全 文 :新疆紫草抗 HIV有效成分咖啡酸四聚体的
理化性质和纯化工艺研究
李雅娟1,王隽妮2,沙先谊1,方晓玲1
(1.复旦大学 药学院,上海 200032;2.上海静安制药有限公司,上海 200041)
[摘要] 目的:初步研究咖啡酸四聚体(CAT)的理化稳定性的基础上选择合适的大孔吸附树脂,去除杂质,提
高紫草水溶性部分中有效成分咖啡酸四聚体的含量。方法:以咖啡酸四聚体为指标,HPLC检测纯化前后或其他条
件改变的含量变化。结果:7种型号的树脂中 LK001纯化效果最佳。确定工艺为吸附液质量浓度10g·L-1,pH
45,3BV·h-1的流速流过树脂柱,用去离子水快速洗脱至Molish反应为阴性,再用20%乙醇洗脱至无色,然后以
50mL45%的乙醇洗脱,洗脱液除去乙醇,50℃浓缩干燥得粉末。收率为 36%,CAT单个有效成分的含量为
58%,纯度提高了45倍。结论:采用LK001树脂可以去除杂质,提高粗提物中有效成分咖啡酸四聚体的含量。
[关键词] 咖啡酸四聚体;大孔吸附树脂;HPLC;稳定性;纯化
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)13155204
[收稿日期] 20081220
[基金项目] 上海市科委西部合作项目(065458029)
[通讯作者] 方晓玲,Tel/Fax:(021)54237432,Email:xlfang1215
@shmu.edu.cn
新疆紫草Arnebiaeuchroma又名新疆软紫草 A.
euchroma(Royle)Johnston,是药典的收载品种之一。
1995年日本学者 Yamasaki发现新疆紫草热水提取
物显示很强的抗 HIV活性[13];贺金华等从新疆紫
草干燥根的水提取物中得到了咖啡酸四聚体(CAT,
cafeicacidtetramor)以及其他单体化合物或组合,
同时发现,新疆紫草提取液的水溶液经色谱分离得
到的成分在体外试验中,对 HIVB病毒的抑制参数
都大于5[4]。本研究主要对 CAT理化稳定性作了
基本考察,并筛选大孔吸附树脂,进行了 CAT分离
纯化工艺的初步探讨。到目前为止,还未见 CAT理
化稳定性研究,以及有关用大孔吸附树脂法分离纯
化方面的报道。
1 仪器与试药
ShimadzuLC-10ATVP高效液相色谱仪(日本
岛津公司);ShimadzuSPD-10AVPUVVisDetector
(日本岛津公司);HS2000色谱工作站(杭州英谱);
YMCC18色谱柱(46mm×250mm,10μm);Satori
ousPB10pH计(德国赛多利斯集团);艾科浦AWJO
-0500-U纯水机(颐洋企业发展有限公司);RE-
52B旋转蒸发仪(上海光学仪器厂制造);DZF-
6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);
电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂);咖啡酸四聚
体对照品(纯度98%以上,新疆医科大学);紫草水
溶性部分提取液浸膏(批号20070620,新疆医科大
学);HPD100,HPD300(沧州恩宝),DH130,D131,
LK001(鲁抗医药股份有限公司树脂分厂),D3520
(南开大学化工厂),AB8(安徽三星树脂科技有限
公 司 )大 孔 吸 附 树 脂,乙 腈 (色 谱 纯,
Burdick&JacksonCorp.,USA);甲醇(色谱纯,江苏
汉邦科技有限公司);水为超纯水,其他试剂均为分
析纯。
2 方法与结果
2.1 含量测定
色谱条件[5]:流动相乙腈001mol·L-1磷酸
缓冲液(调 pH25)(185∶815);流速 1mL·
min-1,检测波长252nm,进样量20μL。在25~175
mg·L-1,以峰面积(A)对 CAT对照品溶液浓度
(C)进行线性回归,得回归方程 A=443337C+
352384,r=09999,CAT浓度与峰面积线性关系
良好。
浸膏中CAT的含量测定:精密称取浸膏01g,
置10mL量瓶中,流动相定容至刻度,045μm微孔
滤膜过滤后,进样 20μL,HPLC测定。测得浸膏
TCA质量分数为128%(n=3)。
大孔吸附树脂纯化粉末中CAT含量的测定:精
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密称取干燥粉末5mg,置10mL量瓶中,流动相溶
解并定容至刻度,045μm微孔滤膜过滤,进样20
μL,HPLC进样测定。
2.2 理化稳定性研究
2.2.1 CAT的 pH稳定性研究 配制一系列 pH
15,3,7,8,9,11的磷酸盐缓冲液各50mL,精密吸
取05g·L-1的 CAT储备液05mL,共6份,分别
置5mL量瓶中,用各 pH的缓冲液稀释至刻度,
HPLC测定0,2,4,6,8,12,24h的浓度,换算成相对
0h的百分比(n=3)。结果表明CAT在碱性及中性
条件下均有降解,且随着 pH升高降解加剧,而在
pH5以下没有显著变化。提示在进行 CAT的分离
纯化时,要避免碱性及中性条件,以保证 CAT的稳
定性。CAT在不同pH条件下的稳定性见图1。
Ctt时质量浓度;C0初始浓度
