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Effect of Supplemented Taoren Chengqi decoction on NIT-1, a pancreatic β-cell from a transgenic NOD/Lt mouse

复方加味桃仁承气汤对小鼠胰岛β细胞作用的研究



全 文 :复方加味桃仁承气汤对小鼠胰岛 β细胞作用的研究
孟繁敏1,赵玉英1,王 宏2,张岩松1,李清艳1,李丽英3,张庆英1
(1.北京大学 药学院 天然药物学系及天然药物与仿生药物国家重点实验室,北京 100083;
2.北京大学 干细胞研究中心,北京 100083;3.首都医科大学 细胞生物学系,北京 100069)
[摘要] 目的:研究复方加味桃仁承气汤对小鼠胰岛β细胞(NIT1)的作用,探讨其抗糖尿病机制。方法:利
用3HTdR掺入、细胞计数、胰岛素测定等研究复方加味桃仁承气汤水提液及含药血清对小鼠胰岛β细胞的增殖及
胰岛素分泌量的影响。其中含药血清的制备方法为给随机分组的5只大鼠灌胃复方加味桃仁承气汤水提液,每天
2次,连续3d,末次给药2h后腹主静脉取血,离心,分离血清。结果:复方加味桃仁承气汤水提液及其含药血清均
能明显促进小鼠胰岛β细胞增殖(P<005),同时能明显促进胰岛素分泌(P<005)。结论:复方加味桃仁承气汤
抗糖尿病的作用机制可能与其促进胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌有关。
[关键词] 糖尿病;加味桃仁承气汤;小鼠胰岛β细胞
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)13160103
[收稿日期] 20070610
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30371735)
[通讯作者] 李丽英,Tel:(010)83911647,Fax:(010)83911647,E
mail:liliying@ccmu.edu.cn;张庆英,Tel:(010)82681548,Fax:(010)
62015584,Email:qyzhang@bjmu.edu.cn
  糖尿病在中医上属“消渴病”范畴,随着对其病机
认识的深入及现代科学方法的引入,中药降糖作用机
制研究也日益展开。桃仁承气汤(又名桃核承气汤)
源于《伤寒论》,方药组成为桃仁(去皮尖)、大黄、桂
枝、炙甘草和芒硝,是《伤寒论》治疗太阳蓄血证之方,
具破血去瘀的功效[1],在桃仁承气汤基础上加黄芪、
地黄、玄参、麦冬而成的加味桃仁承气汤具有明显的
降糖和降脂作用,临床上用于防治糖尿病及其并发
症[25]。为进一步研究该方抗糖尿病的作用机制,笔
者研究了复方加味桃仁承气汤对小鼠胰岛 β细胞
(NIT1)增殖及胰岛素分泌作用的影响。
1 材料
1.1 动物 清洁级 Wistar大鼠,雄性,体重250g
左右,由北京大学医学部动物实验中心提供,合格证
号SCXK(京)20020003。
1.2 药物 复方加味桃仁承气汤各单味药均购自
北京同仁堂股份有限公司,由北京大学药学院药用
植物研究室陈虎彪教授分别鉴定为桃仁 SemenPer
sicae、大黄 RhadixetRhizomaRhei、桂枝 Ramulus
Cinnamomi、炙甘草 RadixGlycyrhizaePreparate、芒
硝NatriSulfas、黄芪RadixAsragali、地黄RadixReh
manniae、玄参 RadixScrophulariae和麦冬 Radix
Ophiopogonis。
按处方最大量分别称取各单味药,水煎煮提取
3次,减压回收溶剂至干,提取物分成两部分:用
05%羧甲基纤维素钠(05%CMCNa)配制成生药
09g·mL-1的A药液。用灭菌三蒸水配制成25g
·L-1的B药液。
