全 文 ： ·1076· Chin JMAP, 2011 December, Vol.28 No.12 中国现代应用药学 2011 年 12 月第 28 卷第 12 期
主要是 COX-1 衍生物。吲哚美辛同时抑制 COX-1
和 COX-2，使内源性 PG 合成受阻，胃肠道黏膜
中 PG 含量减少，保护作用削弱，导致胃肠道黏膜
对外来攻击因子的防御能力降低。但是吲哚美辛
对胃功能本身的影响则未见报道，本研究就吲哚
美辛对大鼠胃功能的影响进行了探讨，以便进一
步研究其胃肠毒性机制。
研究结果表明，吲哚美辛能显著增加胃液分
泌量、增加胃液总酸度及胃酸分泌速度，显著促
进胃酸分泌，增加胃蛋白酶活力。而胃酸分泌的
增加及胃蛋白酶活力增强，会进一步造成胃粘膜
损伤。而吲哚美辛对大鼠胃功能的影响可能主要
与其促进胃秘素分泌有关。提示临床应用吲哚美
辛等非甾体抗炎药时配合使用抑酸药并于餐后服
用可能能减少非甾体抗炎药的不良反应。
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收稿日期：2011-04-22



矢车菊黄素在 Caco-2 细胞模型中的吸收机制研究

付达华 1，李妍 2，王二丽 1，郭素华 1(1.漳州卫生职业学院药学系，福建 漳州 363000；2.中国医学科学院&中国协和医科大学医药
生物技术研究所，北京 100050)

摘要：目的 研究矢车菊黄素(centaureidin)在 Caco-2 细胞单层模型中的吸收机制。方法 以 HPLC 分析矢车菊黄素浓度，
用 Caco-2 细胞单层模型评价吸收时间、药物浓度、介质 pH 值、抑制剂等对矢车菊黄素吸收的影响，研究矢车菊黄素的
吸收机制，计算表观渗透系数(apparent permeability coefficient, Papp)。结果 药物的吸收与药物浓度和吸收时间正相关；
弱酸性介质条件下有利于药物的吸收；2,4-二硝基酚(DNP)对药物吸收无影响，但异博定(verapamil)可增加药物的吸收；
从肠腔侧到基底侧的转运小于基底侧到肠腔侧的转运。结论 矢车菊黄素在 Caco-2 细胞模型中的吸收主要是被动转运，
受 P-糖蛋白的外排作用。
关键词：矢车菊黄素；Caco-2 细胞单层；跨膜转运；表观渗透系数；P-糖蛋白
中图分类号：R965.1 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2011)12-1076-05

Transepithelial Transport of Centaureidin Across Caco-2 Cell Monolayers

FU Dahua1, LI Yan2, WANG Erli1, GUO Suhua1(1.Zhangzhou Health Vocational College, Zhangzhou 363000, China;
2.Institute of Medical Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050,
China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the transepithelial transport of centaureidin across Caco-2 cell monolayers.
METHODS The permeated amounts of centaureidin across Caco-2 cell momnolayers were measured by HPLC to calculate the
permeation rate and the apparent permeability coefficient (Papp), based on the effect of absorption time, drug concentration, pH in
apical side, and inhibitors, the Papp was determined. RESULTS Transport of centaureidin was concentration-dependent and
time-dependent and nonsatuable. The acidic pH in apical side conduced to transepithelial transport of centaureidin. Though
2,4-dinitrophenol had no effect on transport of centaureidin, verapamil improved it. And the apical-to-basolateral Papp was less
基金项目：福建省教育厅基金课题(JB10248)
作者简介：付达华，男，博士 Tel: (0596)2559589 E-mail: fdh1002@hotmail.com
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2011.12.004
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than the basolateral-to-apical Papp. CONCLUSION Transport of centaureidin across Caco-2 cell monolayers is via passive
diffusion with efflux by P-glycoprotein.
KEY WORDS: centaureidin; Caco-2 cell monolayers; transport; apparent permeability coefficient(Papp); P-glycoprotein

