H2O
003%,MgSO4·7H2O003%,CMCNa20%,116
℃,25min灭菌备用。
2 方法
2.1 槲寄生组织切片染色
2.1.1 槲寄生组织酸性复红乳酸染色[2] 槲寄生
组织做成徒手切片,分别保存于盛有 FAA溶液的
安瓿瓶中进行酸性复红乳酸染色。将槲寄生组织置
于10% KOH溶液中,于高压蒸气灭菌锅(压力
105kg·cm-2)中蒸4~15min,自来水洗。加碱性
H2O2浸10min脱色。加001%酸性复红乳酸液于
105kg·cm-2压力下加压热染色10min左右,置
于二甲苯中透明2min,显微镜下观察。
2.1.2 槲寄生组织乳酸石炭酸棉蓝染色 苯胺蓝
是碱性染料,可染真菌的原生质。将枫杨树正常组
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织和槲寄生寄生的膨大组织徒手切片;用50%的乙
醇浸润,滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液镜检。
2.2 槲寄生与枫杨树内生真菌的分离与纯化培养
将槲寄生的不同部位用自来水洗净,加入洗衣
粉冲洗1h,用蒸馏水洗净槲寄生。分别用75%乙
醇消毒 10s,无菌水洗 2次;01% HgCl2消毒 10
min,无菌水洗6次,将各组织切成薄片,贴于 PDA
培养基上。同时做无菌对照。培养1~4d后,挑取
槲寄生组织周围长出的菌丝体,进行连续划线,放于
270℃的恒温箱培养得纯菌种。同样做枫杨树茎
内生真菌的分离培养。
2.3 产纤维素酶内生菌的筛选
2.3.1 产纤维素酶菌株的初步筛选 挑取菌丝接
种于分离培养基;待长出明显的菌落,将其刮去,浸
于05mg·L-1的刚果红中染色1h;倒去染液,脱
色1h,测定透明圈的大小。
2.3.2 产纤维素酶菌株酶活性的初步测定 挑取
筛选出的单菌落,接种于测定培养基,270℃培养。
待长出明显的菌落,将其刮去,脱色1h,测定透明
圈[3]的大小。根据透明圈的大小可初步测定纤维
素酶活力大小。
2.3.3 产纤维素酶菌株酶活性的精确测定 将
232测定的具有较强纤维素酶活的菌,分别接种
于CMCNa、滤纸、稻草、棉花发酵培养基中,每隔24
h采用管斌等的方法[4]测定培养基中的还原糖含
量,计算出纤维素酶的活性。
2.4 枫杨树槲寄生寄生的膨大部位和非寄生部位
还原糖含量测定
将枫杨树上槲寄生寄生的膨大部位和非寄生部
位的木质部采用植物粉碎机磨碎,测定木质部中的
还原糖含量。
3 结果与分析
3.1 槲寄生组织切片染色观察
槲寄生寄生膨大部位经乳酸品红染色观察证实
槲寄生膨大部位内有丰富的内生真菌,膨大部位切
片乳酸石炭酸棉蓝染色可见典型泡囊(图1)。
3.2 槲寄生内生真菌的分离纯化结果
从槲寄生茎、叶、芽、靠近芽的茎、果实、槲寄生
寄生的膨大部位等8个部位分离得到83株内生真
菌,各部位内生真菌的数量(表1)以寄生的膨大部
位和果实中最多。分离出的 83株内生真菌中有
325%存在于槲寄生的寄生膨大部位,靠近膨大部
图1 槲寄生寄生膨大部位组织切片
1.酸性复红乳酸染色(示膨大部位横切);2.膨大部位酸性复红
乳酸染色(示菌丝);3.膨大部位棉蓝染色(示菌丝和泡囊);4
膨大部位酸性复红乳酸染色(示菌丝)
位的茎占157%,果实部位占180%。从分离结果
可以看出槲寄生内含有丰富的内生真菌。而同样条
件下从槲寄生寄生的枫杨树枝条中只分离出6株内
生真菌。
表1 槲寄生不同部位筛选出的菌数 株
组织部位 总菌数 CMCNa 刚果红纤维素
膨大部位 27 17 10
靠近膨大部位的茎 13 8 4
节结 6 2 0
节间 2 0 0
靠近芽的茎 7 3 0
叶 8 1 0
果实 15 10 5
芽 5 0 0
3.3 产纤维素酶菌株初步筛选结果
将分离出的83株真菌在 CMCNa平板上进行
纤维素酶活性的初步测定,共筛选出 38株可降解
CMCNa,且透明圈的直径大于15cm。筛选出的
各部位菌株数量见表 1中的 CMCNa筛选出的菌
数。槲寄生的膨大部位、果实、靠近膨大部位的茎能
降解CMCNa的内生真菌的数量远多于其他部位。
3.4 产纤维素酶菌株产酶活力初步测定结果
经过初步筛选得到的38株内生真菌,通过利用
刚果红纤维素平板对其纤维素酶活力进行再次测
定,27℃培养3d,测其透明圈的直径并计算其相对
酶活力(cm·d-1)(表2)。其中 M菌来自膨大部
位,H菌来自果实,L菌来自靠近膨大部位的茎。对
于枫杨树的6株内生真菌也进行了纤维素酶活力的
测定,但未出现透明圈,说明其不产纤维素酶或产纤
