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Physicochemical stability and purification technology ofcaffeic acid tetramer from Arnebia euchroma

新疆紫草抗HIV有效成分咖啡酸四聚体的理化性质和纯化工艺研究



全 文 :新疆紫草抗 HIV有效成分咖啡酸四聚体的
理化性质和纯化工艺研究
李雅娟1,王隽妮2,沙先谊1,方晓玲1
(1.复旦大学 药学院,上海 200032;2.上海静安制药有限公司,上海 200041)
[摘要] 目的:初步研究咖啡酸四聚体(CAT)的理化稳定性的基础上选择合适的大孔吸附树脂,去除杂质,提
高紫草水溶性部分中有效成分咖啡酸四聚体的含量。方法:以咖啡酸四聚体为指标,HPLC检测纯化前后或其他条
件改变的含量变化。结果:7种型号的树脂中 LK001纯化效果最佳。确定工艺为吸附液质量浓度10g·L-1,pH
45,3BV·h-1的流速流过树脂柱,用去离子水快速洗脱至Molish反应为阴性,再用20%乙醇洗脱至无色,然后以
50mL45%的乙醇洗脱,洗脱液除去乙醇,50℃浓缩干燥得粉末。收率为 36%,CAT单个有效成分的含量为
58%,纯度提高了45倍。结论:采用LK001树脂可以去除杂质,提高粗提物中有效成分咖啡酸四聚体的含量。
[关键词] 咖啡酸四聚体;大孔吸附树脂;HPLC;稳定性;纯化
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)13155204
[收稿日期] 20081220
[基金项目] 上海市科委西部合作项目(065458029)
[通讯作者] 方晓玲,Tel/Fax:(021)54237432,Email:xlfang1215
@shmu.edu.cn
  新疆紫草Arnebiaeuchroma又名新疆软紫草 A.
euchroma(Royle)Johnston,是药典的收载品种之一。
1995年日本学者 Yamasaki发现新疆紫草热水提取
物显示很强的抗 HIV活性[13];贺金华等从新疆紫
草干燥根的水提取物中得到了咖啡酸四聚体(CAT,
cafeicacidtetramor)以及其他单体化合物或组合,
同时发现,新疆紫草提取液的水溶液经色谱分离得
到的成分在体外试验中,对 HIVB病毒的抑制参数
都大于5[4]。本研究主要对 CAT理化稳定性作了
基本考察,并筛选大孔吸附树脂,进行了 CAT分离
纯化工艺的初步探讨。到目前为止,还未见 CAT理
化稳定性研究,以及有关用大孔吸附树脂法分离纯
化方面的报道。
1 仪器与试药
ShimadzuLC-10ATVP高效液相色谱仪(日本
岛津公司);ShimadzuSPD-10AVPUVVisDetector
(日本岛津公司);HS2000色谱工作站(杭州英谱);
YMCC18色谱柱(46mm×250mm,10μm);Satori
ousPB10pH计(德国赛多利斯集团);艾科浦AWJO
-0500-U纯水机(颐洋企业发展有限公司);RE-
52B旋转蒸发仪(上海光学仪器厂制造);DZF-
6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);
电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂);咖啡酸四聚
体对照品(纯度98%以上,新疆医科大学);紫草水
溶性部分提取液浸膏(批号20070620,新疆医科大
学);HPD100,HPD300(沧州恩宝),DH130,D131,
LK001(鲁抗医药股份有限公司树脂分厂),D3520
(南开大学化工厂),AB8(安徽三星树脂科技有限
公 司 )大 孔 吸 附 树 脂,乙 腈 (色 谱 纯,
Burdick&JacksonCorp.,USA);甲醇(色谱纯,江苏
汉邦科技有限公司);水为超纯水,其他试剂均为分
析纯。
2 方法与结果
2.1 含量测定
色谱条件[5]:流动相乙腈001mol·L-1磷酸
缓冲液(调 pH25)(185∶815);流速 1mL·
min-1,检测波长252nm,进样量20μL。在25~175
mg·L-1,以峰面积(A)对 CAT对照品溶液浓度
(C)进行线性回归,得回归方程 A=443337C+
352384,r=09999,CAT浓度与峰面积线性关系
良好。
浸膏中CAT的含量测定:精密称取浸膏01g,
置10mL量瓶中,流动相定容至刻度,045μm微孔
滤膜过滤后,进样 20μL,HPLC测定。测得浸膏
TCA质量分数为128%(n=3)。
大孔吸附树脂纯化粉末中CAT含量的测定:精
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密称取干燥粉末5mg,置10mL量瓶中,流动相溶
解并定容至刻度,045μm微孔滤膜过滤,进样20
μL,HPLC进样测定。
2.2 理化稳定性研究
2.2.1 CAT的 pH稳定性研究 配制一系列 pH
15,3,7,8,9,11的磷酸盐缓冲液各50mL,精密吸
取05g·L-1的 CAT储备液05mL,共6份,分别
置5mL量瓶中,用各 pH的缓冲液稀释至刻度,
HPLC测定0,2,4,6,8,12,24h的浓度,换算成相对
