全 文 ：茯苓三萜类化合物在人源 Ｃａｃｏ２细胞单层
模型中的吸收研究
郑　艳，杨秀伟
（北京大学 药学院 天然药物学系 天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 １０００８３）
［摘要］　目的：研究中药茯苓中３表去氢土莫酸（３ｅｐｉｄｅｈｙｄｒｏｔｕｍｕｌｏｓｉｃａｃｉｄ，ＥＤＨＴＡ）、猪苓酸 Ｃ（ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃ
ａｃｉｄＣ，ＰＰＡＣ）和６α羟基猪苓酸Ｃ（６αｈｙｄｒｏｘｙｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃａｃｉｄＣ，ＨＰＰＡ）在人肠的吸收。方法：采用人源结肠腺癌细
胞系Ｃａｃｏ２细胞单层模型研究ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ由绒毛面（ＡＰ侧）到基底面（ＢＬ侧）、ＢＬ侧到 ＡＰ侧２个方
向的转运过程。应用高效液相色谱法分离、紫外检测法对上述３个化合物进行定量分析，计算转运参数和表观渗
透系数，并与阳性对照药普萘洛尔和阿替洛尔进行比较。结果：ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ由ＡＰ侧到ＢＬ侧的表观渗
透系数（Ｐａｐｐ）值分别为（９９９±１０８）×１０
－６、（１００６±０５３）×１０－６和（３３２±０６６）×１０－６ｃｍ·ｓ－１；由 ＢＬ侧到
ＡＰ侧的Ｐａｐｐ值分别为（１７７６±０９１）×１０
－６、（１９２３±１１６）×１０－６和（８１９±０５７）×１０－６ｃｍ·ｓ－１。与本实验中
在Ｃａｃｏ２细胞单层模型上呈良好吸收的阳性对照药普萘洛尔的Ｐａｐｐ值（１４５×１０
－５ｃｍ·ｓ－１）和呈难于吸收的阳性
对照药阿替洛尔的Ｐａｐｐ值（４２２×１０
－７ｃｍ·ｓ－１）比较，ＥＤＨＴＡ和ＰＰＡＣ与普萘洛尔在同一数量级；ＨＰＰＡ介于普萘
洛尔和阿替洛尔之间。ＥＤＨＴＡ、ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ的ＰａｐｐＡ→Ｂ／ＰａｐｐＢ→Ａ比值分别为０５６，０５２和０４１；ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和
ＨＰＰＡ外流分别是摄取的１７８，１９１，２４７倍。结论：ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ可以通过小肠上皮细胞被动吸收进入
体内，ＥＤＨＴＡ和ＰＰＡＣ属于良好吸收的化合物；ＨＰＰＡ属于中等吸收的化合物。ＥＤＨＴＡ、ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ在 Ｃａｃｏ２
细胞单层模型中的转运可能存在外流机制。
［关键词］　Ｃａｃｏ２细胞单层；茯苓；３表去氢土莫酸；猪苓酸Ｃ；６α羟基猪苓酸Ｃ；肠吸收；表观渗透系数
［中图分类号］Ｒ２８４．１　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００８）１３１５９６０６
［收稿日期］　２００７１０１６
［基金项目］　国家自然科学基金（２０５７２００７）；国家高技术领域
研究 “８６３”计 划 （２００２ＡＡ２Ｚ３４３Ｃ）；北 京 市 科 委 科 技 专 项
（Ｚ０００４１０５０４０３１１）；国家“十一五”科技支撑（２００６ＢＡＩ０６Ａ０１）；天然
药物及仿生药物国家重点实验室开放课题等基金
［通讯作者］　杨秀伟，Ｔｅｌ：（０１０）８２８０５１０６，Ｅｍａｉｌ：ｘｗｙａｎｇ＠
ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　传统中药用药绝大多数为口服，为了使发挥生
物学效应的化学成分能够到达靶器官，必须有足够
量的分子从胃肠道吸收进入血液循环。因此，在口
服创新药物或先导化合物［１］、中药有效成分［２］和有
毒成分［３］研究过程中，其肠吸收研究是一个非常重
要的环节。为了研究中药复方中化学成分在肠吸收
方面的相互促进作用或抑制作用，单体化合物的研
究是必要的前提。在系列研究中，作者先后报道了
中药中黄酮［４］、间苯三酚衍生物［５］、阿霍烯［６］和生
物碱［７］等在人源Ｃａｃｏ２细胞单层模型的吸收研究，
报道了“中药化学成分肠吸收研究中 Ｃａｃｏ２细胞模
型和标准操作程序的建立”［８］。本研究报道传统中
药茯苓［Ｐｏｒｉａｃｏｃｏｓ（Ｓｃｈｗ．）Ｗｏｌｆ．的干燥菌核］中３
