全 文 :¤±§·«¨ ≤xs√¤¯∏¨¶²±·«¨ ° º µ¨¨ ku{z1ws ? x1{wl Λª#°pt ¤±§ktzy1tw ? x1t{l Λª#°pt oµ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ q׫¨ ·∏°²µ¬±«¬¥¬·²µ¼ µ¤·¨ ²©«¬ª«
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«¨ ³¤·¬¦¦¤±¦¨µ¬± ¤§²¶¨2§¨ ³¨ ±§¨ ±·°¤±±¨ µq Χονχλυσιον : ±·∏°²µ¬±«¬¥¬·²µ¼·¨¶·o¬·º¤¶¶«²º±·«¤··«¨ ·¨«¤±²¯ ¬¨·µ¤¦·¶²© Σ . λψρατυµ °¤¼
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[ Κεψ ωορδσ] Σολανυµ λψρατυµ ~¤±·¬2·∏°²µ~≥t{s ~ uu
≈责任编辑 方文贤
≈收稿日期 ussx2su2uw
≈基金项目 浙江省自然科学基金项目kusustxl
≈通讯作者 3 洪行球 oר¯ }tv{t|wxvysz o ƒ¤¬}ksxztl{yytvx|{ o
∞2°¤¬¯}¬´ «²±ªususw tyv q¦²°
v种姜黄色素干预 ²¬2⁄促平滑肌细胞
增殖与影响 ⁄2 表达的研究
刘 艳t ou o洪行球t 3
kt1 浙江中医学院 o浙江 杭州 vtssxv ~
u1萧山第一人民医院 o浙江 杭州 vttussl
≈摘要 目的 }研究 v种不同结构的姜黄色素单体对牛主动脉平滑肌细胞k∂≥ ≤l增殖及牛 ∂≥ ≤ 低密度脂蛋
白受体k⁄2 l表达的影响 o解析构效关系 ∀方法 }用 ××比色法和流式细胞仪观察 v种不同结构的姜黄色素单体
对 ²¬2⁄促牛 ∂≥≤增殖及对 ∂≥ ≤ ⁄2 表达的影响 ∀结果 }²¬2⁄在 u1x ox ots °ª#pt时 o对 ∂≥ ≤有明显的
促增殖作用 oΠ s1sx ∀姜黄素 ty1x ovv oyy Λ°²¯#pt o一脱甲氧基姜黄素k简称一脱lvv oyy Λ°²¯#pt和二脱甲氧基
姜黄素k简称二脱lyy Λ°²¯#pt对 ts °ª#pt ²¬2⁄培养的 ∂≥ ≤有明显的抑制作用 oΠ s1sx ∀v种姜黄色素的抑
制率为姜黄素 一脱 二脱 ∀v种姜黄色素在 yy ovv oty1x Λ°²¯#pt时对 ∂≥≤ ⁄2 的表达均有明显的上调作用 o
其中姜黄素 ty1x Λ°²¯#pt组与正常组比较 oΠ s1sx o其他组与正常组比较 Π s1st o上调作用二脱 一脱 姜黄
素 o经组间方差分析 oΠ s1st o与姜黄色素抑制牛 ∂≥≤ 增殖作用相反 ∀结论 }v种不同结构姜黄色素单体能明显
抑制 ²¬2⁄促牛 ∂≥≤ 增殖作用 o上调牛 ∂≥ ≤ ⁄2 表达 o从而有可能延缓动脉粥样硬化的发生发展过程 ∀
≈关键词 姜黄素 ~一脱甲氧基姜黄素 ~二脱甲氧基姜黄素 ~平滑肌细胞 ~氧化低密度脂蛋白 ~低密度脂蛋
白受体 ~动脉粥样硬化
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussylsy2sxss2sw
低密度脂蛋白k⁄l增高和主动脉平滑肌细胞
k∂≥≤l增殖是动脉粥样硬化k≥l斑块形成过程中
的重要环节 o若有药物能阻断这一环节 o将有助于延
缓 ≥的发生发展 ∀
姜黄是我国常用的传统中药 o主要成分为姜黄