0h的百分比(n=3)。结果表明CAT在碱性及中性
条件下均有降解,且随着 pH升高降解加剧,而在
pH5以下没有显著变化。提示在进行 CAT的分离
纯化时,要避免碱性及中性条件,以保证 CAT的稳
定性。CAT在不同pH条件下的稳定性见图1。
Ctt时质量浓度;C0初始浓度
图1 CAT在不同pH条件下的稳定性
2.2.2 浸膏水溶液的温度稳定性 配制一定浓度
的CAT浸膏水溶液,密封并分别置于20,40,50,70
℃的条件下,于4h,2,4,6,8d测定 CAT的质量分
数,换算成0h的百分数(n=3)。结果表明紫草水
提取液中 CAT在室温下比较稳定。但是随着温度
的提高,含量下降明显。提示紫草在进行加热提取
或浓缩时,要注意温度的影响,且最好控制温度不超
过50℃。紫草浸膏溶液在不同温度下的稳定性见
图2。
2.2.3 氧化稳定性的研究 配制适宜浓度的浸膏
溶液,精密吸取1mL,置10mL量瓶中。分别加双
氧水0,1,3,5mL,去离子水稀释至刻度(n=3)。过
滤后HPLC进样测定15min,2h的含量。包括对照
组在内,2h含量均比15min有所降低,但是统计检
验表明双氧水的浓度及时间对含量改变并没有起到
显著作用。图3为氧化稳定性结果。
2.2.4 光照稳定性的研究 取大孔吸附树脂纯化
后所得粉末,均匀铺于表面皿上成一薄层,放于装有
  
Ctt时质量分数;C0初始质量分数
图2 紫草浸膏溶液在不同温度下的稳定性
C2h2h时质量浓度;C15min15min时质量浓度
图3 紫草浸膏溶液对双氧水的氧化稳定性
日光灯的光照箱内,于照度(4500±500)lx的条件
下放置10d,于第5天和第10天取样,测定CAT的
含量(n=3)。结果表明光照对 CAT的稳定性具有
一定的影响,放置时要尽量避免光直射。光照稳定
性结果见图4。
Ctt时质量分数;C0初始质量分数
图4 树脂纯化物的光照稳定性
2.3 动态吸附法筛选树脂
取预处理好的7种型号湿树脂各5mL,分别为
HPD100,HPD300,D3520,LK001,DH130,AB8,
D131,装填于内径10mm的色谱柱中,径高比为1∶
625。称取一定量的紫草水提取液浸膏,去离子水
溶解,配制成5g·L-1的水溶液。调节 pH45,以
保证纯化过程中的稳定,以3BV·h-1的速度流过
大孔吸附树脂柱。以 10mL为单位收集流出液,
HPLC检测流出液的 CAT浓度,直至浓度达到吸附
液体中CAT浓度的95%以上。去离子水快速流过
树脂柱,直至流出液 Molish反应检测不到糖成分。
用pH50,95% 乙醇以3BV·h-1的速度流过树脂
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柱,收集流出液,直至流出液无色。流出液旋转蒸发
除去乙醇,得到的浓溶液转移至蒸发皿,50℃水浴
蒸干,收集干燥粉末。HPLC测定干粉中CAT含量。
7种大孔吸附树脂动态吸附法优选结果见表1。
由表1可以看出,LK001树脂比上柱量和比洗脱量
最高。树脂处理所得物中 CAT含量最高,近30%。
据此,选定LK001树脂进行分离纯化研究。
表1 7种大孔吸附树脂动态吸附法优选结果
树脂型号
比上柱量
/mg·g-1
比洗脱量
/mg·g-1
CAT
/%
HPD100 1213 1620 1909
HPD300 1777 1259 1840
LK001 5624 3987 2982
D3520 2507 302 9984
DH130 1710 261 1963
AB8 2692 1843 2548
D131 1862 1616 2306
2.4 大孔吸附树脂纯化的工艺优化
2.4.1 吸附液质量浓度的考察 精密称取 3份
05g的浸膏,配制成100,10,5g·L-1的高、中、低
3种质量浓度的溶液,以3BV·h-1的流速进行大孔
吸附树脂吸附,去离子水快速冲洗直至流出液 Mol
ish反应阴性。根据预试验改用70%乙醇洗脱,收
集洗脱液至无色,所得干燥粉末测 CAT含量和收
率,考察结果见表2。
表2 吸附液浓度的考察 % 
吸附液质量浓度/g·L-1 CAT 收率
100 3547 337
10 3680 530
5 3686 442
  注:收率=W回收粉末/W上柱浸膏 ×100%
  综合考虑CAT含量和收率,选吸附液浓度为10
g·L-1。
2.4.2 吸附液pH的考察 配制10g·L-1的浸膏
溶液,每份 50mL,分别用稀盐酸调 pH28,35,
40,45,50,54,过滤,以3BV·h-1的流速流过
树脂,去离子水水快速冲柱直至流出液 Molish反应
阴性。70%乙醇洗脱至无色。收集洗脱液,浓缩干
燥,得干燥粉,计算收率及CAT含量。结果见表3。
由表3可见,在 pH28~50,浸膏溶液的 pH
对CAT含量和收率并无显著影响。但考虑到pH过
低时对HIV病毒的药效可能会有所降低[2],最后确
定吸附液用稀盐酸调pH45。
2.4.3 洗脱液乙醇浓度的考察 将已吸附好的树
   表3 吸附液pH考察 % 
pH CAT 收率
28 3791 548
35 3840 618
40 3801 624
45 3853 538
50 3685 532
54 3331 498
脂先用去离子水快速洗脱直至无糖检测出,再分别
用10%,20%,30%,40%,45%,50%,70%,95%乙