表去氢土莫酸 （３ｅｐｉｄｅｈｙｄｒｏｔｕｍｕｌｏｓｉｃａｃｉｄ，ＥＤ
ＨＴＡ）、猪苓酸Ｃ（ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃａｃｉｄＣ，ＰＰＡＣ）和６α羟
基猪苓酸 Ｃ（６αｈｙｄｒｏｘｙｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃａｃｉｄＣ，ＨＰＰＡ）
在Ｃａｃｏ２细胞单层模型中的吸收转运研究。
１　材料
１．１　药品和试剂
见参考文献［７］。
１．２　仪器
ＶａｒｉａｎＣａｒｙＥｃｌｉｐｓｅ３００型紫外吸收光谱（ＵＶ）
仪；ＶａｒｉａｎＩＮＯＶＡ５００型核磁共振波谱（ＮＭＲ）仪，
１Ｈ观察频率为４９９８９Ｈｚ，１３Ｃ观察频率为１２５７０
Ｈｚ，吡啶ｄ５（Ｃ５Ｄ５Ｎ）为溶剂，ＴＭＳ为内标；ＭＤＳＳＣＩ
ＥＸＡＰＩＱＳＴＡＲ型飞行时间质谱（ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）
仪；制备型高效液相色谱（ＨＰＬＣ）仪为 ＬａｂＴｅｃｈ
ＨＰＬＣ系统，由ＬＣＰ６００型泵、ＵＶ６００ＵＶｖｉｓ型检测
器和ＬａｂｔｅｃｈＣｈｒｏｍｓｏｆｔｗａｒｅ数据处理工作站组成，
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色 谱 柱 为 Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ１０ Ｃ１８（２）柱
（２１２ｍｍ×２５０ｍｍ，１０μｍ）（ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＩｎｃ．，
Ｔｏｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ），检测波长 ２１０ｎｍ，流速为 １０
ｍＬ·ｍｉｎ－１；分析型 ＨＰＬＣ仪为 ＤＩＯＮＥＸ（ＤＩＯＮＥＸ
Ｃｏ．，Ｍüｎｃｈｅｎ，德国）ＨＰＬＣ系统，由 ＤＩＯＮＥＸＰ６８０
型泵、ＵＶＤ１７０Ｕ型检测器和 ＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎＶｅｒｓｉｏｎ
６５０数据处理工作站组成，色谱柱为 ＤｉｋｍａＤｉａ
ｍｏｎｓｉｌＴＭＣ１８柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），偶联 Ｄｉｋ
ｍａＥａｓｙＧｕａｒｄＣ１８保护柱（４６ｍｍ×２０ｍｍ），柱温为
室温，流动相：ＥＤＨＴＡ为甲醇水Ｈ３ＰＯ４（９２∶８∶
０１），ＰＰＡＣ为甲醇水Ｈ３ＰＯ４（８６∶１４∶０１），ＨＰＰＡ
为甲醇水Ｈ３ＰＯ４（７６∶２４∶００５）。检测波长皆为
２４２ｎｍ，流速皆为１ｍＬ·ｍｉｎ－１，进样量皆为２０μＬ。
其他仪器见文献［７］。
１．３　ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ的制备
实验用茯苓 Ｐｃｏｃｏｓ的干燥菌核系２００２年９
月采自湖北省罗田县九资河“茯苓 ＧＡＰ基地”，经
杨秀伟教授鉴定。标本（Ｎｏ．２００２０９２０）存放在北
京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验
室。
取茯苓粗粉１０ｋｇ用９５％乙醇４０Ｌ提取５次，
每次１ｈ，得提取物１３０７ｇ（收率为１３１％）。将此
提取物悬浮在１２５Ｌ蒸馏水中，依次用２５Ｌ环己
烷萃取７次、２５Ｌ醋酸乙酯（ＥｔＯＡｃ）萃取５次、２５
Ｌ水饱和正丁醇萃取５次，得环己烷萃取物１６２ｇ
（０１６２％）、ＥｔＯＡｃ萃取物 ３６８ｇ（０３６８％）、正丁
醇萃取物 １７２ｇ（０１７２％）和残余水层 ６０５ｇ
（０６０５％）。
将环己烷萃取物进行硅胶柱色谱，环己烷ＥｔＯ
Ａｃ梯度洗脱，得到１５１个组分。合并组分８５～８９，
经反相ＨＰＬＣ制备分离纯化，流动相为 ＭｅＯＨＨ２Ｏ
ＨＣＯＯＨ（７６∶２４∶００５），得到 ＥＤＨＴＡ（１８ｍｇ）。将
ＥｔＯＡｃ萃取物进行硅胶柱色谱，ＥｔＯＡｃＭｅＯＨ梯度
洗脱，得到 ２５８个组分，经薄层色谱检查，合并为
Ａ～Ｄ等４个组分。组分 Ａ经反相 ＨＰＬＣ制备分离
纯化，流动相为 ＭｅＯＨＨ２ＯＨＣＯＯＨ（８０∶２０∶００５），
得到ＰＰＡＣ（２４ｍｇ）。组分 Ｃ经硅胶柱色谱分离纯
化，ＣＨＣｌ３ＭｅＯＨ（９∶１）洗脱，ＭｅＯＨ结晶，得到 ＨＰ
ＰＡ（１６ｍｇ）。
ＥＤＨＴＡ、ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ１Ｈ和１３ＣＮＭＲ数据与