图1 CAT在不同pH条件下的稳定性
2.2.2 浸膏水溶液的温度稳定性 配制一定浓度
的CAT浸膏水溶液,密封并分别置于20,40,50,70
℃的条件下,于4h,2,4,6,8d测定 CAT的质量分
数,换算成0h的百分数(n=3)。结果表明紫草水
提取液中 CAT在室温下比较稳定。但是随着温度
的提高,含量下降明显。提示紫草在进行加热提取
或浓缩时,要注意温度的影响,且最好控制温度不超
过50℃。紫草浸膏溶液在不同温度下的稳定性见
图2。
2.2.3 氧化稳定性的研究 配制适宜浓度的浸膏
溶液,精密吸取1mL,置10mL量瓶中。分别加双
氧水0,1,3,5mL,去离子水稀释至刻度(n=3)。过
滤后HPLC进样测定15min,2h的含量。包括对照
组在内,2h含量均比15min有所降低,但是统计检
验表明双氧水的浓度及时间对含量改变并没有起到
显著作用。图3为氧化稳定性结果。
2.2.4 光照稳定性的研究 取大孔吸附树脂纯化
后所得粉末,均匀铺于表面皿上成一薄层,放于装有
Ctt时质量分数;C0初始质量分数
图2 紫草浸膏溶液在不同温度下的稳定性
C2h2h时质量浓度;C15min15min时质量浓度
图3 紫草浸膏溶液对双氧水的氧化稳定性
日光灯的光照箱内,于照度(4500±500)lx的条件
下放置10d,于第5天和第10天取样,测定CAT的
含量(n=3)。结果表明光照对 CAT的稳定性具有
一定的影响,放置时要尽量避免光直射。光照稳定
性结果见图4。
Ctt时质量分数;C0初始质量分数
图4 树脂纯化物的光照稳定性
2.3 动态吸附法筛选树脂
取预处理好的7种型号湿树脂各5mL,分别为
HPD100,HPD300,D3520,LK001,DH130,AB8,
D131,装填于内径10mm的色谱柱中,径高比为1∶
625。称取一定量的紫草水提取液浸膏,去离子水
溶解,配制成5g·L-1的水溶液。调节 pH45,以
保证纯化过程中的稳定,以3BV·h-1的速度流过
大孔吸附树脂柱。以 10mL为单位收集流出液,
HPLC检测流出液的 CAT浓度,直至浓度达到吸附
液体中CAT浓度的95%以上。去离子水快速流过
树脂柱,直至流出液 Molish反应检测不到糖成分。
用pH50,95% 乙醇以3BV·h-1的速度流过树脂
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柱,收集流出液,直至流出液无色。流出液旋转蒸发
除去乙醇,得到的浓溶液转移至蒸发皿,50℃水浴
蒸干,收集干燥粉末。HPLC测定干粉中CAT含量。
7种大孔吸附树脂动态吸附法优选结果见表1。
由表1可以看出,LK001树脂比上柱量和比洗脱量
最高。树脂处理所得物中 CAT含量最高,近30%。
据此,选定LK001树脂进行分离纯化研究。
表1 7种大孔吸附树脂动态吸附法优选结果
树脂型号
比上柱量
/mg·g-1
比洗脱量
/mg·g-1
CAT
/%
HPD100 1213 1620 1909
HPD300 1777 1259 1840
LK001 5624 3987 2982
D3520 2507 302 9984
DH130 1710 261 1963
AB8 2692 1843 2548
D131 1862 1616 2306
2.4 大孔吸附树脂纯化的工艺优化
2.4.1 吸附液质量浓度的考察 精密称取 3份
05g的浸膏,配制成100,10,5g·L-1的高、中、低
3种质量浓度的溶液,以3BV·h-1的流速进行大孔
吸附树脂吸附,去离子水快速冲洗直至流出液 Mol
ish反应阴性。根据预试验改用70%乙醇洗脱,收
集洗脱液至无色,所得干燥粉末测 CAT含量和收
率,考察结果见表2。
表2 吸附液浓度的考察 %
吸附液质量浓度/g·L-1 CAT 收率
100 3547 337
10 3680 530
5 3686 442
注:收率=W回收粉末/W上柱浸膏 ×100%
综合考虑CAT含量和收率,选吸附液浓度为10
g·L-1。
2.4.2 吸附液pH的考察 配制10g·L-1的浸膏
溶液,每份 50mL,分别用稀盐酸调 pH28,35,
40,45,50,54,过滤,以3BV·h-1的流速流过
树脂,去离子水水快速冲柱直至流出液 Molish反应
阴性。70%乙醇洗脱至无色。收集洗脱液,浓缩干
燥,得干燥粉,计算收率及CAT含量。结果见表3。
由表3可见,在 pH28~50,浸膏溶液的 pH
对CAT含量和收率并无显著影响。但考虑到pH过
低时对HIV病毒的药效可能会有所降低[2],最后确
定吸附液用稀盐酸调pH45。
2.4.3 洗脱液乙醇浓度的考察 将已吸附好的树
表3 吸附液pH考察 %
pH CAT 收率
28 3791 548
35 3840 618
40 3801 624
45 3853 538
50 3685 532
54 3331 498
脂先用去离子水快速洗脱直至无糖检测出,再分别
用10%,20%,30%,40%,45%,50%,70%,95%乙
醇梯度洗脱至无色,各浓度洗脱液浓缩得干燥粉末,
称重,HPLC测定CAT含量。结果表明30%至45%
乙醇洗脱物中CAT含量显著高于其他洗脱物,平均
含量为分别为10%,20%,50%,70%,95%乙醇洗