维素酶的能力不强。
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表2 产纤维素酶内生真菌的酶活力初步测定 cm·d-1
菌种号 CMC 菌种号 CMC
M1 067 L1 052
M2 050 L2 050
M3 065 L3 060
M4 065 L4 057
M5 070 H1 035
M6 050 H2 080
M7 053 H3 086
M8 067 H4 083
M9 100 H5 063
M10 057
3.5 产纤维素酶菌株酶活性的精确测定结果
综合3.3和3.4的筛选结果,将槲寄生各部位
分离出的内生真菌中产纤维素酶活性较高的11株
利用DNS法分别进行了稻草酶、棉花酶、滤纸酶和
CMCNa酶活的精确测定(表3)。
表3 产纤维素酶内生真菌的酶活力精确测定 U
菌株号 滤纸 稻草 CMCNa
C1 01353 01162 11730
H3 00000 01272 15720
F2 00000 01272 15720
G1 00785 00709 10958
H4 00000 00593 11695
J1 00588 01052 10831
K1 07223 01719 25006
L3 00000 06359 00530
M3 00000 00000 13655
M5 00570 00053 05268
M9 00709 00773 00733
注:棉花酶活为0
从表3数据可以看出,来自槲寄生膨大部位、靠
近膨大部位的茎以及果实中的内生真菌相比其他部
位分离得到的内生真菌有较强的降解纤维素的能
力。其中M3(膨大部位),H3(果实),K1(靠近膨
大部位的茎)有较强的 CMCNa酶活,L3(膨大部
位)有强的稻草酶活。
3.6 枫杨树槲寄生寄生的膨大部位和非寄生部位
还原糖含量测定
膨大部位还原糖为241mg·g-1,非寄生部位
还原糖为142mg·g-1。
4 讨论
寄生植物通过吸器从宿主植物中吸取自身生长
发育所需要的水分、矿物质和有机物。黄建中等[5]
通过对全寄生植物日本菟丝子吸器生长机制进行研
究后认为,在日本菟丝子吸器前端的细胞中可能含
有酸性磷酸酶等酶类,这些酶能使寄主植物的细胞
壁软化并水解,有利于寄生。到目前为止只是对全
寄生植物寄生机制的一种推测。
本研究发现,槲寄生中有大量的内生真菌存在。
但宿主枫杨树中却很少。将槲寄生的寄生部位进行
了组织切片染色,清楚地看到了槲寄生吸器周围布满
了菌丝。内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中
与宿主协同进化,彼此构成了稳定的生态关系[6]。本
研究从槲寄生各部位组织中分离出83株内生真菌,
其中槲寄生的寄生膨大部位占27株。有38株菌具
有不同程度的降解纤维素的能力,其中的19株内生
真菌分泌的纤维素酶平均活性是其他菌株的2~3
倍。这19株菌中有10株分离自寄生的膨大部位,5
株分离自果实,靠近膨大部位的茎则占4株。各部位
分离出的菌株降解纤维素的能力不同。
研究表明,植物寄生的吸器侵入宿主,穿透宿主
的维管束,是由于机械压力和酶的共同作用[7]。因
此根据产纤维素酶菌株在槲寄生寄生膨大部位和种
子中分布比较多现象,作者认为槲寄生的内生真菌
分泌纤维素酶降解了宿主细胞的纤维素,为半寄生
的槲寄生吸器侵入宿主提供了帮助。槲寄生寄生的
膨大部位还原糖含量较高也提供了证据。说明内生
真菌在槲寄生繁殖与寄生过程中起了重要作用。
前期研究发现在根瘤菌与其宿主植物识别的过
程中,存在于豆科植物的凝集素(lectin)和存在于根
瘤菌细胞表面的多糖类起着关键作用[8]。槲寄生
中有大量凝集素存在,因此作者推测凝集素可能和
内生真菌表面多糖互补,二者特异性结合后,诱导内
生菌产生纤维素酶使槲寄生侵入宿主枫杨树形成侵
入线,最终形成类似于根瘤的枫杨树寄生膨大部位;
另一方面,内生菌本身也分泌一些植物生长激素,内
生菌分泌的生长激素进一步促进槲寄生寄生部位膨
大和促进槲寄生生长发育。因此内生菌为槲寄生的
繁殖、生长和发育提供了理想的条件。当然这需要
实验进一步验证。
[参考文献]
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Studyfunctionofendophyticfungusinparasitismprocessofmistleto
DINGZhishan,JIANGFusheng,JINBo,XULi,CHENNipi,LVGuiyuan