文献［９１１］一致，化学结构见图１，ＨＰＬＣ测定其纯
度皆大于９５％。
图１　ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ的化学结构
２　方法
２．１　细胞培养条件
２．１．１　培养液和缓冲溶液的配制　见文献［７］。
２．１．２　细胞培养和种板　复苏冻存的第３０代细
胞，以ＤＭＥＭ２０培养２代，再转为ＤＭＥＭ１０培养３
代，细胞生长速度正常，再转为 ＤＭＥＭ１０培养，隔
天换液，每４～５ｄ传代，传代比例１∶６。细胞达到
８０％汇合率后传代，用 ＤＭＥＭ１０培养液悬浮细胞
密度为１×１０５个／ｍＬ。向孔板的底室（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ
ｃｈａｍｂｅｒ，ＢＬ）加入１５００μＬ完全 ＤＭＥＭ１０培养液
（无细胞），向孔板的顶室（ａｐｉｃａｌｃｈａｍｂｅｒ，ＡＰ）加入
５００μＬ已充分混合的细胞悬液。第２天换ＡＰ侧液
和ＢＬ侧液，分别为５００μＬ和１５００μＬ；第３天到第
７天隔天换ＡＰ侧液和ＢＬ侧液，分别为５００μＬ和１
５００μＬ；第８天到第１７天每天换 ＡＰ侧液５００μＬ，
隔天换 ＢＬ侧液１５００μＬ；第１８天以后每天换 ＡＰ
侧液和ＢＬ侧液，分别为５００μＬ和１５００μＬ。本实
验使用Ｃａｃｏ２细胞代数为４５～６３代。
２．１．３　Ｃａｃｏ２细胞单层适用性的确认　按标准操
作程序［８］检查Ｃａｃｏ２细胞单层形态。
Ｃａｃｏ２细胞接种在六孔板上，按文献［１２，１３］
方法测定碱性磷酸酶活性。分别在接种第３天（细
胞铺满６０％～７０％）和第１４天用ＨＢＳＳ洗细胞单层
２次，用含钙 ９ｍｍｏｌ·Ｌ－１，镁 ４９ｍｍｏｌ·Ｌ－１和
０５％ Ｔｒｉｔｏｎ１００磷酸盐缓冲溶液溶解细胞，置冰浴
上１ｈ，在１２０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，取上清，按 Ｌｏｗｒｙ
法［１４］测定蛋白质含量。使用碱性磷酸酶试剂盒，测
定碱性磷酸酶的活性。
在ｔｒａｎｓｗｅｌ的 ＡＰ侧加入０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１普萘
洛尔（高渗透系数）或１ｍｍｏｌ·Ｌ－１阿替洛尔（低渗
透系数）的ＨＢＳＳ５００μＬ，ＢＬ侧加入ＨＢＳＳ１５００μＬ，
于３７℃水浴振摇温育１ｈ，收集 ＢＬ侧溶液，ＨＰＬＣ
分析透过量，计算表观渗透系数（ａｐｐａｒｅｎｔｐｅｒｍｅａｂｉｌ
ｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔ，Ｐａｐｐ）值。
２．１．４　受试化合物稳定性考察　将受试物按实验
设计的浓度和时间与 ＨＢＳＳ缓冲液于３７℃水浴摇
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床上温育，取出后在－２０℃冷冻保存，待测。
２．１．５　摄取、转运和外流实验　将 ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ
和ＨＰＰＡ分别溶于ＭｅＯＨ溶剂中，配制成５０μｍｏｌ·
Ｌ－１储备液，实验前以 ＨＢＳＳ稀释至所设计剂量浓
度。选取生长１９～２１ｄＣａｃｏ２细胞１２孔板，测定
跨上皮细胞电阻后，用３７℃ ＨＢＳＳ洗涤 ＡＰ侧和 ＢＬ
侧各３次，最后一次洗后在 ３７℃水浴上温育 ３０
ｍｉｎ，再次测定跨上皮细胞电阻以确定单层细胞的紧
密性与完整性。实验用上皮细胞电阻大于５００Ω·
ｃｍ－２。然后吸走ＡＰ侧和ＢＬ侧的ＨＢＳＳ，根据实验
设计，分别在细胞单层的ＡＰ侧和ＢＬ侧加入受试化
合物和ＨＢＳＳ（ＡＰ５００μＬ和 ＢＬ１５００μＬ）。ＡＰ侧
给药为摄取和转运实验；ＢＬ侧给药为外流实验。给
药后于恒温摇床（３７℃，５０ｒｐｍ）上温育，ＥＤＨＴＡ，
ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ的给药量皆为２０，３０，４０和５０μｍｏｌ
·Ｌ－１，ＭｅＯＨ终浓度小于４％。温育１８０ｍｉｎ，分别
收集ＡＰ侧或 ＢＬ侧的溶液，单孔取点，每点平行３
个孔。当ＡＰ侧给药时，给药端 ＡＰ侧取样４５０μＬ，
接受端ＢＬ侧取样１４００μＬ；当 ＢＬ侧给药时，给药
端ＢＬ侧取样 ４５０μＬ，接受端 ＡＰ侧取样 ４５０μＬ。
冷冻干燥，－２０℃保存，待测。
ＡＰ侧和 ＢＬ侧取样结束后，移走 ｔｒａｎｓｗｅｌ溶
液，以冷ＨＢＳＳ洗涤３次，冷冻干燥，于 －２０℃保存
１ｄ后取出，加入５００μＬ甲醇，于３７℃水浴摇床上