矢车菊黄素为类黄酮化合物，可从矢车菊、
小白菊、银叶蓍草、欧洲蓍草等多种菊科植物中
分离提取。该类黄酮具抗炎[1]、抗氧化及清除氧自
由基[2]、有丝分裂阻滞[3]、抗感染等作用[4]；除上
述药理作用外，矢车菊黄素还具有抗肿瘤活性。
Trifunovic 等[5]报道矢车菊黄素对 HeLa、Fem-X 和
K562 等肿瘤细胞具增殖抑制作用，其 IC50 分别为
2.55，3.56，5.37 mol·L−1，但对正常的人细胞(PBMC)
毒性作用很小(IC50为 40.82 mol·L−1。Csupor-Löffler
等[6]也报道矢车菊黄素对 MCF-7 细胞具增殖抑制
作用，IC50 为 0.123 mol·L−1。其药理作用可能是通
过增加 IFN-γ 的表达和减少肿瘤坏死因子(TNF-α)
的积累而产生的[7]。上述研究结果表明矢车菊黄素
具备成为新型强效抗肿瘤药物的潜能。鉴于此，
研究矢车菊黄素在体内的吸收机制颇为重要，可
以为其进一步的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
矢车菊黄素(购于百灵威化学试剂有限公司，
批号：03356-22B，规格：10 mg·支−1)，以 DMSO
配制成 20 mg·mL−1 的储备液，临用前以空白 HBSS
稀释成不同浓度的矢车菊黄素工作液。
DMEM 培养基(Hyclone)；胎牛血清(FBS，杭
州四季青)；非必需氨基酸、胰蛋白酶、HBSS(Hanks
平衡缓冲盐溶液)均为 Amresco 公司产品；甲醇(天
津南开，色谱纯)；MTT(Sigma)；其余试剂均为国
产分析纯。
1.2 仪器与设备
LC-10ATvp 高效液相色谱仪 (日本岛津 )；
Diamonsil C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
SW-CJ-2F 型超净工作台(苏州苏净)；MDF-75 型细
胞培养箱(日本三洋)；TGL-16M 高速冷冻离心机
(湖南湘仪 )；细胞培养板均为 Costar 产品；
TranswellTM 细胞培养小室 (直径 12 mm，膜孔 0.3
μm，Millipore)；EVOM 电阻仪(WPI)；笔式酸度
计(Sciencetool)。
1.3 Caco-2 细胞培养
Caco-2 细胞常规培养于 37 ℃、5% CO2、相
对湿度为 90%的培养箱中，采用 DMEM 高糖培养
基(培养基中含 10% FBS、1% 非必需氨基酸、1%
丙酮酸钠、1% 谷氨酰胺、1%青-链霉素)。细胞达
80%融合时按 1∶3 的比例传代，中间换液一次。
取代次在 40~55 代之间的细胞用于实验。按约 1×
105 个·孔−1 的密度接种于细胞培养小室的聚碳酸
酯膜上，并将培养小室置于加有培养基的 12 孔细
胞培养板中以同样的条件培养，每 3 d 换液一次，
一周后每天换液。培养 19~21 d 后观察，细胞完全
汇合并分化，形成紧密单层，以 EVOM 电阻仪测
定跨膜电阻，满足跨膜电阻>500 Ω·cm−2 时即可用
于细胞跨膜转运实验[8-9]。
1.4 MTT 法测定矢车菊黄素的细胞毒作用
将对数生长期的 Caco-2 细胞以 0.25%胰蛋白
酶消化至细胞脱落，以 DMEM 培养基终止消化并
调整细胞浓度为 3×104 个·mL−1。于 96 孔板中加
入调整浓度后的细胞悬液，每孔 180 μL。将 96 孔
板置于培养箱中培养过夜，使细胞贴壁，按常规
MTT 设计加入不同浓度的矢车菊黄素工作液(药物
终浓度分别为 10−4，10−5，10−6，10−7，10−8 mol·L−1)，
每孔 20 μL，每个浓度设立 3 个重复孔，并设立空
白对照组和 0.5% DMSO 对照组。药物作用 48 h
后，于显微镜下观察各孔细胞形态，并于每孔中
加入 20 μL MTT，继续培养 4 h。取出 96 孔板，
