全 文 ：·研究报告·
刺五加体细胞胚胎发生过程中生理变化研究
王 义１，李 仙２，赵文君３，孙春玉１，张美萍１
（１吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 １３０１１８；
２哈尔滨工业大学（威海）分校，山东 威海２６４２０９；
３白山经济开发区管理委员会，吉林 白山１３４３００）
［收稿日期］ ２００８０４０６
［通讯作者］ 张美萍，Ｔｅｌ：（０４３１）８４５３１６３０，Ｅｍａｉｌ：ｗｚｈａｏｙｕｎ
＠ｔｏｍｃｏｍ
刺五加 ＡｃａｎｔｈｏｐａｎａｘＳｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（ＲｕｐａｅｔＭａｘ
ｉｍ）Ｈａｒｍｓ是五加科五加属的落叶灌木，别名刺拐
棒、老虎镣子、刺老芽等。春季其嫩茎、嫩叶作优质
山野菜食用；根、茎、叶、皮、果实均可入药。近年来，
刺五加的开发利用已引起了高度重视，国内外对刺
五加的研究主要集中在中药化学、药理作用、生态
学、繁殖技术、生物学等方面［１４］，组织和细胞培养方
面研究报道少［５８］，而对离体形态发生过程中生理变
化研究未见报道。新的研究表明，刺五加能有效地
抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老，提高免疫力，并对心血管有
很好的保护作用，是十分珍贵的药物资源。目前市
场供不应求，资源消耗与日俱增，已使刺五加植物濒
临灭绝。为实现其可持续利用，无性快速繁殖技术
是解决这一问题的重要手段，对保护和合理开发利
用这一药物资源具有重要的现实意义。
体细胞胚胎发生技术不仅成为植物快繁的重要
途径手段，而且也已发展成为研究植物胚胎发生机
制和遗传转化的重要系统，其在药用植物上的应用
也很受重视。本实验对刺五加体细胞胚胎发生过程
中生理生化指标及内源激素进行测定，为探讨刺五
加培养物体细胞胚发生的分子机制，以及刺五加生
物技术研究奠定理论基础。
１ 材料与方法
１１ 培养材料
选用不同的外植体，诱导愈伤组织的培养基为
ＭＳ＋２，４Ｄ１０ｍｇ·Ｌ－１＋ＢＡ０５ｍｇ·Ｌ－１；体细胞
胚诱导、发育和分化的最佳培养基为不添加任何生
长调节物质的ＭＳ培养基；之后在１／２ＭＳ培养基上
添加１０ｍｇ·Ｌ－１ＩＢＡ进一步生长获得再生植株。
蔗糖３０ｇ·Ｌ－１，琼脂６５ｇ·Ｌ－１，灭菌前 ｐＨ调至
５８，高温高压灭菌１５～２０ｍｉｎ。培养温度（２３±２）
℃，每日光照１６ｈ。培养材料每月继代１次。
１２ 试剂及仪器
考马斯亮蓝 Ｇ２５０、蒽酮、ＨＣｌＯ４、愈创木酚、丙
烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、ＥＬＩＳＡ试剂盒等，化学试
剂均为国产分析纯。
超净工作台（ＨＹＧ－Ａ）、高压灭菌器（ＬＳ－
Ｂ５０Ｌ）、紫外可见光分光光度仪（ＢｅｃｋｍａｎＤＵ６４０
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｔｅｉｎＡｎａｌｙｚｅｒ）、电泳仪及电泳系统
（ＤＹＹ－４型稳压稳流电泳仪）、离心机（ＢｉｍａｃＣＲ