温育３０ｍｉｎ，取出甲醇液，即得细胞摄入的受试化合
物样品。挥干甲醇后－２０℃冷冻保存。
２．２　Ｐａｐｐ值计算和数据处理
见文献［７］。
３　结果
３．１　Ｃａｃｏ２细胞单层适用性和受试化合物稳定性
按标准操作程序［８］检查Ｃａｃｏ２细胞单层形态，
符合要求。蛋白质含量测定结果表明：Ｃａｃｏ２细胞
接种第３天其含量为３４５ｇ·Ｌ－１，第１４天为７６７
ｇ·Ｌ－１。碱性磷酸酶活性测定结果表明：Ｃａｃｏ２细
胞在接种第３天，细胞未完全汇合时，不能水解碱性
磷酸酶底物对硝基苯磷酸盐生成对硝基苯酚，显示
没有碱性磷酸酶的活性；第１４天的细胞完全汇合，
可以水解对硝基苯磷酸盐生成对硝基苯酚，具有碱
性磷酸酶活性，显示 Ｃａｃｏ２细胞在第１４天已经分
化。本实验所用普萘洛尔和阿替洛尔两种标准化合
物在Ｃａｃｏ２细胞单层的 Ｐａｐｐ值分别为１４５×１０
－５
ｃｍ·ｓ－１和４２２×１０－７ｃｍ·ｓ－１，与文献［１５，１６］值
相符，表明其有良好的完整性与转运能力。ＨＰＬＣ
测定结果表明，所有受试化合物在 ＨＢＳＳ缓冲液中
及３７℃条件下稳定。
３．２　ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ分析方法的建立
精密称取 ＥＤＨＴＡ５３２μｇ，用０８ｍＬＭｅＯＨ溶
解，再以ＨＢＳＳ稀释至２２ｍＬ，即得５０μｍｏｌ·Ｌ－１储
备液。再从中依次吸取１２５０，１０００，７５０，５００，１００，
２０μＬ，冷冻干燥，加入 ＭｅＯＨ溶解并定容至１ｍＬ，
各浓度点取２０μＬ进样分析，得峰面积（Ｙ）与浓度
（Ｘ，μｍｏｌ·Ｌ－１）的回归方程Ｙ＝４４６６８Ｘ－１００６
（ｒ＝０９９８２），线性范围２０～１２５０ｍｏｌ·Ｌ－１。
精密称取ＰＰＡＣ５３０μｇ，用０８ｍＬＭｅＯＨ溶解，
再以ＨＢＳＳ稀释至２２ｍＬ，得５０μｍｏｌ·Ｌ－１的储备
液。再从中依次吸取 １２５０，１０００，７５０，５００，７５和
３５μＬ，冷冻干燥，加入 ＭｅＯＨ溶解并定容至１ｍＬ，
各浓度点取２０μＬ进样分析，得峰面积（Ｙ）与浓度
（Ｘ，μｍｏｌ·Ｌ－１）的回归方程 Ｙ＝１６７８６Ｘ＋０１７
（ｒ＝０９９７４），线性范围３５～１２５０μｍｏｌ·Ｌ－１。
精密称取 ＨＰＰＡ５５０μｇ，用 ０８ｍＬＭｅＯＨ溶
解，再以ＨＢＳＳ稀释至２２ｍＬ，即得５０μｍｏｌ·Ｌ－１浓
度的储备液。再从中依次吸取 １２５０，１０００，７５０，
５００，１２５和１５μＬ，冷冻干燥，加入 ＭｅＯＨ溶解并定
容至１ｍＬ，各浓度点取２０μＬ进样分析，得到峰面
积（Ｙ）与浓度（Ｘ，μｍｏｌ·Ｌ－１）的回归方程 Ｙ＝
３４６７５Ｘ－９０５（ｒ＝０９９８７），线性范围为 １５～
１２５０μｍｏｌ·Ｌ－１。
３．３　回收率试验
ＡＰ侧给药，ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ的给药浓
度皆为３０，４０，５０μｍｏｌ·Ｌ－１，在３７℃，５０ｒｐｍ恒温
摇床温育。给药后１８０ｍｉｎ，取 ＡＰ侧液、ＢＬ侧液和
Ｃａｃｏ２细胞，按２．１．５项方法处理，按１．１．２ＨＰＬＣ
色谱条件项方法进行测定，计算 ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和
ＨＰＰＡ在ＡＰ侧液、ＢＬ侧液和Ｃａｃｏ２细胞中的量，结
果如表１。
　　ＢＬ侧给药，ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ的给药浓
度皆为３０，４０，５０μｍｏｌ·Ｌ－１。按ＡＰ侧给药同样方
法得到ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ在ＡＰ侧液、ＢＬ侧液
和Ｃａｃｏ２细胞中的量，结果如表２。
３．４　摄取转运实验
ＡＰ侧或ＢＬ侧给药，ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ的
给药浓度皆为２０，３０，４０，５０μｍｏｌ·Ｌ－１。温育１８０
ｍｉｎ后，分别取 ＡＰ侧或 ＢＬ侧和 ＢＬ侧或 ＡＰ侧液，
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　　表１　不同浓度ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ在ＡＰ侧
给药的回收率（珋ｘ±ｓ）
Ｃ０ａ
测试
部位
回收率
ＥＤＨＴＡ ＰＰＡＣ ＨＰＰＡ
２０ Ａｂ ６７０±００９ ５６３±０１４ １０４６±０１１
　 Ｂｃ ２７０±０１７ ２５６±００５ １００±００２
　 Ｃｄ ０４３±００３ Ｎ．Ｄ． ０１１±００１