色素和挥发油两大类 o现代医学研究证实 o姜黄色素
类具有抗炎 !抗氧化 !降血脂和抗肿瘤等多种作用 o
引起了国内外学者的广泛关注 ∀
本实验在前期研究姜黄醇提取物有降血脂 !抗
≥的基础上≈t2v o用柱色谱分离 !精制姜黄醇提物中
的主要成分姜黄素 !一脱和二脱 o比较这 v个姜黄色
素类不同结构衍生物 o在抗 ²¬2⁄促牛 ∂≥≤ 增殖
中所起的作用 o和对牛 ∂≥≤ ⁄2 表达的影响 o解
析构效关系 ∀
1 材料与方法
111 主要试剂 !仪器与药物
°tyws培养基k
≤公司 o批号 ttyxsyul o
小牛血清k杭州四季青生物工程材料有限公司 o批
号 svsytwl o胰蛋白酶k≥¬ª°¤公司l o⁄¬k
¬²·¬∏°公
司 o批号 |zs{szl o噻唑蓝k××lk ∞≥≤ o批号
#ssx#
第 vt卷第 y期
ussy年 v月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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sw{t
xsl o溴化钠 o硫酸铜 o马铃薯淀粉 o甲醇 o⁄
抗体等k均为国产试剂l ~细胞培养瓶 !培养板k2
≤l !流式细胞仪kƒ≤lk美国
⁄公司 oƒ≤≥²µ·l
等 ~姜黄素对照品k购自中国药品生物制品检定所 o
批号 {uv2|wstl ~一脱 !二脱对照品k成都天银实业公
司 o批号 ssuv ossusl ∀
112 方法
11211 v种姜黄色素单体的分离 !含量测定
取姜黄醇提物适量 o用丙酮溶解 o加入到硅胶
ktss ∗ uss目l中 oys ε 挥干 o置于 tss ∗ tus目硅胶
装柱 !氯仿平衡后的柱顶端 o以氯仿2甲醇ktssΒs ∗
tssΒtsl梯度洗脱 o分部收集 o薄层色谱检测 o合并相
同部分 o得姜黄素 !一脱 !二脱 v种不同结构的姜黄
色素单体 o用比色法测定含量 o备用 ∀
11212 牛 ∂≥≤培养
采用组织块法培养牛 ∂≥≤ ∀无菌条件下取新
生小牛主动脉 o分离中膜平滑肌层 o剪碎贴块培养 o
培养液为含 us h小牛血清的 °tyws培养液 o待
细胞长满瓶底后 o按常规方法以含 ts h小牛血清的
°tyws培养液传代培养 o取 v ∗ y代细胞用于实
验 ∀
11213 ²¬2⁄与 ⁄¬2⁄的制备
1121311 ²¬2⁄的制备 取正常新鲜人血浆 o密
度梯度超速离心法分离 t1st| ∗ t1sys ª#°pt部分 o
进一步用 ≥¨ ³«¤µ²¶¨ y
凝胶过滤 o取单一蛋白峰 o用
⁄抗体鉴定 oƒ²¯¬±2¯ ²ºµ¼法测定蛋白含量 o得已知
浓度的人 ⁄o以铜离子氧化法氧化 ⁄o随着脂质
过氧化物的增加 o颜色也由淡黄色变为乳白色 ∀琼
脂糖凝胶电泳显示 ²¬2⁄的电泳迁移速率快于未
氧化的 ⁄≈w o抽滤除菌 ow ε 保存 ∀
1121312 ⁄¬2⁄的制备 取 u °⁄与 ux °ª不
溶性马铃薯淀粉置于试管中混匀后 o加入 ys Λ⁄¬
k用甲醇溶解为 ts °ª#°ptl ow ε 放置 t «o液氮速
冻 o真空干燥 o然后加入 u °ts °°²¯#pt×µ¬¦¬±¨ ow
ε 孵育 w{ «o每隔一定时间取出混匀 t次 ∀w ε u
sss µ#°¬±pt离心 tx °¬±o去淀粉沉淀 ∀取上清 ow ε
tu sssµ#°¬±pt离心 tx °¬±o重复上步 o所得的上清含
⁄¬2⁄ow ε 保存 ∀以 ƒ²¯¬±2¯ ²ºµ¼法测定上清中的