(ZhejiangTraditionChineseMedicalColege,Hangzhou310053,China)
[Abstract] Objective:ToresearchthefunctionofendophytesofmistletoeinparasitismprocessofmistletoeinPterocarya
stenoptera.Method:Endophytesfromeightdiferentpartsofthemistletoewereseparatedbyexplantculture,andfurtherscreenedby
diferentCMCplatescultureandDNSmethodtogetcelulasehighproductivestrains.Thedistributionoftheendophyticfungusparasit
izedinmistletoewerepreparedandstainedtodemonstratebyhistologicalsectionoftheintumescentiapartoftheP.stenoptera.Re
sult:Thehistologicalsectionindicatedthataboundentofhyphasmaweredistributedaroundthehaustoriumofthemistletoe.Eighty
threestrainsofendophyticfunguswereseparated,38ofthemwereabletodegradecelulose,19strainsshowedhighcelulaseactivity
and10ofwhichwereseparatedfromtheparasiticposition.Conclusion:Endophyticfungusofmistletoecansecretecelulaseandassist
thehaustoriumofmistletoetobreakthroughthecelwalsaswelasintercelularspacetissuesoftheP.stenoptera,thus,theendophyt
icfungusplaysanimportantroleintheparasitismprocessofmistletoinPstenoptera.
[Keywords] mistletoe;endophyticfungus;parasitism;celulase [责任编辑 张宁宁]
[收稿日期] 20061128
[基金项目] 国家中医药管理局项目(2004ZX061);国家科技
支撑计划课题(2006BAI06A1109);重庆市巫溪县远帆药业公司合
作研究项目
[通讯作者] 孙年喜,Tel:(023)89029062,Email:sunnx2008
@163.com
川党参种子发芽检验规程的研究
孙年喜,彭 锐,李隆云,钟国跃
(重庆市中药研究院,重庆 400065)
[摘要] 目的:探讨温度、光照、发芽床等因素对川党参种子发芽的影响。方法:常规发芽试验方法进行试验。
结果与结论:川党参种子发芽最适温度为25℃,需光照,发芽床选纸上或纸间均可,发芽初次计数时间为置床后第
10天,末次计数时间为置床后第18天。以赤霉素处理可显著提高川党参种子的发芽率。
[关键词] 川党参;种子;发芽
[中图分类号]S567 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)11124603
川党参CodonopsistangshenOliv.为桔梗科多年
生草本植物,以根入药,其性味甘平、无毒,为药食两
用药材,有补中益气、生津止渴等功效,主治脾胃虚
弱,中气不足,肺气亏虚,热病伤津,气短口渴,血虚
萎黄,头晕心慌等症[1],是我国常用的中药材,在东
南亚则被做为保健食品使用。野生党参主要分布于
黑龙江、吉林、辽宁、山西、陕西、甘肃、宁夏、四川等
省区,近年来因掠夺式的采挖,野生党参资源迅猛减
少,故人工栽培党参具有很好的市场前景[2]。党参
栽培中使用播种育苗,两年生党参的新鲜种子发芽
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ChinaJournalofChineseMateriaMedica
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