　 Ｒｅ ９８２８±２９７ ８２１７±１９３ １１５５８±１４９
３０ Ａａ ８７７±０３７ ８３１±０１８ １４１８±０４１
　 Ｂｂ ３８５±０１７ ３５０±０１６ １１３±００９
　 Ｃｃ ０５６±００８ ０１５±００２ ０１２±００１
　 Ｒｄ ８７８８±４１３ ７９９６±２４４ １０２８４±３３９
４０ Ａａ １０１０±０５１ １０９８±０３５ １７１８±０３９
　 Ｂｂ ４２６±０１８ ４６１±００７ １６９±０１３
　 Ｃｃ ０９０±００４ ０２９±００２ ００９±００２
　 Ｒｄ ７６３２±３６３ ７９６４±２２４ ９４７５±２６８
５０ Ａａ １３３２±０８２ ２００４±０５４ ２１７１±１２６
　 Ｂｂ ５６７±０１９ ６２８±０３６ １５３±０１３
　 Ｃｃ １１１±０１１ ０８２±０００ ００８±００１
　 Ｒｄ ８０４２±４４５ １０８８６±３５９ ９３２５±５６０
　　注：①所有试验的转运时间为１８０ｍｉｎ；单孔取点，每点平行３孔；
②ａＣ０为受试化合物初始浓度，单位为μｍｏｌ·Ｌ－１。ｂＡ为转运１８０ｍｉｎ
时ＡＰ室液受试化合物浓度，单位为μｍｏｌ·Ｌ－１。ｃＢ为转运１８０ｍｉｎ时
ＢＬ室液中受试化合物浓度，单位为μｍｏｌ·Ｌ－１。ｄＣ为转运１８０ｍｉｎ时
Ｃａｃｏ２细胞中蓄积的受试化合物浓度，单位为μｍｏｌ·Ｌ－１。ｅＲ为回收
率；Ｒ＝（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）／（Ｃ０×０５），式中０５为ＡＰ室体积，单位为ｍＬ。
Ｎ．Ｄ．：没有检测到（表２同）。
表２　不同浓度ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ在ＢＬ
侧给药的回收率（珋ｘ±ｓ）
Ｃ０ａ
测试
部位
回收率
ＥＤＨＴＡ ＰＰＡＣ ＨＰＰＡ
２０ Ａｂ ４２４±００８ ４５４±００７ ２１０±００３
　 Ｂｃ ２５３９±０３４ ２２９４±０４６ ２９９３±０４６
　 Ｃｄ ０５６±０００ Ｎ．Ｄ． ０１２±００１
　 Ｒｅ １００６２±１４１ ７６６７±１７７ １０７０８±１６８
３０ Ａｂ ６８０±０１５ ６６７±０２１ ２７６±０１２
　 Ｂｃ ３６１２±０８７ ３２９７±２２１ ４１５０±１７７
　 Ｃｄ ０７２±００８ ０２９±００２ ０１１±００１
　 Ｒｅ ９６９７±２４７ ８８９９±８１６ ９８５３±４２３
４０ Ａｂ ８０４±０３５ ９０３±０１０ ４２１±００９
　 Ｂｃ ４１３１±０６９ ４４５６±０８４ ５２５９±２０１
　 Ｃｄ １１０±００３ ０６１±００２ ０１０±００２
　 Ｒｅ ８４０９±１７９ ９０５８±１６０ ９４７６±３５５
５０ Ａｂ １０９６±０４４ １２６４±０３６ ４７１±０２１
　 Ｂｃ ５６２０±２１６ ７４２１±６７７ ６５８９±２５１
　 Ｃｄ １３５±０１０ ２１７±００２ ０１１±００１
　 Ｒｅ ９１３５±３６０ １１９０４±９５５ ９４２３±３６５
按２．１．５项处理，按１．２ＨＰＬＣ色谱条件项方法进
行测定，按２．２项方法处理数据和计算 Ｐａｐｐ值，ＥＤ
ＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ从ＡＰ侧到ＢＬ侧和从ＢＬ侧到
ＡＰ侧方向转运的Ｐａｐｐ值如表３，转运率如图２，３。
表３　ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ从ＡＰ侧到ＢＬ侧和从ＢＬ侧到ＡＰ侧方向转运的Ｐａｐｐ值（１０
－６ｃｍ·ｓ－１）（珋ｘ±ｓ）
化合物 转运方向 ２０μｍｏｌ·Ｌ－１ ３０μｍｏｌ·Ｌ－１ ４０μｍｏｌ·Ｌ－１ ５０μｍｏｌ·Ｌ－１ Ａｖｅｒａｇｅ ＰＡＰＢＬ／ＰＢＬＡＰ
ＥＤＨＴＡ ＡＰ→ＢＬ １１１６±０７１ １０６２±０４７ ８８１±０３８ ９３８±０３１ ９９９±１０８ ０５６
　 ＢＬ→ＡＰ １７５３±０３２ １８７５±０４２ １６６２±０７２ １８１３±０１３ １７７６±０９１ 　
ＰＰＡＣ ＡＰ→ＢＬ １０６１±０２２ ９６６±０４４ ９５６±０１６ １０４１±０５９ １００６±０５３ ０５２
　 ＢＬ→ＡＰ １８８２±０２９ １８４３±０５７ １８７２±０２０ ２０９６±０５９ １９２３±１１６ 　
ＨＰＰＡ ＡＰ→ＢＬ ４１２±００１ ３１２±０２３ ３４９±０２７ ２５４±０２１ ３３２±０６６ ０４１
　 ＢＬ→ＡＰ ８６７±０１３ ７６０±０３３ ８６９±０２０ ７７９±０３５ ８１９±０５７
