全 文 :缓冲液 pH70。通过实验验证得蛋白质含量为
3018mg·g-1,提取工艺合理可行。
4 讨论
桑叶凝集素是一类结构各异的非酶非免疫来源
的能够与糖进行专一性可逆结合的蛋白或糖蛋白。
本研究采用考马斯亮蓝法测定桑叶凝集素含量,通
过蛋白质加样回收率实验得RSD为253%,说明此
种方法来测定合理可行,准确度较高。由桑叶浸提
液中蛋白质含量与凝血效价的显著线性关系可知,
用蛋白质含量来代替桑叶凝集素的含量是合理的。
由于TBS的pH随温度变化较大,所以本研究
选择 PBS作为提取缓冲液。通过单因素及正交试
验得出了桑叶凝集素的最佳提取条件,即料液比为
1∶60,NaCl浓度为0mol·L-1,时间为20h,提取
缓冲液pH值为70,这与单因素试验中得出的结
果不完全一致,因为单因素试验均只考虑了其中的
1个因素,当多个因素共同作用的时候会稍有差
别。凝集效价的检测方法允许有1~2孔的误差[1],
所以在表示凝集效价的时候有1~2孔变化异常也
是正常的。
[参考文献]
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[责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20080529
[基金项目] 国家“十一五”科技攻关项目(2006BAIO9B00602)
[通讯作者] 丁安伟,Tel:13951916435,Email:awding105@
163.com
[作者简介] 和颖颖,硕士,主要从事中药炮制工艺及质量标
准研究,Tel:15951891260,Email:heyy83@163.com;
正交法优选白茅根饮片炮切制的最佳工艺
和颖颖,焦 坤,丁安伟,张 丽,陈佩东
(南京中医药大学 江苏省方剂研究重点实验室,江苏 南京 210046)
白茅根为禾本科植物白茅 Imperatacylindrica
Beauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根茎,
味甘,性寒,具有凉血止血,清热利尿的功效,为《中国
药典》所收载。其主要成分为三萜、内酯、甾醇和有机
酸类,其中绿原酸的含量较高,又具有明显的止血作
用。目前对白茅根的研究多集中在化学成分及药理
作用方面,缺乏对其工艺的规范,故作者采用正交优
选法对白茅根饮片的炮制工艺进行了研究,以期筛选
出白茅根饮片的最佳炮制工艺。含水量是饮片的重
要质量指标;白茅根中所含的绿原酸含量较高,具有
止血等广泛的生理活性[1],符合白茅根饮片的临床应
用,同时白茅根饮片临床上常用水煎服治疗各种出血
等症状,因此选择绿原酸含量、水分及水溶性浸出物
作为指标,优选白茅根饮片的最佳炮制工艺。
1 仪器与材料
DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海医用
恒温设备厂),KQ-250E型医用超声波清洗器(功
率500W,频率40KHz),FW100型高速万能粉碎机
(天津泰斯特仪器厂),FA-1004电子分析天平(上
海天平仪器厂),Waters515型 HPLC,BWT550型石
英亚沸高纯水提纯器(江苏金坛高教仪器厂),C14
-10型剁刀式切药机(天津市中药机械厂)。
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中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol.33,Issue 21
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白茅根药材产地安徽,经中药鉴定教研室吴启
南教授鉴定;绿原酸对照品购自中国药品生物制品
检定所,批号110753200413;甲醇为色谱纯,水为重
蒸水,其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 试验设计
白茅根炮制工艺中的影响因素有水处理方式、
干燥温度与干燥时间等。考虑到2005年版药典在
描述白茅根生品炮制时应“洗净,微润,切断,干燥,
除去碎屑”[1],以加水量,浸润时间,干燥温度,干燥
时间作为因素,对各个因素相应安排了3个水平进
行实验,选用 L9(3
4)正交表安排实验,因素水平安
排见表1。取白茅根药材2kg,根据最常用的切段
规则软化后切制成05cm左右小段。称取9份50
g,05cm左右的小段按照正交试验安排进行,共制
成饮片9份白茅根样品,样品无重叠的平铺于托盘
中干燥。各样品性状为长约05cm不规则小段,外
部黄白色。
表1 因素水平
水平
加水量
/g·g-1
浸润时间
/h
干燥温度
/℃
干燥时间
/h
1 10 1 40 1
2 15 2 50 2
3 20 2 60 2
2.2 水溶性浸出物测定
照《中国药典》2005年版一部附录ⅩA操作,取
供试品2g,精密称定,置250mL锥形瓶中,精密加
水75mL,密塞,称定质量。静置1h后,连接回流冷
凝装置,加热至沸腾,并保持微沸1h,放冷后,取下,
称重。用水补足减失的质量,摇匀,过滤。
2.3 绿原酸含量测定
2.3.1 色谱条件 KromosilC18色谱柱(46mm×
150mm);流动相甲醇005%醋酸(14∶86);检测波
长326nm;流速10mL·min-1;柱温30℃。
2.3.2 供试品溶液的制备 取样品粗粉05g(过60
目筛),精密称定,置100mL锥形瓶中,精密加入50%
甲醇25mL,称定,超声(500/40kHz)提取45min,放
冷,用50%甲醇补足损失的质量,滤过即得[2]。
2.3.3 线性关系的考察 取绿原酸对照品10mg,
精密称定,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,得0994