小心吸去各孔内液体后，每孔中加入 150 μL
DMSO，平板摇床震摇 10 min 使紫色小颗粒溶解，
平板读数计测定各孔的光吸收，波长为 570 nm。记
录结果，按照下列公式计算各浓度组细胞存活率：
细胞存活率/%= (A 加药组−A 本底)/(A 空白对照组−A 本底)×100%；
细胞增殖抑制率/%=100%−细胞存活率/%。以细胞
增殖抑制率为纵坐标，药物浓度的负对数为横坐
标，OriginPro 7.5 软件拟合细胞生长抑制曲线，并
计算矢车菊黄素的半数抑制浓度(IC50)和拟合曲线
的拐点值，确定矢车菊黄素对 Caco-2 细胞的安全
浓度范围。
1.5 矢车菊黄素的测定方法
采用高效液相色谱法测定矢车菊黄素浓度[3]。
流动相为水︰乙腈＝7︰3；流速为 1 mL·min−1；检
测波长为 351 nm，Diamonsil C18 色谱柱(250
mm×4.6 mm，5 μm)。
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1.6 药物的转运实验
取跨膜电阻＞500 Ω·cm−2的培养小室，以空白
HBSS孵育10 min，并用空白HBSS洗涤3次以去除
细胞单层肠腔侧(AP)和基底侧(BL)表面的杂质。测
定跨膜电阻，符合条件者进行下一步实验。吸去
细胞单层两侧的HBSS，根据实验设计，分别加入
不同浓度的矢车菊黄素工作液或空白HBSS。对于
吸收转运实验(从AP侧到BL侧)：将0.5 mL矢车菊
黄素工作液加到肠腔侧(AP侧)作为供给液，同时在
基底侧(BL侧)加入1.5 mL空白HBSS作为接收液。
对于外排实验(从BL侧到AP侧)：将1.5 mL矢车菊
黄素工作液加到BL侧作为供给液，同时在AP侧加
入0.5 mL空白HBSS作为接收液。将培养板置于37
℃恒温摇床上孵育。根据实验设计于接收端取样，
每次取样100 μL，保存于−20 ℃冰箱中备用，同时
补充100 μL空白HBSS。HPLC测定样品中矢车菊黄
素的浓度，根据下列公式计算表观渗透系数
(apparent permeability coefficient，Papp)。分别考查
吸收时间、药物浓度、介质pH值、抑制剂等对药
物吸收转运的影响。Papp = (dQ/dt)/(A×C0)，其中
dQ/dt为单位时间药物转运量(μmol·s−1)，A为转运
膜的面积 (cm2)，C0为矢车菊黄素的初始浓度
(μmol·L−1)。
1.7 统计学分析
实验数据以 sx ± 表示，以SPSS 13.0软件进行
F检验，α=0.05为检验标准，以P<0.05为具有统计
学差异。
2 结果
2.1 矢车菊黄素的标准曲线
以空白HBSS配制浓度分别为0.1，0.5，2，10，
50，100，200 μmol·L−1的矢车菊黄素工作液，分别
精密吸取10 μL，进样，按“1.5”项下色谱条件下
测定峰面积。以浓度(X)对峰面积(Y)进行作图，经拟
合得直线回归方程Y =7.462 3 X + 0.447 1(r=0.999 8)，
线性范围为0.5~200 μmol·L−1。
2.2 矢车菊黄素对Caco-2细胞的增殖抑制作用
以细胞增殖抑制率为纵坐标，药物浓度的负
对数为横坐标，经OriginPro 7.5软件拟合后，细胞
增殖抑制曲线见图1。
由结果可知，当药物浓度达一定数值时，
Caco-2细胞的存活率随药物浓度的增加而下降，呈
剂量依赖性。经拟合，IC50为58.38 μmol·L−1。当药
物浓度小于33 μmol·L−1时，对细胞增殖几乎无影
响。以浓度为2，10，25，50，100 μmol·L−1 的矢
车菊黄素工作液分别作用于细胞，用药 48 h后观
察细胞形态。可见药物浓度<25 μmol·L−1时，细胞
形态均无明显变化；随着药物浓度的增加，细胞间
紧密连接破坏，细胞变圆、皱缩，死细胞逐渐增多。
故选定药物浓度≤25 μmol·L−1为安全用药范围。