图２　不同浓度ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ从ＡＰ到
ＢＬ方向的转运率
４　讨论
ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ在 Ｃａｃｏ２细胞单层模
型中的ＨＰＬＣ峰面积与质量浓度线性关系良好。应
用该方法分别测定了 ＡＰ侧或 ＢＬ侧给药转运
　　　
图３　不同浓度ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ从ＢＬ到
ＡＰ方向的转运率
１８０ｍｉｎ时间点ＡＰ侧液和ＢＬ侧液中原形化合物的
总残存量或总回收率（ＡＰ侧液、ＢＬ侧液和 Ｃａｃｏ２
细胞中存在量的总和）。在从ＡＰ侧到ＢＬ侧方向转
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运试验中，ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ在给药浓度 ２０
μｍｏｌ·Ｌ－１情况下的总回收率分别为 ９８２８％，
８２１７％和 １１５５８％；３０μｍｏｌ· Ｌ－１时分别为
８７８８％，７９９６％和１０２８４％；４０μｍｏｌ·Ｌ－１时分别
为７６３２％，７９６４％和９４７５％；５０μｍｏｌ·Ｌ－１时分
别为８０４２，１０８８６％和９３２５％。４个浓度下的平
均总回收率分别为 ８５７３％，８７６６％和 １０１６１％，
由于定量分析的是原形化合物的含量，提示 ＨＰＰＡ
在Ｃａｃｏ２细胞单层模型转运过程中的代谢稳定性
比ＥＤＨＴＡ和ＰＰＡＣ高；３个化合物中，ＥＤＨＴＡ最不
稳定，这与它的结构性质相吻合。由表１数据计算
得出３个化合物在转运的１８０ｍｉｎ时点在Ｃａｃｏ２细
胞中滞留量分别占 ＡＰ侧、ＢＬ侧和细胞内蓄积总合
的５０１％，１５３％和０６４％，说明它们在 Ｃａｃｏ２细
胞内基本无蓄积或仅有少量蓄积，对试验结果分析
不会产生影响。在从 ＢＬ侧到 ＡＰ侧方向转运试验
中，４个浓度下的 ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ的平均总
回收率分别为９３２６％，９３８２％和９８６５％，亦提示
ＥＤＨＴＡ具有代谢不稳定性。从表２数据计算的细
胞中蓄积性结果，亦说明它们在 Ｃａｃｏ２细胞内基本
无蓄积或仅有少量蓄积，对试验结果分析不会产生
影响。
在本试验条件下，在 Ｃａｃｏ２细胞单层模型呈良
好转运的阳性药普萘洛尔的 Ｐａｐｐ为１４５×１０
－５ｃｍ
·ｓ－１，呈难转运的阳性对照药阿替洛尔的 Ｐａｐｐ为
４２２×１０－７ｃｍ·ｓ－１。与表３结果比较，ＥＤＨＴＡ和
ＰＰＡＣ的双向转运 Ｐａｐｐ与普萘洛尔的基本上处于同
一数量级，推断它们皆为良好转运的化合物［１７］。
ＨＰＰＡ的Ｐａｐｐ处于普萘洛尔和阿替洛尔的之间，推断
ＨＰＰＡ属于中等程度吸收的化合物［１７］。
从图２和３不同浓度 ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ
在两个方向的转运率结果，在本试验２０～５０μｍｏｌ
·Ｌ－１浓度范围内，随３个化合物浓度的增加，转运
率呈线性增加，说明它们在 Ｃａｃｏ２细胞单层模型中
的转运途径可能主要为透细胞被动转运。
表 ３中，ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ的 ＰａｐｐＡＰＢＬ／
ＰａｐｐＢＬＡＰ比值分别为０５６，０５２和０４１，即：外流分
别是摄取的１７８，１９１和２４７倍，提示它们在 Ｃａ
ｃｏ２细胞单层模型中的转运可能存在外流机制，尤
其是ＨＰＰＡ。图２和３所示的转运率趋势支持这一
结论。在结构与转运效应关系上，ＰＰＡＣ和 ＥＤＨＴＡ
母核结构相同，唯一的区别是前者的Ｃ３结合酮基，
后者的Ｃ３结合羟基，后者的极性大于前者（图１），
但两者的Ｐａｐｐ值几乎相同（表３），由此推断 Ｃ３结
合羟基还是酮基对转运效应基本无影响。在 ＰＰＡＣ
和ＨＰＰＡ，两者母核结构相同，ＨＰＰＡ是ＰＰＡＣ的Ｃ６
羟基化衍生物（图１），ＨＰＰＡ的极性大于 ＰＰＡＣ。如
表３，在从 ＡＰ侧到 ＢＬ侧方向转运上，ＰＰＡＣ的 Ｐａｐｐ
值是ＨＰＰＡ的２７４～４１０倍；在从 ＢＬ侧到 ＡＰ侧
方向转运上，ＰＰＡＣ的Ｐａｐｐ值是ＨＰＰＡ的２１５～２５６
倍，呈现出极性越弱，Ｐａｐｐ值越大，符合药物在小肠
被动吸收的一般性规律。由此推断：Ｃ６结合羟基，
对转运效应影响大。辛醇／水分配系数（ｌｏｇＰ）常常
是判断化合物亲脂性强弱的一个重要参数，应用
ＣｈｅｍＤｒａｗＵｌｔｒａ６０软件获得了 ＥＤＨＴＡ、ＰＰＡＣ和