蛋白浓度 ∀w ε 保存备用≈x ∀
11214 细胞增殖抑制实验k××比色法l
1121411 ²¬2⁄对牛 ∂≥≤ 的增殖作用 取生长
良好的 ∂≥≤ 以 tsw ∗ tsx#°pt接种于 |y 孔培养
板 o每孔 tss Λovz ε ox h ≤u孵育 uw «o待细胞贴
壁后更换无血清培养液继续培养 uw «o使大多数细
胞同步于 trs期后 o随机分成 u大组 }正常对照组
为含 x h小牛血清 °tyws培养液 tss Λ~²¬2⁄
组为上述等量培养液中 o加 ²¬2⁄至终含量分别为
u1x ox ots ous ows o{s °ª#pt ∀均设 {复孔 ovz ε o
x h ≤u继续培养 w{ «后 o将原培养液吸净 o每孔加
入 s1x °ª#°pt的 ×× tss Λo继续孵育 w «o弃 ××
液后每孔加 ⁄≥tss Λ充分溶解深蓝色结晶 o于
酶标仪上以波长 xzs ±°测吸光度 Α∀
1121412 v种姜黄色素单体对 ²¬2⁄促牛 ∂≥≤
增殖的干预作用 随机分 v 组 }正常对照组为含
x h小牛血清 °tyws培养液 tss Λ~²¬2⁄组为
上述等量培养液中加 ²¬2⁄至终含量为 ts °ª#
pt ~药物组为在 ²¬2⁄组基础上加 v种不同结构
姜黄色素单体k姜黄素 !一脱 !二脱l至终浓度分别为
ty1x ovv oyy Λ°²¯#pt ∀均设 {复孔 ∀余方法与步骤
同上 ∀
11215 流式细胞仪检测牛 ∂≥≤ ⁄2 的表达
∂≥≤以 y1s ≅ tsx#°pt接种于 ux °培养瓶中 o每
瓶 w °ovz ε ox h ≤u培养 o待细胞贴壁后随机分 u
大组 }正常对照组为 ∂≥≤ 在 w °含 x h小牛血清
°tyws培养液中 ~药物组为 ∂≥≤ 在 w °含 x h
小牛血清 °tyws培养液中 o加 v种不同结构姜黄
色素至终浓度分别为 ty1x ovv oyy Λ°²¯#pt ∀vz ε o
x h ≤u培养 w{ «o弃培养液 o加入含 ⁄¬2⁄的无小
牛血清的 °tyws培养液 o⁄¬2⁄的终含量为 us
Λª#°pt ovz ε ox h ≤u培养 w1x «ow ε 继续培养
s1x «o消化后 w h甲醛固定 o°
≥洗涤 o制成单细胞
悬液 o调细胞密度 tsy#°pt o于流式细胞仪检测 o每
个样品定量测定 t万个细胞 ∀
11216 统计学分析
所有实验数据均以 cξ ? σ表示 o采用 ≥°≥≥ tt1s
统计软件 o多组间比较用 Φ检验 o两组间比较用 τ
检验 ∀
2 结果
211 ²¬2⁄对 ∂≥≤的促增殖作用与 v种姜黄色
素单体对其促增殖的干预作用
21111 ²¬2⁄对牛 ∂≥≤的增殖作用
细胞经不同条件培养后用 ××比色法测定 o可
见 ²¬2⁄在终含量为 u1x ox ots °ª#pt时能明显促
进 ∂≥≤的增殖 oΠ s1sx ∀并且 ts °ª#pt的作用
#tsx#
第 vt卷第 y期
ussy年 v月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt o¶¶∏¨ y
¤µ¦«oussy
最明显 ∀剂量增加到 {s °ª#pt时则呈明显的抑制
作用 oΠ s1sx ∀因此 o选用 ts °ª#pt²¬2⁄作为
促 ∂≥≤增殖的模型 ∀
21112 v种姜黄色素单体对 ²¬2⁄促牛 ∂≥≤ 增
殖的干预作用
结果可见姜黄素高 !中 !低剂量组 o一脱高 !中剂
量组 o二脱高剂量组均有明显的抑制 ²¬2⁄促牛
∂≥≤增殖作用 o Π s1sx或 Π s1st ov种姜黄色