２２Ｆ和 ＨｅｒａｅｕｓＳｅｐａｔｅｃｈＢｉｏｆｕｇｅ１５Ｒ）、移液枪（Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ）、酸度计（ＨＡＮＮＡｐＨ２１３）、天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ
ＢＳ２１０Ｓ）、酶标仪等。
１３ 方法
１３１ 生理生化指标的测定 可溶性蛋白质含量
测定［９］：称取体胚发生过程中不同时期的鲜样各
０５０ｇ，采用考马斯亮蓝 Ｇ－２５０染色法，在５９５ｎｍ
下比色，重复３次，取平均值。
可溶性糖含量测定［１０］：取体胚发生不同时期的
材料，剪碎，称取０１０～０３０ｇ，采用蒽酮法，在６２０
ｎｍ下比色。重复３次，取平均值。
淀粉含量测定：将提取可溶性糖以后的残渣，加
入９２ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌＯ４２ｍＬ提取１５ｍｉｎ，测定同可
溶性多糖，重复３次，取平均值。
过氧化物酶活性测定［１１］：取体胚发生不同时期
材料各１ｇ，采用愈创木酚法，在波长４７０ｎｍ比色，
重复３次，取平均值。
过氧化物同工酶电泳：取体细胞胚不同发育时
期的材料，加入少量石英砂研磨成匀浆，４℃，１万 ｒ
·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，取上清备用。用不连续垂直板
聚丙烯酰胺凝胶电泳，进样量２０μＬ，以溴酚蓝为指
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示剂，用稳流至终，即前沿指示剂距底部１～２ｃｍ时
结束。
将联苯胺显色液倾入２０ｃｍ培养皿中，待电泳
凝胶片加入后不断搅动，待显色后观察，记录结果。
１３２ 内源激素的ＥＬＩＳＡ测定 内源ＩＡＡ和ＡＢＡ
的测定均采用酶联免疫吸附法（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍ
ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）。激素测定试剂盒购自
中国农业大学化学控制中心，按照 ＥＬＩＳＡ说明书，
用酶联免疫检测仪进行测定，重复３次，取平均值。
２ 结果分析
２１ 可溶性糖含量
刺五加培养物在胚性愈伤组织阶段可溶性糖含
量达到高峰之后，随着体细胞胚的逐渐发育，含量逐
渐降低。胚性愈伤组织的可溶性糖含量为体细胞胚
的１１５倍、再生植株的２５２倍。刺五加体胚发生
过程中，有物质的积累和能量的消耗。胚性愈伤组
织含糖量高可能是为胚胎发生做准备，随着体细胞
胚发育成熟形成再生植株，渐渐消耗糖分（表１）。
表１ 体细胞胚胎发生过程中可溶性糖质量分数的变化 ％
发育时期 １ ２ ３
胚性愈伤组织 ２４８６ ２４６２ ２４８３
球形胚 ２１５２ ２１４１ ２１５１
子叶胚 １８２２ １８０９ １８１４
再生植株 ９７６ ９７０ ９９７
２２ 淀粉含量
从胚性愈伤组织阶段到球形胚时期，淀粉含量
迅速升高，然后逐渐降低。整个发育过程中淀粉积
累有２个高峰，即球形胚时期和子叶胚时期。从这
２个淀粉积累高峰推测，这些阶段的淀粉合成速度
大于分解速度，其意义在于为下一阶段细胞的迅速
分裂积累能量。淀粉是一种可迅速利用的贮藏能
源，其分解产物还可作为结构物质。因此认为，球形
胚时期的积累是为体细胞胚的进一步分化发育贮备
能量，而子叶胚时期的积累是为体细胞胚发育成熟