ＨＰＰＡ的 ＣｌｏｇＰ（计算辛醇／水分配系数）分别为
７６３７，７２３５和 ５８７０，ＥＤＨＴＡ和 ＰＰＡＣ之间无显
著性差异，但它们与 ＨＰＰＡ之间有显著性差异，即
ＥＤＨＴＡ和ＰＰＡＣ亲脂性相近，ＨＰＰＡ亲脂性差。从
表３，ＥＤＨＴＡ、ＰＰＡＣ和ＨＰＰＡ从ＡＰ到ＢＬ方向转运
的Ｐａｐｐ值分别为（９９９±１０８），（１００６±０５３）和
（３３２±０６６）×１０－６ｃｍ·ｓ－１，前两者之间无显著
性差异，前两者与后者之间皆有显著性差异（Ｐ＜
００５）。理论计算与实验结果吻合。从这些结果可
以预测 ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰＰＡ的亲脂性强弱是影
响其转运效应的主要因素。
茯苓中含有 ４０余种羊毛甾烯型三萜类化合
物［１８］，利用Ｃａｃｏ２细胞单层模型具有快速、高通量
筛选的特性来研究这些单体化合物的肠吸收，为其
在肠吸收过程中的相互作用的系统性深入研究等奠
定了基础。迄今，文献中未见 ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣ和 ＨＰ
ＰＡ口服生物利用度和药代动力学的报道，本项研究
为今后开展这方面的工作和阐明茯苓及其含有茯苓
的中药复方的药效物质基础提供了方法学［２］。
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ｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ（Ｃａｃｏ２）ｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏ
ＺＨＥＮＧＹａｎ，ＹＡＮＧＸｉｕｗｅｉ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮａｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｍｉｍｅｔｉｃＤｒｕｇｓ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮａｔｕｒａｌＭｅｄｉｃｉｎｅｓ，Ｓｃｈｏｏｌｏｆ
ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆ３ｅｐｉｄｅｈｙｄｒｏｔｕｍｕｌｏｓｉｃａｃｉｄ（ＥＤＨＴＡ），ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃａｃｉｄＣ（ＰＰＡＣ）ａｎｄ
６αｈｙｄｒｏｘｙｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃａｃｉｄＣ（ＨＰＰＡ）ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍｏｆＰｏｒｉａｃｏｃｏｓ．Ｉｎｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｂｙｕｓｉｎｇ
Ｃａｃｏ２（ｔｈｅｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｉｃａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｉｎｅｓ）ｃｅｌｓｍｏｎｏｌａｙｅｒａｓａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｍｏｄｅｌ，ｔｈｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＥＤ
ＨＴＡ，ＰＰＡＣａｎｄＨＰＰＡｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｆｒｏｍａｐｉｃａｌｓｉｄｅ（ＡＰｓｉｄｅ）ｔｏｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｓｉｄｅ（ＢＬｓｉｄｅ）ｏｒｆｒｏｍＢＬｓｉｄｅｔｏＡＰｓｉｄｅ．Ｔｈｅｔｈｒｅｅ
ｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈＵＶｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
ｐａｒａｍｅｔｅｒｓａｎｄａｐｐａｒｅｎｔｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｓ（Ｐａｐｐ）ｗｅｒｅｔｈｅｎｃａｌｃｕｌａｔｅｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌａｎｄａｔｅｎｏｌｏｌ，