脱物的38,6,29,60倍,而且30%至45%的洗脱物
占总洗脱物质量的628%,达到了将CAT富集的效
果。因此确定洗脱步骤为先水洗,再用 20%乙醇
洗,洗脱液均弃去,最后收集45%乙醇洗脱物。结
果见图5。
图5 洗脱液乙醇体积分数的考察
2.4.4 洗脱液 pH的考察 将已吸附好的树脂四
份,分别依次用去离子水、20%乙醇洗脱,然后分别
用pH30,40,50,60的45%乙醇洗脱至无色,收
集洗脱液浓缩干燥得粉末。计算收率,HPLC测定
CAT含量。结果表明在pH30和50时CAT含量
较高。但CAT在低 pH时的活性可能会有所降低,
所以最后选择洗脱液pH为50。结果见表4。
表4 洗脱液pH考察 %
洗脱液pH CAT 收率
30 4138 335
40 3850 387
50 4070 406
60 3886 411
2.4.5 洗脱液体积的考察 将已吸附好的树脂先
用去离子水快速洗脱至无糖,再用20%乙醇洗脱至
无色,然后用45%乙醇洗脱,10mL为单位收集洗脱
液,HPLC测定CAT含量,并确定液体中所含固体量
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(洗脱率=WV/W总 ×100%)。洗脱液体积的考察结
果见图6。由图6可见,110mL洗脱液即可将93%
的吸附物洗脱下来。但是,当洗脱液体积大于 50
mL时,洗脱物中 CAT含量开始降低。为了保证纯
化的效果,只收集前50mL的洗脱液。
图6 洗脱液体积的考察
2.4.6 验证试验 预处理好的 LK001树脂5mL,
装填于内径10mm的色谱柱中备用。配制10g·
L-1的浸膏溶液50mL,稀盐酸调 pH45,045μm
微孔滤膜过滤,以3BV·h-1的流速流过树脂柱,用
去离子水快速洗脱至 Molish反应为阴性(大约 10
BV),再用 20%乙醇洗脱至无色,然后以 50mL
45%乙醇洗脱,洗脱液除去乙醇50℃浓缩干燥得粉
末。收率为36%,CAT含量为58%。
3 讨论与总结
在大孔吸附树脂的初步筛选中发现,LK001树
脂可将 CAT的含量提高20多倍,经过工艺优化以
后,所得分离纯化物CAT含量可进一步提高至原来
的45倍,表明该工艺可有效去除杂质,富集有效成
分。
[参考文献]
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中咖啡酸四聚体的含量[J].新疆医科大学学报,2005,28(5):
429.
Physicochemicalstabilityandpurificationtechnologyof
cafeicacidtetramerfromArnebiaeuchroma
LIYajuan1,WANGJunni2,SHAXianyi1,FANGXiaoling2
(1.SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai200032,China;
2.ShanghaiJinganPharmaceuticalCo.,LTD,Shanghai200041,China)
[Abstract] Objective:Topurifycafeicacidtetramer(CAT)withmacroporousresinonthebasisofitsfundamentalphysico
chemicalstabilityresearch.Method:ThechangesofCATcontentwerecomparedbyHPLCmethodbeforeandafterthepurification
process,orwhileotherconditionswerealtered.Result:LK001wasthebestoneamong7kindsofmacroporousresininregardofpurif
yingability.Theoptimumabsorbingtechnologywasthesolutionconcentrationat10g·L-1,pHat45,andtheflowrateat3BV·
h-1.Thebestelutingtechnologywas45% ethanolaselutingagent,pHat50,elutingvolumeat50mLafterapplyingsuperpurified
waterand20% ethanol.Theyieldofproductwas36percent,andtheactivecompoundCATwas58percentintheproduct.Conclu
sion:MacroporousresinLK001isefectiveinenrichingCATfromthecrudeextracts,thusthismethodofpurificationisadvisable.
[Keywords] cafeicacidtetramer;macroporousresin;HPLC;stability;purification
[责任编辑 鲍 雷]
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