形成再生植株贮备能量。淀粉在体细胞胚胎发生中
的这２个重要时期进行积累，表明体细胞胚的发生
形成和发育是以必要的物质和能量基础为前提的，
淀粉的积累与体细胞胚的发生密切相关（表２）。
２３ 蛋白质含量
蛋白质含量在球形胚时期有１个明显的高峰。
在刺五加体细胞胚胎发生过程中，胚性愈伤组织阶
段蛋白质含量较低，到球形胚阶段含量达到最高，然
后随着胚的发育成熟蛋白质含量又下降。胚性愈伤
表２ 体细胞胚胎发生过程中淀粉质量分数的变化 ％
发育时期 １ ２ ３
胚性愈伤组织 ０３６９ ０３７１ ０３８２
球形胚 １７４５ １７２８ １７３８
子叶胚 １２５８ １２６９ １１８１
再生植株 ０３１２ ０３２８ ０３２
组织阶段蛋白质含量低，表明在刺五加体细胞胚胎
发生中，要消耗利用外植体贮藏的蛋白质来启动愈
伤组织的发生，说明在胚胎发生早期已经开始了与
胚胎发生有关代谢程序，而到球形胚期，蛋白质积累
较多，说明此阶段代谢旺盛，为胚胎的进一步发育提
供物质基础，此阶段也可能产生特异性蛋白，随着细
胞分化又逐渐消失（表３）。
表３ 体细胞胚胎发生过程中蛋白质质量分数
的变化 ｍｇ·ｇ－１
发育时期 １ ２ ３
胚性愈伤组织 ３９４８８６ ３９５０２１ ３９４７９９
球形胚 １９０４８７５ １９０４８５１ １９０４９０８
子叶胚 ４７０２９８ ４７０３５６ ４７０５２２
再生植株 ５３２６８６ ５３２８１０ ５３２７３９
２４ 过氧化物酶酶活性的分析
从酶活性变化曲线可以看出，在球形胚时期和
再生植株时期的酶活性高。在体细胞胚形成早期，
即球形胚时期有１个酶活性高峰，这个时期可能会
出现一些与胚胎发生相关的过氧化物酶，启动体细
胞胚的发生；而到体细胞胚成熟形成再生植株阶段，
酶活性再次升高，说明离体诱导再生植株的过程中
能量代谢和呼吸作用十分旺盛（表４）。
表４ 体细胞胚胎发生过程中过氧化物酶活性的变化
Ｕ·ｇ－１·ｍｉｎ－１
发育时期 １ ２ ３
胚性愈伤组织 ３５８４５６ ３５８４９８ ３５８８４６
球形胚 ５１７２６５ ５１７３８９ ５１７２４６
子叶胚 ３６４１２６ ３６４００５ ３６３８６９
再生植株 １０９２３０５ １０９２２５８ １０９２４３６
２５ 过氧化物同工酶的分析
刺五加体细胞胚胎过程中各个时期的过氧化物
同工酶酶谱合并起来，可显示的同工酶酶带共有９
条。非胚性愈伤组织有Ａ２，Ｂ２２条酶带，染色较深，
酶表达量高；胚性愈伤组织有 Ｂ２，Ｃ２条带，但染色
很浅，酶表达量低。２种愈伤组织在同工酶的种类
和表达量上有差异，但它们都有１条共同酶带 Ｂ２，
这个同工酶可能是启动脱分化或分化时必需的酶。
在刺五加体细胞胚胎发生过程中始终稳定表达 Ｅ，
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Ｆ，Ｇ３种同工酶，它们可能是维持细胞基础代谢的
一些基因表达产物。子叶胚的酶带变化比较明显，
早期子叶胚有７条酶带，但后期子叶胚只有３条。
在子叶胚后期不表达Ａ１，Ｂ１，Ｃ酶带，形成再生植株
后Ａ１，Ｂ１２种同工酶又重新表达（图１）。
１非胚性愈伤组织；２胚性愈伤组织；３球形胚；４早期子叶
胚；５后期子叶胚；６再生植株 Ａ１，Ａ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ为