素的抑制率为姜黄素 一脱 二脱k表 tl o而本实
验室以前的研究结果表明 ov种姜黄色素也能抑制
正常牛 ∂≥≤增殖≈y ∀
表 t v种不同浓度的姜黄色素单体对
²¬2⁄促 ∂≥≤增殖的干预作用kcξ ? σl
组别 浓度rΛ°²¯#pt Α
正常对照组 p s qtut ? s qsst
²¬2⁄wl ts s qtyt ? s qsvttl
姜黄素 n ²¬2⁄ yy s qs|x ? s qssuvl
vv s qttx ? s qsttul
ty qx s qtuu ? s qss|ul
一脱甲氧基姜黄素 n ²¬2⁄ yy s qs|| ? s qsswvl
vv s qttv ? s qstzul
ty qx s qtxx ? s qstz
二脱甲氧基姜黄素 n ²¬2⁄ yy s qtt| ? s qstvul
vv s qtxw ? s qsuy
ty qx s qtx| ? s qsv{
注 }与正常对照组比较tl Π s1sx ~与 ²¬2⁄组比较ul Π s1sx o
vl Π s1st ~wl计量单位为 °ª#pt
212 v种姜黄色素单体对牛 ∂≥≤ ⁄2 表达的
影响
姜黄色素对 ∂≥≤具功能性的 ⁄2 表达的影
响可以通过流式细胞仪清楚的观察到 ∀通过流式细
胞仪对每个样品的 t万个细胞中能够表达有活性
⁄2 的细胞所占的百分率进行定量分析 o发现 v
种姜黄色素单体浓度分别在 yy ovv oty1x Λ°²¯ #pt
时对 ∂≥≤ ⁄2 的表达均有明显的上调作用 o除
姜黄素 ty1x Λ°²¯ #pt组与正常对照组比较 oΠ
s1sx外 o其他组与正常对照组比较 o均为 Π s1st o
上调作用二脱 一脱 姜黄素 o经 Φ检验 oΠ
s1st o与干预 ²¬2⁄促 ∂≥≤ 增殖作用相反 ∀以各
种姜黄色素浓度为 vv Λ°²¯#pt时与正常对照组比
较 o姜黄素的上调作用约为 uss h !一脱为 wss h !二
脱为 yss h k表 ul ∀
3 讨论
近年来的基础研究表明 o氧化修饰的脂蛋白
k²¬¬§¬½¨ § ¬¯³²³µ²·¨¬±l与 ≥性心脑血管疾病的发生发
表 u v种不同浓度的姜黄色素单体对
牛 ∂≥ ≤上 ⁄2 表达的影响kcξ ? σl
组别 浓度rΛ°²¯#pt 百分率vl
正常对照组 p tw qxu ? s qxs
姜黄素 yy wu qsw ? s qsxul
vv u{ qx{ ? s qxtul
ty qx tz qux ? s qsxtl
一脱甲氧基姜黄素 yy x| qu{ ? s quxul
vv xy qyx ? s qxyul
ty qx vt q{t ? s qvuul
二脱甲氧基姜黄素 yy yx qxx ? s qxsul
vv {u q{t ? s quzul
ty qx yz qzw ? s quxul
注 }与正常对照组比较tl Π s1sx oul Π s1st ~vl表示 t万个细胞
中能够表达有活性 ⁄2 的细胞所占的百分率
展有着非常密切的关系 ∀ ⁄经过氧化修饰后致
≥作用增强≈z o因为 ²¬2⁄既可以被巨噬细胞清
道夫受体k¶¦¤√¨ ∏ª¨µµ¨¦¨³·²µl结合 !吞噬形成 ≥的早
期病变 ) 泡沫细胞 o又可以刺激 ∂≥≤ 增殖及向内
膜迁移 o并激活血小板致血栓形成 ∀因此 o²¬2⁄
可能参与 ≥发生发展的全过程 o是目前已知的 ≥
危险因子 o对 ≥和高血压的发生起重要作用 ∀笔
者等在前期实验中已证实姜黄醇提取物有抑制 ²¬2