0g·L-1的溶液作为对照品储备液,精密量取5mL
稀释至50mL。再分别量取1,2,3,4,5mL至10mL
量瓶中,分别精密吸取20μL进样高效液相色谱仪中
进行测定,以绿原酸的浓度为横坐标,以峰面积Y为
纵坐标,绘制标准曲线,回归方程得 Y=60040419X
-831195,r=09998(n=5),结果表明绿原酸在
000994~00497g·L-1线性关系良好。
2.3.4 精密度实验 取3号对照品溶液20μL,重
复进样6次,测得绿原酸峰面积的 RSD为091%,
表明本方法精密度良好。
2.3.5 重复性试验 取7号样品05g精密称定,共
6份,按供试品方法制备,进样20μL,测得绿原酸峰
面积的RSD为074%,表明本方法的重复性良好。
2.3.6 稳定性试验 取7号供试品溶液,分别于
0,2,4,8,12,24h进样20μL测定。测得绿原酸峰
面积的RSD为080%,结果表明供试品溶液在24h
内稳定。
2.3.7 加样回收率试验 取7号药材粉末6份,每
份约05g,精密称定,各加入04970g·L-1的标
准液1mL,按照3.2.3项下操作,配制成6份加样
的供试品溶液,在上述色谱条件进样分析,计算回收
率,结果见表2。
表2 绿原酸加样回收率
称样量
/g
样品中含量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
02502 0.5190 1020 1008
02505 0.5195 1028 1023
02495 0.5175 1001 9728
9928 195
02501 0.5185 1008 9849
02496 0.5175 1003 9769
02499 0.5185 1011 9909
注:加标量均为04970mg
2.3.8 样品含量测定 精密吸取供试品溶液20μL
进样,按上述色谱条件测定,含量测定结果见表3。
表3 正交试验结果
No. 水浸物/% 绿原酸/mg·g-1 综合评分
1 3305 211 9888
2 3643 200 9946
3 3718 190 9953
4 3458 170 9885
5 3512 232 9946
6 3565 157 9896
7 3860 208 9996
8 3726 185 9951
9 3867 125 9931
3 数据处理与分析
采用多指标实验公式评分法处理数据。在加权
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评分时,把绿原酸的最高含量值定为100分,把水
溶性浸出物的最高值定为100分,将各值换算成相
应的分数。水溶性浸出物加权占02,由于绿原酸
在药材中含量较高同时又有明显的止血作用,所以
设定绿原酸含量加权占08,以此分数为基础,进行
正交实验数据处理及方差分析。综合各因素和水平
的结果,见列表4。
表4 结果的方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F P
A 8907 2 4454 1503 >005
B 33189 2 16595 5600 <005
C 46425 2 23212 7833 <005
D(误差) 593 2 297
注:F005(2,2)=19,F001(2,2)=99
方差分析:由表5可以看出,因为 D项 R值最
小所以以D因素为误差项,B和 C2种因素对白茅
根饮片炮制影响最显著。
直观分析:由表4的极差(R)可以看出:在该正
交试验设定的因素、水平条件下,对综合评分影响大
小的因素进行分析,依次为 C>B>A,即 C因素影
响最大,其次为 B,再次为 A,D因素影响最小;同时
ⅠA>ⅡA>ⅢA,ⅡB>ⅠB>ⅢB,ⅢC>ⅠC>ⅡC,ⅡD
>ⅢD>ⅠD。因此,对综合质量评分而言,最佳炮制
工艺技术条件为A3B1C3D2。
由上述实验结果可以得到,白茅根最佳炮制工
艺条件为A3B1C3D2。即加入2倍量的水,润1h,60
℃烘2h。
4 工艺验证实验
为验证上述最佳工艺条件的科学性、定性和可
重复性,进行了3次验证实验,进一步考察正交实验
结果的准确性和可靠性。
取白茅根原药材3份,每份05kg,迅速洗净,
喷洒2倍量的水,然后浸润1h,置60℃烘制2h,取
出,晾凉,分别测定各指标成分的含量,结果水浸出
物质量分数分别为3862%,3743%,3765%。绿
原酸分别为211%,205%,209%。结果表明,验
证实验样品中各指标含量与正交实验优选结果相
近,说明优选的工艺条件稳定可行。
5 讨论
本研究以药材软化时的加水量、浸润时间、干燥
温度、干燥时间为考察因素,以绿原酸含量为主要指
标同时结合水溶性浸出物,采用正交设计法,优选白
茅根的软化切制工艺,经过研究确定白茅根最佳炮
制工艺条件为加入2倍量的水,润1h,60℃烘2h。
试验证明方法是稳定可行的,能适应于饮片的工业
化生产和规范化生产。
本试验采用多指标综合评判优选白茅根饮片的
软化切制工艺,符合中药综合作用的用药特点,可为
饮片规范化研究提供借鉴。
[参考文献]
[1] 冯丽华,江 丰,汪 玢.HPLC法测定白茅根中绿原酸的含量
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[责任编辑 鲍 雷]
本刊征订启事
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该领域新成果、新技术、新方法与新思路,内容包括栽培、资源与鉴定、炮制、药剂、化学、药理、不良反应、临床等。设有专论、综
述、研究论文、研究报告、临床、学术探讨、药事管理、经验交流、信息等栏目。
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