刺五加胚胎发生过程中的各时期的过氧化物同功酶谱带
图１ 过氧化物同工酶电泳
在胚性愈伤组织和球形胚时期都出现 Ｃ酶带，
但表达量少，早期子叶胚表达量高，而后期子叶胚时
期Ｃ酶带消失，当形成再生植株时，Ｃ酶带又重新出
现。Ａ１，Ｂ１，Ｃ３种同工酶可能是与形成再生植株过
程相关的重要的同工酶。Ｄ酶带在子叶胚形成时出
现，当形成子叶胚之后消失，再生植株阶段重新出
现，Ｄ酶带的出现和消失可能与控制体细胞胚发育
的基因有密切关系。
２６ 体细胞胚胎发生过程中内源激素
２６１ ＡＢＡ含量的变化 由内源ＡＢＡ含量变化曲
线看出，从非胚性愈伤组织到胚性愈伤组织时期，内
源ＡＢＡ含量逐渐升高，此时胚性愈伤组织的内源
ＡＢＡ含量为非胚性愈伤组织的１４２倍左右。内源
ＡＢＡ逐渐升高，到球形胚时期达到高峰，为
７８２１３４５ｎｇ·ｇ－１，之后迅速降低，到子叶胚生根时
期略有回升。ＡＢＡ在球形胚时期含量最高，表明高
水平的内源ＡＢＡ是刺五加形成球形胚所必需的，到
子叶胚期内源 ＡＢＡ再次回升，说明 ＡＢＡ与体细胞
胚的后期成熟具有密切的关系（图２）。
２６２ ＩＡＡ含量的变化 各时期的含量呈对称性
分布。在刺五加培养物从非胚性愈伤组织到子叶胚
几个主要发育时期，ＩＡＡ含量先降低、到球形胚时期
达到最高峰，再迅速降低，子叶胚到根发生时期ＩＡＡ
含量又升高。球形胚时期有１个高峰，说明刺五加
体细胞胚胎发生早期需要维持较高水平的 ＩＡＡ，也
说明外源生长调节物质通过改变细胞内源 ＩＡＡ代
谢而启动体细胞胚胎发生过程（图２）。
１非胚性愈伤组织；２胚性愈伤组织；３球形胚；４早期子叶胚；
５后期子叶胚
图２ 体细胞胚胎发生过程中内源激素变化及
内源激素的平衡
２６３ 内源激素的平衡 植物内源激素对植物生
长发育的调空作用不仅取决于各种内源激素的绝对
含量，而且与各类激素在植物体内的相互平衡有密
切的关系。在植物体细胞胚胎发生过程中，内源激
素的平衡关系同样具有非常重要的作用。
根据上述２组试验数据进行 ＡＢＡ／ＩＡＡ的平衡
比较，其比值在体细胞胚胎发生过程中的变化比较
明显，从ＡＢＡ／ＩＡＡ的变化曲线可以看出，在分化培
养中胚性愈伤组织的 ＡＢＡ／ＩＡＡ高于非胚性愈伤组
织。形成体细胞胚之后，随着体细胞胚的分化，
ＡＢＡ／ＩＡＡ逐渐增加。从ＡＢＡ和ＩＡＡ的变化上可以
看出，胚性愈伤组织分化过程中，ＡＢＡ含量显著提
高，而ＩＡＡ含量则有暂时的降低过程，以至使 ＡＢＡ／
ＩＡＡ增大，有利于体细胞胚的形成。
３ 结论与讨论
３１ 淀粉含量与体细胞胚胎发生的关系
有研究表明，体细胞胚的形成及器官发生与淀
粉的消长紧密相关［１２１３］。淀粉作为植物细胞内积
累的一类重要生物大分子，经淀粉酶水解成葡萄糖
后，参与细胞内各种生理生化反应，以直接或间接的
方式影响体细胞胚胎发生［１４］。高锦华［１５］等在水稻
合子胚发育的研究中发现，淀粉的积累高峰总是出
现在蛋白质、核酸的合成高峰之前，表明淀粉的积累
可为蛋白质、核酸等物质的合成奠定基础。董合
忠［１６］报道了棉花体细胞胚胎发生过程中淀粉的积
累高峰出现在胚性细胞形成前和体细胞胚成熟萌发
前。王亚馥等［１７］发现小麦的淀粉积累高峰出现在
胚性细胞形成期和球形胚期。从前人的报道不难看
出，虽然不同植物淀粉的积累高峰不尽相同，但是大