⁄促血管平滑肌细胞增殖的作用≈{ ~在分离姜黄
醇提取物后获得姜黄素 !一脱 !二脱 o发现这 v种同
系物能明显的抑制常规条件培养和存在血管紧张素
µ条件培养的 ∂≥≤的增殖作用≈y ∀本实验进一步
证明姜黄素 !一脱 !二脱能明显的抑制 ²¬2⁄促
∂≥≤增殖作用 o作用强度为姜黄素 一脱 二脱 ∀
其结果为更好控制姜黄醇提物质量 o稳定其在临床
降血脂抗 ≥中的疗效提供了实验依据 ∀
⁄2 是一种细胞表面糖蛋白 o广泛分布于动
物的大多数细胞表面 o以肝细胞含量最多 o平滑肌细
胞含量也较多 ∀⁄2 的主要功能是通过摄取 ⁄
进入细胞内 o产生游离胆固醇 o用于细胞增殖和固醇
类激素及胆汁酸盐的合成等 o血清中近 urv的 ⁄
是通过这一内吞途径清除的≈| ∀而 ⁄被摄入量
的多少取决于 ⁄2 的数量和活性 o因此 ⁄2 对
维持血浆中的 ⁄和胆固醇浓度发挥着重要作用 ∀
本实验表明 o姜黄素 !一脱 !二脱均能促进牛 ∂≥≤
⁄2 的表达 o上调作用的强度为二脱 一脱 姜
黄素 o目前国内外未见有关于这 v种同系物降脂作
用比较的报道 o有必要详细分析姜黄色素的结构与
功效关系 o以期更好的应用于临床 ∀
从结构看 o姜黄素和 u个衍生物的差别只在 u
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个苯环 v位上的甲氧基 o实验结果显示 o对 ²¬2⁄
促平滑肌细胞增殖的抑制作用 o其构效关系为 }u个
苯环 v位上均有甲氧基取代k姜黄素l 只有一个甲
氧基取代k一脱l 没有甲氧基取代k二脱l ∀说明姜
黄素苯环 v位上甲氧基团的存在对抗 ²¬2⁄!血管
紧张素 µ≈y 等的促 ∂≥≤的增殖有增强作用 ∀而对
牛平滑肌细胞上 ⁄2 的表达 o姜黄色素类均有明
显的上调作用 o其作用强度为二脱 一脱 姜黄素 o
与抑制 ∂≥≤的增殖作用相反 o即姜黄素苯环 v位
上有甲氧基存在 o对上调细胞 ⁄2 表达有明显的
减弱作用 ∀
≈参考文献
≈t 沃兴德 o崔小强 o唐利华 q姜黄素对食饵性高脂血症大鼠血浆
脂蛋白代谢相关酶活性的影响 q中国动脉硬化杂志 oussv ott
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白k¤l代谢的影响 q中国动脉硬化杂志 ot||| ozkwl }vv| q
≈v 沃兴德 o洪行球 o高承贤 o等 q姜黄醇提取物对食饵性高脂血
症动物和高脂血症患者降脂作用的研究概况 q浙江中医学院
学报 ot||{ ouukyl }z q
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©¬¥µ²¥¯¤¶·¶q ϑ Χελλ Βιολot|{t o|skvl }x|x q
≈y 洪行球 o赵革平 o黄燕芬 o等 q姜黄醇提取物中不同组分对血
管平滑肌细胞增殖的影响研究 q中医药学刊 oussw ouuktsl }
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≈z ≥·¨¬±¥¨µª ⁄o°¤µ·«¤¶¤µ¤·«¼ ≥ o≤¤µ¨º × ∞o ετ αλq
¨ ¼²±§¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ q
²§¬©¬¦¤·¬²±¶²© ²¯º2§¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²·¨¬±·«¤·¬±¦µ¨¤¶¨ ¬·¶¤·«¨µ²ª¨ ±¬¦¬·¼q