ｗｈｉｃｈａｒｅｔｈｅｔｒａｎｓｃｅｌｕｌａｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｍａｒｋｅｒａｎｄａｓａｃｏｎｔｒｏｌｓｕｂｓｔａｎｃｅｆｏｒｈｉｇｈａｎｄｐｏｏｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅＰａｐｐ
ｖａｌｕｅｓｏｆＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣａｎｄＨＰＰＡｗｅｒｅ（９９９±１０８）×１０－６，（１００６±０５３）×１０－６ａｎｄ（３３２±０６６）×１０－６ｃｍ·ｓ－１ｆｒｏｍ
ＡＰｓｉｄｅｔｏＢＬｓｉｄｅ，ａｎｄ（１７７６±０９１）×１０－６，（１９２３±１１６）×１０－６ａｎｄ（８１９±０５７）×１０－６ｃｍ·ｓ－１ｆｒｏｍＢＬｓｉｄｅｔｏＡＰ
ｓｉｄｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅＰａｐｐｖａｌｕｅｗａｓ１４５×１０
－５ｃｍ·ｓ－１ｆｏｒｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌａｎｄ４２２×１０－７ｃｍ
·ｓ－１ｆｏｒａｔｅｎｏｌｏｌ．ＴｈｅＰａｐｐｖａｌｕｅｓｏｆＥＤＨＴＡａｎｄＰＰＡＣｗｅｒｅａｔａｎｅａｒｌｙｓａｍｅｍａｇｎｉｔｕｄｅｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ，ａｎｄＨＰＰＡｌｉｅｄｂｅ
ｔｗｅｅｎｔｈｏｓｅｏｆｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌａｎｄａｔｅｎｏｌｏｌ．Ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄ，ｔｈｅｅｆｌｕｘｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣａｎｄＨＰＰＡｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒ１７８，１９１
ａｎｄ２４７ｔｉｍｅｓｍｏｒｅｔｈａｎｉｔｓｉｎｆｌｕｘｔｒａｎｓｐｏｒｔｗｉｔｈ０５６，０５２ａｎｄ０４１ｒａｔｅｏｆＰａｐｐＡ→Ｂ／ＰａｐｐＢ→Ａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣａｎｄ
ＨＰＰＡｃａｎｂｅａｂｓｏｒｂｅｄａｃｒｏｓｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ，ａｍｏｎｇＥＤＨＴＡａｎｄＰＰＡＣｗｉｌｂｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ．ＨＰＰＡｗｉｌｂｅｍｏｄｅｒａｔｅｌｙａｂ
ｓｏｒｂｅｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＥＤＨＴＡ，ＰＰＡＣａｎｄＨＰＰＡｍａｙｈａｖｅｂｅｅｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｅｆｌｕｘｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎＣａｃｏ２ｃｅｌｓｍｏｎｏｌａｙｅｒｓｍｏｄｅｌｆｒｏｍｔｈｅ
ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｔｏａｐｉｃａｌｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｃａｃｏ２ｃｅｌｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍｏｆＰｏｒｉａｃｏｃｏｓ；３ｅｐｉｄｅｈｙｄｒｏｔｕｍｕｌｏｓｉｃａｃｉｄ；ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃａｃｉｄＣ；６αｈｙｄｒｏｘｙ
ｐｏｌｙｐｏｒｅｎｉｃａｃｉｄＣ；ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ［责任编辑　古云侠］
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