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多出现在重要发育转折时期，是为新的发育阶段提
供能源的物质基础。
本研究在测定刺五加体细胞胚胎发生过程中淀
粉含量的变化时发现，淀粉的积累高峰出现在球形
胚时期和子叶胚时期，从这２个淀粉积累高峰推测，
这些阶段的淀粉合成大于分解的速度，其意义在于
为下一阶段细胞的迅速分裂积累能量。淀粉作为主
要的能源物质，在球形胚和子叶胚时期大量积累，是
为细胞的分裂和进一步分化提供能量。淀粉不仅是
一种可迅速利用的贮藏能源，其分解产物还可作为
结构物质。它的降解产物可为蛋白质、核酸、纤维素
等重要细胞结构物质的合成提供必要的碳架。淀粉
在体细胞胚胎发生和发育的这２个重要时期进行积
累，体细胞胚的形成和分化是以必要的物质和能量
基础为前提的，淀粉的积累与体细胞胚的发生密切
相关。
３２ 蛋白质含量与体细胞胚胎发生的关系
根据细胞形态结构和细胞内含物的变化，以
及酶化学分析表明，胚性细胞的分化和发育是一
个极其复杂的过程。然而有一点已形成共识，那
就是胚胎发生的实质是受基因调控的，是基因按
顺序表达的结果。基因表达的产物以一种活跃的
形式表现出来，故在胚性细胞分化与发育过程中
必然有蛋白质含量的变化和特异蛋白质的出现与
消失。有关体细胞胚胎发生中蛋白质含量和组分
的变化已有大量的研究报道，尽管有些结果不尽
相同，但变化的趋势是相似的，如在蛋白质含量
上，各类材料中胚性愈伤组织的蛋白质含量和合
成速率远高于非胚性愈伤组织，表明前者代谢活
性高于后者。在石刁柏的体细胞胚胎发生中蛋白
质含量分析也获得相似结果，特别是球形胚期蛋
白质含量最高［１８］。
本研究结果表明在刺五加体细胞胚胎发生过程
中，胚性愈伤组织阶段蛋白质含量较低，到球形胚时
期含量达到最高，然后随着胚的发育成熟蛋白质含
量又下降。胚性愈伤组织阶段蛋白质含量低，说明
在刺五加体细胞胚发生中，要消耗利用外植体贮藏
的蛋白质来启动愈伤组织的发生，也说明在体细胞
胚发生早期已经开始了与胚胎发生有关的代谢程
序。而到球形胚时期，蛋白质积累达到最高是为体
细胞胚的进一步发育提供物质基础，这与石刁柏［１８］
的结果一致。球形胚时期蛋白质含量最高说明此阶
段可能出现调控体细胞胚发生的一些特异蛋白之
后，随着体细胞胚的发育被降解，导致蛋白质含量迅
速下降。
３３ 糖类物质之间转换与体细胞胚胎发生的关系
可溶性糖含量变化与淀粉含量的变化有很大差
异，虽然两者都是糖类物质，但它们的合成和降解呈
不同规律。可溶性糖含量在愈伤组织阶段最高，本
研究结果表明胚性愈伤组织阶段可溶性糖出现一次
积累高峰，随后可溶性糖含量逐渐下降。而淀粉的
累积在球形胚时期出现一个高峰。由此推断，在外
植体脱分化时，淀粉降解转化成可溶性糖，为胚性细
胞的形成提供能量，而一旦形成胚性细胞，则可溶性
糖转化为淀粉，为胚的进一步发育准备物质基础。
由此进一步推测，糖类物质之间的转化与刺五加胚
胎发生密切相关。
３４ 体细胞胚胎发生过程中过氧化物酶的变化
在刺五加体细胞胚胎发生过程中，过氧化物酶
活性有２个高峰，即球形胚时期和再生植株阶段。
前人的报道中，未见再生植株阶段有过氧化物酶酶
活性高峰的结果，但球形胚时期过氧化物酶酶活性
出现一次高峰这一结果则与大蒜［１９］、杨树［２０］、胡萝
卜［２１］、白
［２２］、苜蓿［２３］等的结果一致。