1.3 试剂 小鼠胰岛 β细胞(NIT1)(ATCC);RP
MI1640培养基(InvitrogenCorporation,31800022);
胎牛血清 (北京元亨圣马生物技术研究院,
060812);胰蛋白酶(Hyclone,SH3023601);3H胸
腺嘧啶脱氧核苷[tritiatedthymidine,3HTdR(1mCi
·mL-1),中国科学院上海核技术开发公司];超敏
胰岛素ELISA试剂盒(CrystalChemInc,90060)。
1.4 仪器 WALLACE1420型酶标仪(PerkinElmer);
3111型 CO2细胞培养箱(ThermoForma);CKX31型
倒置显微镜(Olympus);5804型低温离心机(Ep
pendorf);3M型多孔细胞收集仪(TOMTEC);WAL
LACE1450型液体闪烁示踪仪(PerkinElmer);HF
safe1200型超净工作台(香港利康发展有限公司)。
2 方法
2.1 大鼠含药血清和空白血清的制备 取大鼠10
只,随机分为给药组和空白血清对照组,每组5只,
其中给药组按每100g体重大鼠灌胃相当于生药量
18g的 A药液,空白血清对照组按同体积灌胃
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    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 13
July,2008
05%CMCNa溶液,每天给药2次,连续3d,末次
给药2h后,戊巴比妥钠麻醉,在严格无菌条件下由
腹主静脉取血,以3000r·min-1离心15min,分离
血清。将同组血清合并、混匀,分别得含药血清和空
白血清,置-70℃冰箱冷藏备用。
2.2 细胞培养 冻存于液氮中的小鼠胰岛 β细胞
经常规复苏后,接种于培养瓶中,以 RPMI1640培
养液(含10%胎牛血清)在37℃,5%CO2及饱和湿
度条件下培养。当细胞生长至指数生长期时,用
025%胰蛋白酶/002%EDTA2Na溶液消化,终止
反应后以1000r·min-1离心5min,用培养基调整
细胞数进行3HTdR掺入试验和细胞计数试验。
2.3 3HTdR掺入试验 细胞以2×104个/mL密度
接种于96孔板,培养24h后,吸去培养基,换上无
血清RPMI1640培养液培养过夜后,分别加入无血
清培养液、含空白血清培养液(2%)、含药血清培养
液(10%)及含 B药液培养液(01g·L-1)各 200
μL继续培养24h后,每孔加入3HTdR05μCi继
续培养10h,碱裂解法终止反应后,用多孔细胞收集
仪将细胞收集于玻璃纤维滤膜上,在液体闪烁示踪
仪上进行测定。
2.4 细胞计数试验 将细胞以1×105个/mL密度
接种于24孔板,培养24h后,吸去培养基,加入无
血清RPMI1640培养液培养过夜后,分别加入无血
清培养液、含空白血清培养液(2%)、含药血清培养
液(2%)及含 B药液培养液(01g·L-1)各1mL
继续培养48h,吸取上清液,并用025%胰蛋白酶/
002%EDTA2Na溶液消化,以 RPMI1640培养液
终止反应后用血球计数器计数。
2.5 胰岛素测定 取2.4项下细胞培养的上清液,
用超敏胰岛素ELISA试剂盒进行胰岛素测定。
2.6 统计学分析 所有数据以 珋x±s表示,采用双
样本异方差进行组间t检验。
3 结果
3.1 加味桃仁承气汤水提液对小鼠胰岛 β细胞的
作用 3HTdR掺入实验,细胞计数和胰岛素测定结
果表明,加味桃仁承气汤水提液对小鼠胰岛 β细胞
有明显的促增殖作用(3HTdR掺入试验 P<005,
细胞计数P<001),对胰岛素的分泌也有明显的促
进作用(P<001)。见表1。
3.2 加味桃仁承气汤水提液含药血清对小鼠胰岛
β细胞的作用 加味桃仁承气汤水提液含药血清对
   表1 B药液3HTdR掺入、细胞计数和
胰岛素测定结果(珋x±s)
组别 n
3HTdR
/×103

