全 文 :StudyonHPLCfingerprintofPrunelavulgaris
SUNWeiguang1,KEXuehong2,LIYuan3,HUARufeng2,CHENJinfu2
(1.GuangzhouXingqunPharmaceuticalLtd.Co.,Guangzhou510288,China;
2.FirstHospitalAfiliatedtoGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China;
3.ProvincialInstituteofMedicine,Guangzhou510440,China)
[Abstract] Objective:ToestablishHPLCfingerprintofPrunelavulgariseforqualitycontroloftheherbalmedicine.Method:
AsunfireC18analyticalcolumnwasused.ThemobilephaseAwas1% aceticacid,andmobilephaseBwasmethanol.Theelutionwas
ingradientmodeanddetectionwavelengfhwassetat290nm.Theflowratewas10mL·min-1andthecolumntemperatureat30℃.
Theanalysistimewas60min.Result:Thesimilarityof10batchesofPvulgariswasnotlowerthan0810.Thefingerprintsofthe
herbalmedicinewereclassifiedPvulgarisontheresultsofclusteranalysis.Conclusion:Thismethodisavailableforqualityevalua
tionandcontrolthequalityofPvulgaris.
[Keywords] Prunelavulgaris;fingerprint;HPLC;qualitycontrol
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20071106
[基金项目] 国家“十五”重大科技专项(2004AA2Z373015)
[通讯作者] 张朝凤,Tel:(025)85391245,Email:njchaofeng
@126.com
千里光药材的 HPLC指纹图谱及 ESIMS分析
张朝凤,陈录新,张 勉,王峥涛
(中国药科大学 生药研究室,江苏 南京 210038)
[摘要] 目的:建立千里光Senecioscandens药材的质量评价方法。方法:采用 HPLCUV对12批千里光药材
的指纹图谱进行比较研究,用LCESIMS技术对其共有峰进行分析。结果:获得千里光药材的HPLC指纹图谱,并
检出8个共有峰,LCESIMS分析结果表明共有峰主要为绿原酸或黄酮类成分的吸收峰。结论:建立的HPLC指纹
图谱可用于千里光的质量评价。
[关键词] 千里光;HPLC;指纹图谱;ESIMS分析
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18209304
千里光为菊科Compositae千里光属植物Senecio
scandensBuch.Ham.的干燥地上部分,我国应用历
史悠久的常用中药。本品以千里及之名始载于《本
草拾遗》,味苦、辛,性寒,清热解毒,明目退翳,杀虫
止痒。主治流感,上呼吸道感染,黄疸型肝炎,胆囊
炎,急性尿路感染,目赤肿痛翳障等[1]。主要分布
于我国浙江、江苏、安徽等地,广西、云南也有分布。
千里光HerbaSenecionisScandentis中化学成分主要
有黄酮、酚酸、生物碱类等[2]。国内外对千里光属
植物的研究较多,但针对千里光 Senecioscandens的
研究较少,且未被药典收录。为了合理利用药材资
源、有效控制其质量、完善药典,作者在获得有效成
分对照品金丝桃苷的基础上[3],建立了12批千里光
药材的HPLC指纹图谱,并对8个共有峰进行了LC
ESIMS分析,以期对千里光药材的质量控制提供理
论依据。
1 仪器、试剂与药材
Agilent1100高效液相色谱仪,G1313自动进样
器,G1314可变波长紫外检测器,HpChemstation
System色谱工作站,Agilent1100LCDADMS系统;
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医用数控超声波清洗仪(KQ-250DE,昆山超声仪
器有限公司);电子分析天平(METTLERTOLEDO
PL303型);1/1万电子分析天平(METTLERTOLE
DOAL104型);1/10万电子分析天平(SartoriusBT
25)。
乙腈(色谱纯,美国 Tedia公司),磷酸(分析
纯),甲醇(分析纯),水为超纯水(Milipore超纯水
纯化系统);金丝桃苷(hyperoside)对照品为自备,从
安徽繁昌采集千里光 S.candens中分离得到,结构
经TLC,NMR资料及文献比较确证。在本实验色谱
条件下按HPLC归一化法得纯度>98%。
千里光药材从安徽繁昌等地收集,共 12批药
材,编号为S1~S12(表1),均由张勉副教授鉴定,
凭证标本存放于中国药科大学生药研究室。
表1 12批千里光药材的样品
No. 采集地
采集
日期
No. 采集地
采集
日期
S1 安徽繁昌 200408 S7 云南昆明世博园 200503
S2 陕西西安 200503 S8 安徽亳州 200511
S3 河南郑州 200506 S9 四川新津 200507
S4 贵州贵阳 200403 S10 镇江宝华山 200508
S5 四川峨眉山 200403 S11 浙江天目山 200507
S6 安徽芜湖丫山 200506 S12 重庆标本园 200406
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
精密称取对照品金丝桃苷适量,加甲醇制成1
mL含金丝桃苷0056mg的对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