图1 矢车菊黄素对Caco-2细胞的增殖抑制作用
Fig 1 The inhibitory effect of centaureidin on growth of
Caco-2 cells
2.3 药物吸收实验结果
2.3.1 药物吸收与吸收时间的关系 于 AP 侧加
入不同浓度的矢车菊黄素工作液，分别于5，10，
20，30，40，50，60，90 min 自 BL 侧取样分析，
结果见图2。如结果所示，在30 min内药物吸收随
时间近似线性增加(r=0.998 3)，30 min即达峰值，
此后吸收无明显变化，因此在以下药物吸收实验
中，取样时间定为30 min。

图2 药物吸收与吸收时间的关系(n=5)
Fig 2 The relationship between centaureidin absorption and
absorption time(n=5)
2.3.2 药物浓度对吸收的影响 将浓度分别为2，
10，25 μmol·L−1的矢车菊黄素工作液作用于Caco-2
细胞，第30分钟取样，测定细胞单层对不同浓度
矢车菊黄素的转运速率。转运速率随药物浓度呈
线性增加，Y=0.663 9 X−0.131 9 (r=0.999 4)，Y为
转运速率，单位为×10−6 nmol·s−1·cm−2)，X为矢车
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菊黄素浓度，提示矢车菊黄素的吸收可能为被动
吸收。
2.3.3 介质pH值对药物转运的影响 分别将AP
侧pH值调为5.0，6.0，7.4，测定Caco-2细胞单层对
矢车菊黄素的跨膜转运速率，结果见图3。统计结
果表明，当介质pH值为5.0和6.0时，两组间跨膜转
运速率无统计学差异(P＞0.05)；但当介质pH值为
7.4时，转运速率降低，与酸性环境介质相比较，
具有统计学差异(P＜0.05)。表明介质pH对矢车菊
黄素的吸收有影响，在酸性介质条件下吸收较好。
因此实验时将介质pH值控制在pH=6。

图3 pH值对药物跨膜转运的影响(n=5)
与其他两组比较，1)P＜0.05
Fig 3 The effect of pH in apical side on drug transport
across Caco-2 monolayers(n=5)
Compared with the other two groups, 1)P＜0.05
2.3.4 抑制剂对药物跨膜转运的影响 设立低、
中、高3个浓度组(矢车菊黄素浓度分别为2，10，
25 μmol·L−1)，分别考察异博定、2,4-二硝基酚(DNP)
对药物跨膜转运的影响，结果见图4。异博定的存
在能增加细胞对矢车菊黄素的吸收，尤其是在药
物浓度较低(2 μmol·L−1)时，增加的比例约为60%，
提示可能存在P-糖蛋白的外排作用；DNP对矢车菊
黄素的吸收几乎无影响，提示其吸收过程可能不
存在耗能的主动吸收过程。
2.4 Papp
分别将供给侧药物浓度调整为 2， 10，
25 μmol·L−1，30 min 后于接收端取样分析。分别
计算从AP侧到BL侧(吸收)的Papp(AP→BL)和从BL侧
到AP侧(外排)的Papp(BL→AP)，结果见表 1。结果表
明从AP侧到BL侧的Papp均值为 (0.584±0.106)×
10−6 cm·s−1，从BL侧到AP侧的Papp均值为(2.279±
0.233)×10−6 cm·s−1；从BL侧到AP侧的转运快于相
反方向。