醇梯度洗脱至无色,各浓度洗脱液浓缩得干燥粉末,
称重,HPLC测定CAT含量。结果表明30%至45%
乙醇洗脱物中CAT含量显著高于其他洗脱物,平均
含量为分别为10%,20%,50%,70%,95%乙醇洗
脱物的38,6,29,60倍,而且30%至45%的洗脱物
占总洗脱物质量的628%,达到了将CAT富集的效
果。因此确定洗脱步骤为先水洗,再用 20%乙醇
洗,洗脱液均弃去,最后收集45%乙醇洗脱物。结
果见图5。
图5 洗脱液乙醇体积分数的考察
2.4.4 洗脱液 pH的考察 将已吸附好的树脂四
份,分别依次用去离子水、20%乙醇洗脱,然后分别
用pH30,40,50,60的45%乙醇洗脱至无色,收
集洗脱液浓缩干燥得粉末。计算收率,HPLC测定
CAT含量。结果表明在pH30和50时CAT含量
较高。但CAT在低 pH时的活性可能会有所降低,
所以最后选择洗脱液pH为50。结果见表4。
表4 洗脱液pH考察 % 
洗脱液pH CAT 收率
30 4138 335
40 3850 387
50 4070 406
60 3886 411
2.4.5 洗脱液体积的考察 将已吸附好的树脂先
用去离子水快速洗脱至无糖,再用20%乙醇洗脱至
无色,然后用45%乙醇洗脱,10mL为单位收集洗脱
液,HPLC测定CAT含量,并确定液体中所含固体量
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(洗脱率=WV/W总 ×100%)。洗脱液体积的考察结
果见图6。由图6可见,110mL洗脱液即可将93%
的吸附物洗脱下来。但是,当洗脱液体积大于 50
mL时,洗脱物中 CAT含量开始降低。为了保证纯
化的效果,只收集前50mL的洗脱液。
图6 洗脱液体积的考察
2.4.6 验证试验 预处理好的 LK001树脂5mL,
装填于内径10mm的色谱柱中备用。配制10g·
L-1的浸膏溶液50mL,稀盐酸调 pH45,045μm
微孔滤膜过滤,以3BV·h-1的流速流过树脂柱,用
去离子水快速洗脱至 Molish反应为阴性(大约 10
BV),再用 20%乙醇洗脱至无色,然后以 50mL
45%乙醇洗脱,洗脱液除去乙醇50℃浓缩干燥得粉
末。收率为36%,CAT含量为58%。
3 讨论与总结
在大孔吸附树脂的初步筛选中发现,LK001树
脂可将 CAT的含量提高20多倍,经过工艺优化以
后,所得分离纯化物CAT含量可进一步提高至原来
的45倍,表明该工艺可有效去除杂质,富集有效成
分。
[参考文献]
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Physicochemicalstabilityandpurificationtechnologyof
cafeicacidtetramerfromArnebiaeuchroma
LIYajuan1,WANGJunni2,SHAXianyi1,FANGXiaoling2
(1.SchoolofPharmacy,FudanUniversity,Shanghai200032,China;
2.ShanghaiJinganPharmaceuticalCo.,LTD,Shanghai200041,China)
[Abstract] Objective:Topurifycafeicacidtetramer(CAT)withmacroporousresinonthebasisofitsfundamentalphysico
chemicalstabilityresearch.Method:ThechangesofCATcontentwerecomparedbyHPLCmethodbeforeandafterthepurification
process,orwhileotherconditionswerealtered.Result:LK001wasthebestoneamong7kindsofmacroporousresininregardofpurif
yingability.Theoptimumabsorbingtechnologywasthesolutionconcentrationat10g·L-1,pHat45,andtheflowrateat3BV·
h-1.Thebestelutingtechnologywas45% ethanolaselutingagent,pHat50,elutingvolumeat50mLafterapplyingsuperpurified
waterand20% ethanol.Theyieldofproductwas36percent,andtheactivecompoundCATwas58percentintheproduct.Conclu
sion:MacroporousresinLK001isefectiveinenrichingCATfromthecrudeextracts,thusthismethodofpurificationisadvisable.
[Keywords] cafeicacidtetramer;macroporousresin;HPLC;stability;purification
[责任编辑 鲍 雷]
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