将样品60℃烘干6h,粉碎,过50目筛备用。
取样品粉末约10g,精密称定,置500mL圆底烧瓶
中,加入75%甲醇30mL,加热回流1h,放冷,过滤,
挥去溶剂,残渣用少量甲醇溶解并用流动相定容至
25mL量瓶中,摇匀,微孔滤膜(045μm)滤过,取
续滤液,得各供试品溶液。
2.3 色谱条件及系统适应性实验
AngilentZorbaxSB-C18色谱柱(46mm×250
mm,5μm);柱温25℃;流动相为003%磷酸水溶
液(A)和乙腈(B)梯度洗脱(表 2);检测波长 254
nm;流速1mL·min-1;进样量20μL;理论塔板数
按金丝桃苷计为18×104;拖尾因子为080,峰形
基本对称(图1)。
2.4 方法学考察
表2 流动相梯度洗脱程序
t/min A/% B/% t/min A/% B/%
0 98 2 50 82 18
5 98 2 65 75 25
10 93 7 68 0 100
35 84 16
A.千里光药材(S1);B.12批千里光药材(S1~S12);
1~8特征峰
图1 千里光药材指纹图谱
以S1号样品的主要色谱峰(1~8号峰,6号峰
为参照峰金丝桃苷,图1)的相对保留时间及相对
保留峰面积来考察分析方法的稳定性,仪器精密度
及实验方法的重现性。
2.4.1 稳定性试验 取S1号样品的供试品液分别
在0,4,8,12,36,48h进样20μL,记录指纹图谱,结
果表明各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比
值无明显变化,RSD分别为 093% ~25%和
11%~27%,显示供试品溶液至少在48h稳定,
符合指纹图谱要求。
2.4.2 精密度试验 取 S1号样品的供试品溶液。
重复进样6次,记录指纹图谱,结果表明各主要色谱
峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化,
RSD分别为004%~15%和049%~24%,符合
指纹图谱要求。
2.4.3 重复性试验 取S1号样材6份,精密称定,
按照2.2项下方法制备供试品溶液,记录指纹图谱,
结果表明各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积
比值无明显变化,RSD分别为 089% ~15%和
055%~26%,符合指纹图谱要求。
2.4.4 千里光药材指纹图谱的测定 分别精密12
批千里光药材的供试品溶液各20μL,注入液相色
谱仪,按照2.2项下方法制备供试品溶液,记录指纹
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图谱(图1),将6号峰(金丝桃苷)确定为内参比峰,
计算各色谱峰与内参比峰的保留时间及相对峰面积
值,各峰相对保留时间RSD小于3%,共有指纹峰的
峰面积之和大于90%。
2.5 数据处理
取上述12批样品,分别按照2.2项下方法制备
供试样品,并测定色谱图,将各样品色谱图导入“中
药色谱指纹图谱相似度评价系统”(中国药典委员
会2004A版),选定 S1号样品色谱图为参照图谱,
设定时间漂移值01,采用中位数法谱峰自动匹配,
自动生成对照谱(R)。各药材样品与对照图谱R比
较及相互比较,可得各药材相似度结果。共检出8
个共有峰,选定这8个峰位构成指纹图谱的稳定特
征峰。
2.6 共有峰的归属
取金丝桃苷对照品溶液20μL,得色谱图,对比
相对保留时间可知指纹图谱中的6号峰为金丝桃苷
对应的色谱峰,采用 LCESIMS并结合文献对共有
特征色谱峰进行分析。峰 2,3的准分子离子峰
[M-H]-均为m/z353。ESIMSMS分析中可检测
到由酯键断裂形成的m/z191[quinicacidH]-离子
即奎宁酸负离子、m/z173[quinicacidHH2O]
-离
子等绿原酸类化合物的特征碎片离子,结合绿原酸
标准品的色谱峰,推断2,3号峰为绿原酸类化合物;
4,5号峰的准分子离子峰[M-H]-均为 m/z609,
结合金丝桃苷的提取质谱图,对其进行MS2分析,含
有m/z301[M-H-308]-,可能为槲皮素负离子碎
片;MS3分析含有碎片 m/z1511,179,271,与金丝
桃苷碎片基本一致,推断均可能为含有五碳醛糖及
六碳醛糖取代基团的双糖苷化的黄酮类化合物;7
号峰,准分子离子峰[M-H]-为m/z463,与金丝桃
苷的相对分子质量相同,主要碎片峰基本一致,推测
可能为以槲皮素为母核,不同六碳醛糖取代的黄酮
醇苷类化合物;8号峰,准分子离子峰[M-H]-为
m/z447,金丝桃苷的相对分子质量相比校,相差
16,对其进行MS2,MS3分析,有m/z301,1511,179,
271等碎片峰,与金丝桃苷的基本一致,推测可能是
以槲皮素为母核,五碳醛糖取代的黄酮醇苷类化合
物。
3 讨论
比较了超声提取和水浴回流提取对千里光药材
的提取效果,结果表明,水浴回流提取完全,指纹图
谱中色谱峰高且多,效果比较好。比较25%,50%,
60%,75%,90%的甲醇,50%,75%,90%的乙醇对
千里光的提取效果。结果表明,75%甲醇回流提取,
指纹图谱中色谱峰高且多,效果比较好。
通过比较12个收集地的药材,可知千里光药材
的化学成分变化较大,共检出8个共有峰,并对其中
的7个共有峰进行 LCMS分析。结果表明,7个共
有峰可能为黄酮苷或绿原酸类成分。文献[45]报
道绿原酸(chlorogenicacid)具有清热解毒、消炎利
胆、抗菌、降血脂等生理功能;金丝桃苷具有抗炎、抗
菌、止咳等显著的药理活性。这二者活性与千里光
药材的主治上呼吸道感染、黄疸性肝炎、胆囊炎等临
床药效基本一致,提示黄酮苷或绿原酸类成分为千
里光的主要活性物质。
测定了12个收集地的千里光药材中金丝桃苷
的含量(表2),结果表明,贵州贵阳样品(S4)中金
丝桃苷的含量最高,在不同来源的千里光药材虽然
都出现了相应的主峰成分,但是峰面积比值差异较
大。提示中药必须在固定原产地及加工条件下才能
保证其质量稳定可控。如果控制其制剂的质量,在
固定工艺的基础上,确定药材的产地范围不宜太大,
以减少产地不同带来的影响。
[参考文献]
[1] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编.上册[M].北京:人
民卫生出版社,1975:112.