图4 抑制剂对药物吸收的影响(n=5)
与矢车菊黄素组相比，1)P＜0.05
Fig 4 The effect of different inhibitors on drug transport
across Caco-2 monolayers(n=5)
Compared with centaureidin group, 1)P＜0.05
表 1 不同浓度矢车菊黄素双向转运的表观渗透系数
Tab 1 The Papp of bidirectional transport of centaureidin
with different concentrations
组别 药物浓度/
μmol·L−1
Papp(AP→BL)/
×10−6 cm·s−1
Papp(BL→AP)/
×10−6 cm·s−1
Papp(BL→AP)/
Papp(AP→BL)
低浓度组 2 0.744±0.165 3.431±0.122 4.49
中浓度组 10 0.525±0.117 1.833±0.204 3.49
高浓度组 25 0.483±0.076 1.662±0.093 3.44
平均 0.584±0.106 2.279±0.233 3.81
3 讨论
经过 20 多年的研究和应用，Caco-2 细胞单层
模型已经成为研究药物吸收和转运机制的有效手
段，不仅如此，Caco-2 细胞模型已被美国 FDA 批
准成为药物筛选模型。Caco-2 细胞来源于人的结
肠腺癌组织，成熟的 Caco-2 细胞能形成微绒毛结
构，也能表达特异底物的水解酶和 ATP 依赖的载
体，从而表现出与肠上皮细胞在形态学与生物学
上的相似性，药物通过 Caco-2 细胞单层的跨膜转
运类似于体内肠粘膜上皮。研究抗肿瘤药物的吸
收与转运机制时，如果药物浓度过高，药物对细
胞的细胞毒作用会造成细胞损伤，从而导致实验
结果不可信。本研究首先采用 MTT 方法确定矢车
菊黄素的半数抑制浓度(IC50)，在 IC50 值以下选择
几个浓度值，通过细胞形态学及 MTT 方法选定药
物的安全浓度为≤25 μmol·L−1，并在此浓度范围内
进行药物吸收和转运机制研究。
本研究考查了吸收时间、药物浓度、介质 pH
值、抑制剂等因素对矢车菊黄素吸收的影响。结
果表明矢车菊黄素主要是通过被动扩散的方式被
Caco-2 细胞单层吸收转运的，可能未受到主动转
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运载体的介导。主要证据有二：首先，矢车菊黄
素的吸收随药物浓度呈线性增加，未表现出达到
饱和状态的特性。如果 Caco-2 细胞对该药物的摄
取是经过某种载体介导的，则药物的摄取应随着
药物浓度的增加呈非线性增加，且在高浓度时达
饱和状态。其次，细胞对药物的摄取不受 DNP 的
影响。DNP 为代谢抑制剂，需要消耗能量的主动
运输过程易受该抑制剂的影响；但实验结果显示
该抑制剂不影响细胞对矢车菊黄素摄取的影响，
排除了矢车菊黄素主动转运的可能性。研究结果
还表明矢车菊黄素的吸收受 P-糖蛋白的外排作
用。P-糖蛋白广泛分布在人体的胃肠道上皮细胞、
肝细胞、肾、血脑屏障的内皮细胞等，主要功能
是外排各种异物，保护机体不受外来异物的侵袭。
在小肠上皮细胞中，P-糖蛋白分布在 AP 侧的细胞
膜上。常用的 P-糖蛋白抑制剂有两种：环孢霉素
A(cyclosporine A)和异搏定。本研究中异博定的使
用能明显增加细胞对矢车菊黄素的摄取，药物浓
度较低时可增加约 60%的摄取，证明存在着 P-糖
蛋白对矢车菊黄素的外排作用。研究结果还表明
Caco-2 细胞对矢车菊黄素的吸收受肠腔侧介质酸
碱度的影响，偏酸性环境利于药物的摄取。这可
能是由于矢车菊黄素分子中存在着酸性的酚羟
基，偏酸性环境有利于保持药物的分子状态，偏
碱性环境则易使酚羟基解离，携带一定的电荷，
不易透过细胞膜进入细胞。
本模型中矢车菊黄素从 AP 侧到 BL 侧的 Papp
为(0.584±0.106)×10−6 cm·s−1，按照 Papp＜1×10−6
cm·s−1 为不易透过细胞单层的标准 (不易透过
Caco-2 细胞单层的阳性对照药物阿替洛尔的 Papp
为 0.277×10−6 cm·s−1)，推测该药物在肠道内的吸收
较差，生物利用度较低。
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收稿日期：2011-03-07



芦荟多糖增强顺铂对肺腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

刘雪花 1，董琳 2，侯小燕 1，庄英帜 1*(1.南华大学附属第一医院肿瘤内科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学肿瘤研究所，湖南 衡
阳 421001)

摘要：目的 观察芦荟多糖(Aloe polysaccharide，AP)和顺铂(DDP)合用对人肺腺癌 A549 细胞裸小鼠移植瘤生长的抑制作
用，并初步探讨其作用机制。方法 采用 A549 细胞株建立人肺腺癌裸鼠模型，将 35 只，♀，成瘤裸小鼠随机分为 7 组：
对照组(生理盐水 0.2 mL)；DDP 低剂量组(1.0 mg·kg−1)；DDP 高剂量组(5 mg·kg−1)；AP 低剂量组(10 mg·kg−1)；AP 高剂量
组(30 mg·kg−1)；DDP 低剂量组+AP 低剂量组；DDP 低剂量组+AP 高剂量组，隔天腹腔注射给药，共 8 次。于最后 1 次
基金项目：衡阳市科技局项目(2009Ks39)
作者简介：刘雪花，女，副教授 Tel: (0734)82821510 E-mail: liuxh2007@126.com *通信作者：庄英帜，女，硕士，教授，硕导 Tel:
(0734)8282761 E-mail: zhuangyz2010@163.com