本研究发现胚性和非胚性愈伤组织阶段有１条
相同的过氧化物同工酶酶带，这可能是外植体脱分
化所必须的同工酶。而体细胞胚发育阶段有３种过
氧化物酶同工酶稳定出现，它们可能是维持细胞基
础代谢的一些基因表达的产物，同时在胚胎发生过
程中伴随着新的酶带的出现和消失。组织在生长发
育过程中，酶分子的重新合成或酶前体的活化致使
新的酶带出现；酶分子在发育过程中的降解，使某些
酶带消失。过氧化物酶与能量和呼吸代谢密切相
关，因而可以认为过氧化物酶在体细胞胚胎发生过
程中起着重要的作用。
体细胞胚发生和发育过程中具有较高的过氧化
物酶活性和较多的同工酶种类，可以知道体细胞胚
胎发生过程中需要更多的能量和较大的呼吸强度。
体细胞胚胎发生、发育是大量酶特异性合成及参与
代谢的结果，深入探讨过氧化物酶及其他与体细胞
胚胎发生相关的酶，对进一步揭示植物体胚发生过
程中蛋白质及ＤＮＡ的变化，分离与体细胞胚胎发生
过程中特异性的蛋白及基因有重要的意义。
３５ 内源激素的变化与体细胞胚胎发生的关系
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在黑云杉和白云杉的体细胞胚胎发生中，胚的
生长需要较低的 ＡＢＡ；胡萝卜体细胞胚胎发生早
期，ＡＢＡ维持在一个低水平，球形胚发育成心形胚
和鱼雷形胚时增加；龙眼在子叶胚形成时ＡＢＡ达最
大值［２４］。郭子彪等［２５］的研究表明，内源激素 ＩＡＡ，
ＡＢＡ含量的高低影响到不同大豆品种愈伤组织诱
导和分化的难易，内源 ＩＡＡ含量高，愈伤组织容易
诱导，内源ＡＢＡ含量高，愈伤组织容易分化，胚性愈
伤组织的 ＩＡＡ和 ＡＢＡ含量高于非胚性愈伤组织。
赖钟雄［２６］的研究表明，龙眼胚性愈伤组织内源 ＩＡＡ
含量高于非胚性愈伤组织，从胚性愈伤组织发育到
早期子叶胚，内源 ＩＡＡ变化都维持在较高水平，并
且在胚性愈伤组织和球形胚２个时期出现高峰。之
后ＩＡＡ呈明显下降趋势。
刺五加体细胞胚胎发生过程中，ＡＢＡ是形成球
形胚所必需的，与体细胞胚的后期成熟有密切的关
系。维持较高水平的 ＩＡＡ是体细胞胚胎发生早期
的需要，也说明外源生长调节物质通过改变细胞内
源ＩＡＡ代谢而启动体细胞胚胎发生过程。ＡＢＡ／
ＩＡＡ增大，有利于体细胞胚的形成。因此，在培养过
程中可通过添加适量的外源激素对内源激素间的
ＡＢＡ／ＩＡＡ进行调节，有利于体细胞胚胎的发生，提
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［２５］ 郭子彪，盖钧镒内源激素 ＩＡＡ，ＡＢＡ对大豆萌发子叶胚性
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［２６］ 赖钟雄，陈春玲龙眼体细胞胚胎发生过程中的内源激素变
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［责任编辑 吕冬梅］
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第３３卷第１７期
２００８年９月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １７
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８