Ν Ενγλϑ Μεδ , t|{| ovusktwl }|tx q
≈{ 赵革平 o沃兴德 o洪行球 o等 q姜黄醇提取物对血管平滑肌细
胞增殖的影响 q浙江中医学院学报 ot||| ouvkvl }ut q
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(t1 Ζηεϕιανγ Τραδιτιοναλ Μεδιχαλ Χολλεγε , Ηανγζηου vtsss| , Χηινα ;
u1 Τηε Φιρστ Ηοσπιταλ οφ Ξιαοσηαν , Ηανγζηου vtsss| , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ¤±·¬2³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ²©·«µ¨¨§¬©©¨µ¨±·¶·µ∏¦·∏µ¤¯ ¦∏µ¦∏°¬± ³¬ª° ±¨ °²±²° µ¨¶²±·«¨ ¥²√¬±¨ ∂≥≤
¶·¬°∏¯¤·¨§¥¼ ²¬2⁄¤±§·«¨ ©¨©¨¦·²±·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©⁄2 q Μετηοδ : ×× ¤±§ƒ≤ º µ¨¨ ∏¶¨§·²²¥¶¨µ√¨·«¨ ¤±·¬2³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ²©·«µ¨¨
§¬©©¨µ¨±·²±·«¨ ¥²√¬±¨ ∂≥≤ ¶·¬°∏¯¤·¨§¥¼ ²¬2⁄¤±§·«¨ ©¨©¨¦·²±·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©⁄2 q Ρεσυλτ : ²¬2⁄ku qx ox ots °ª#ptl «¤§²¥2
√¬²∏¶³µ²¯¬©¨µ¤·¬√¨ ©¨©¨¦·²± ∂≥≤ o Π s qsx o¦∏µ¦∏°¬± kty1x ovv oyy Λ°²¯#ptl o§¨ ° ·¨«²¬¼¦∏µ¦∏°¬±kvv oyy Λ°²¯# ptl¤±§¥¬¶§¨ ° ·¨«²¬¼2
¦∏µ¦∏°¬± kyy Λ°²¯#ptl «¤§²¥√¬²∏¶¬±«¬¥¬·¬²± ©¨©¨¦·²±·«¨ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ²©∂≥≤ ¶·¬°∏¯¤·¨§¥¼ ts °ª#pt ²¬2⁄k Π s qsx o¦∏µ¦∏°¬±
§¨ ° ·¨«²¬¼¦∏µ¦∏°¬± ¥¬¶§¨ ° ·¨«²¬¼¦∏µ¦∏°¬±l q׫µ¨¨¦∏µ¦∏°¬± kty qx ovv oyy Λ°²¯#ptl ¦²∏¯§²¥√¬²∏¶¯¼ ¤¦·¬√¤·¨·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©⁄ ²©
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[ Κεψ ωορδσ] ¦∏µ¦∏°¬±~§¨ ° ·¨«²¬¼¦∏µ¦∏°¬±~¥¬¶§¨ ° ·¨«²¬¼¦∏µ¦∏°¬±~¶°²²·« °∏¶¦¯¨¦¨¯¯ ~²¬¬§¤·¬√¨ ²¯º §¨ ±¶¬·¼ ¬¯³²³µ²·¨¬±~⁄2 ~
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