[2] 陈录新,李 宁,张 勉,等.千里光的研究进展[J].海峡药
学,2006,18(4):13.
[3] 陈录新,马鸿雁,张朝凤,等.千里光的化学成分研究[J].中国
中药杂志,2006,31(11):1872.
[4] 曹建国,赵则海,杨逢建,等.刺五加中金丝桃苷含量的测定
[J].植物学通报,2005,22(2):203.
[5] 杜延兵,裘爱泳.绿原酸生物活性、资源及其提取纯化[J].现
代食品科技,2006,22(2):250.
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HPLCfingerprintofHerbaSenecionisScandentisanditsESIMSanalysis
ZHANGChaofeng,CHENLuxin,ZHANGMian,WANGZhengtao
(DepartmentofPharmacognosy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210038,China)
[Abstract] Objective:TostudyandestablishthefingerprintsofHerbaSenecionisScandentisbyRPHPLCandLCMS.
Method:C18columnwasusedintheHPLCseparation.Themobilephasewascomposedofacetonitrileand003% phosphoricacid
withgradientelution.Theflowratewas10mL·min-1anddetectionwavelengthwas254nm.Result:Underthisselectedchromato
graphiccondition,goodHPLCfingerprintsofSenecioscandenswereobtained.Conclusion:HPLCfingerprintfacilitatetheevaluation
ofthequalityofHerbaSenecionisScandentis.
[Keywords] Senecioscandens;HPLC;fingerprint;ESIMSanalysis
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20080219
[基金项目] 科技部科研院所社会公益研究专项(2004DIB1JO
39)
[通讯作者] 张本刚,Tel:(010)62899725,Email:zhang
bengang@163.net
龙胆规范化种植中农药世高安全使用标准的研究
刘海涛1,刘洪科1,2,薛 健1,郑友兰2,陈 峰1,张本刚1
(1.中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所,北京 100094;
2.吉林农业大学,吉林 长春 130118)
[摘要] 目的:制定龙胆规范化种植中农药世高的安全使用标准,以保证其施用安全有效。方法:通过测定农
药世高在龙胆生长期的降解动态,计算农药世高在龙胆中的半衰期,从而制定农药世高的安全使用标准。结果:在
当地的气候条件下,农药世高在龙胆茎叶上的半衰期为684~690d。结论:龙胆规范化种植中,建议农药世高喷
施量应小于400g·hm-2,安全使用间隔期为40d。
[关键词] 世高;龙胆;降解动态;安全使用标准
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18209603
近年来,中药及其产品的质量引起了人们的高
度重视,中药材 GAP指导原则中明确规定,中药材
GAP生产要符合“无污染、无公害、绿色药材”的标
准。强调中药质量管理,加强中药材规范化种植管
理源头,农药的安全使用是其中的重要环节。
龙胆斑枯病 SeptoriagentianaeThüm.,褐斑病
SeptoriamicrosporaSpeg.是影响龙胆产量和品质的
重要原因,二三年生龙胆草发病率达84% ~100%,
减产高达50%~80%,是制约龙胆药材生产的关键
因素[12]。世高 10%苯醚甲环唑(difenoconazole)水
分散性粒剂(WG),化学通用名苯醚甲环唑,是三唑
类杀菌剂的一种,内吸性强,杀菌谱广。近年来因其
对斑枯病、叶斑病、白粉病等有较好的防治效果而被
广泛用于龙胆栽培中斑枯病的防治,但国内外有关
该农药在作物上安全使用标准的文献报道很少[35],
在中药龙胆上更是一个空白。本试验通过对农药世
高在龙胆中的残留分析和降解动态的研究,提出了
龙胆规范化种植中农药世高的安全使用标准,为龙
胆规范化种植中农药安全使用标准的建立提供了科
学参考。
1 仪器与试药
HP6890N气相色谱仪(电子捕获检测器),中性
氧化铝(100~200目,经430℃灼烧6h,再用5%蒸
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