细胞计数
/×104

胰岛素
/μg·L-1
对照 6 123±20 5 106±04 5 0099±0002
B药液 6 164±291)5 310±602) 5 0136±00072)
  注:与对照组比1)P<005,2)P<001
小鼠胰岛β细胞(NIT1)有明显的促增殖作用(3H
TdR掺入实验和细胞计数实验均P<005),对胰岛
素的分泌有明显的促进作用(P<005)。见表2。
表2 含药血清3HTdR掺入、细胞计数和
胰岛素测定结果(珋x±s)
组别 n
3HTdR
/×103

细胞计数
/×104

胰岛素
/μg·L-1
空白对照 6 51±26 5 109±05 5 0089±0001
血清对照 6 40±30 5 327±18 5 0172±0002
含药血清 6 72±281)5 379±411)5 0184±00061)
  注:与血清对照组比1)P<005
4 讨论
小鼠胰岛 β细胞(NIT1)是源于一种转基因
NOD小鼠的 β细胞系[6]。该小鼠是广泛应用于基
础研究中的糖尿病动物模型,通过转基因技术转染
大鼠胰岛素基因启动子和 Simian病毒40(SV40)的
大T抗原杂交基因,能自发性引起胰岛β细胞瘤,其
特点是对葡萄糖具有反应性,可应用于胰岛 β细胞
的功能研究。NIT1细胞是多边形上皮样细胞,呈
簇状生长,基本保持了小鼠正常胰岛β细胞的形态。
免疫化学分析证实,NIT1细胞主要分泌胰岛素,仅
有极少部分(≤05%)细胞分泌胰升糖素,其基础
胰岛素的分泌情况与正常胰岛 β细胞无显著性差
异。另外,NIT1细胞表面除了特异性表达 SV40大
T抗原以外,其 MHCⅠ类抗原的表达模式与普通
NOD小鼠的 β细胞相同。该细胞模型相对稳定持
久,不易变异,可用于对药物抗糖尿病活性作用机制
进行初步探讨。
实验结果表明,该复方水提液及其含药血清对
小鼠胰岛β细胞均具有明显的促增殖和促胰岛素分
泌作用,提示加味桃仁承气汤所含固有成分可能是
该复方促进小鼠胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌的物
质基础,至于该复方吸收入体内后产生的各种代谢
产物的作用有待于进一步研究。
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EfectofSupplementedTaorenChengqidecoctiononNIT1,
apancreaticβcelfromatransgenicNOD/Ltmouse
MENGFanmin1,ZHAOYuying1,WANGHong2,ZHANGYansong1,LIQingyan1,LILiying3,ZHANGQingying1
(1.DepartmentofNaturalMedicinesandtheStateKeyLaboratoryofNaturalandBiomimeticDrugs,
SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100083,China;
2.StemCelResearchCenter,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100083,China;
3.CelBiologyDepartment,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)
  [Abstract] Objective:TostudytheefectofSupplementedTaorenChengqidecoction(STCD)onthesecretionofinsulinand
proliferationofNIT1.Method:TheefectofSTCDandtheserumofratafteroralyadministratingofSTCDonthesecretionofinsulin
andproliferationofNIT1werestudied.TheproliferationofNIT1wasmeasuredby3HTdRincorporationandcelcountingmethods,
whilethesecretionofinsulinwasmeasuredfromtheculturedmediumbytheultrasensitiveratinsulinELISIAkit.Result:Boththe
STCDandtheserumofratafteroralyadministratingofSTCDsignificantlycouldincreasedthesecretionofinsulinandproliferationof
NIT1.Conclusion:ThetreatmentofthediabeticpatientsbySTCDmightbethroughwithitsimprovementofsecretionofinsulinand
proliferationonpancreaticβcel.
[Keywords] diabetesmelitus;SupplementedTaorenChengqidecoction;NIT1 [责任编辑 古云侠]
(上接第1557页)
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ryboweldisease[J].AdvDrugDelivRev,2005,57(2):247.
EvaluationoftargetingpropertyforKuikangcolontargetedpelets
ZHANGYajun1,LIJiangying2,XULianying3
(1.ColegeofLifeScience,NorthwestUniversity,Xi'an710069,China;
2.Xi'anHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xi'an710001,China;
3.ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)
  [Abstract] Objective:ToevaluatecolontargetingcharacteristicofKuikangcolontargetedpelets(KCP)withdeterminationofre
sidualbaicalinandbaicaleinconcentrationingastrointestinaltract(GIT).Method:ThebaicalinandbaicaleinwereassayedbyHPLC.The
recoverydiferencesofthedrugbetweenKCPandconventionalpeletsfromGITwereinvestigated,threeandsixhoursafteradministration.
Result:ThebaicalinrecoveryofKCP(70%)fromratGITwashigherthanthatofCP(about20%).MostofKCPwereintactat3hafter
oraladministration,anddistributedinlowerileum.ItindicatedthatreleasesiteofKCPwasinlowerileumandcolon.Sixhourslater,a
smalamountofbaicalinwasrecoveredinintestime,whichshowedthatthereleaseofbaicalinfromKCPwascomplete.Conclusion:Thede
terminationofresidualbaicalininratGITwasfeasibilityforevaluatingKCP.TheresultconfirmedKCPofcolontargetingproperty.
[Keywords] Kuikangcolontargetedpelets;baicalin;baicalein [责任编辑 鲍 雷]
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