全 文 ：伴生菌对猪苓几种酶活性的影响
邢晓科 o郭顺星 3
k中国协和医科大学 中国医学科学院 药用植物研究所 o北京 tsss|wl
≈摘要  目的 }研究猪苓 Γριφολα υµβελλατα在与伴生菌 Χοµπανιον φυνγυσ共培养过程中 o伴生菌对猪苓几种酶的
活性影响 ∀方法 }测定与伴生菌共培养过程中猪苓菌丝几丁质酶 !Β2t ov2葡聚糖酶 !蛋白酶及胞外多酚氧化酶的活
性 ∀结果 }伴生菌能诱导猪苓几丁质酶及 Β2t ov2葡聚糖酶活性的提高 ~蛋白酶活性没有明显变化 ~液体培养时 o在培
养的后期猪苓与伴生菌共培养的发酵液中两种胞外多酚酶活性均居于猪苓与伴生菌单独培养的酶活性之间 ∀结
论 }伴生菌与猪苓的营养互补可能为猪苓提供一些菌核形成的相关物质 o从而有利于猪苓形成菌核 ∀
≈关键词  猪苓 ~伴生菌 ~几丁质酶 ~蛋白酶 ~多酚氧化酶
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlsw2svts2sw
猪苓 Γροφολα υµβελλατα k°¨ µ¶ql ƒµq系担子菌纲多
孔菌科多孔菌属真菌 o其菌核具有利水 !渗湿 !消肿
等功能 o猪苓多糖可提高人体免疫机能 o并有良好的
抗癌作用 ∀由于猪苓菌核生长慢以及缺乏有效保
护 o野生猪苓资源已濒临枯竭 o由此可见 o解决猪苓
菌核的人工培养 o即在人工培养条件下使猪苓由菌
丝形成菌核已是当务之急 ∀菌核的形成是一个非常
复杂的过程 o受到众多生物及理化因子的调控 o这也
正是长久以来一直没有培养成功的原因所在 ∀
近来 o郭顺星等≈t ou 从山西古县的野生猪苓穴中
分离到了一个与猪苓菌核形成密切相关的真菌 o称
其为伴生菌 o猪苓与伴生菌共培养 wx §后能够形成
菌核 ∀基于此 o研究两者在互作过程中 o伴生菌对猪
苓几丁质酶活性的影响及伴生菌在与猪苓共培养过
程中胞外酶活性的动态变化 o对明确伴生菌在猪苓
菌核形成过程中所起的作用有一定的参考价值 ∀
几丁质酶及 Β2t ov2葡聚糖酶广泛存在于自然界 o
而真菌中的几丁质酶及 Β2t ov2葡聚糖酶参与细胞壁
的合成≈v  !细胞壁的降解≈w  !菌丝生长≈x  !侵染≈y 及
防御≈z 等过程 o蛋白酶有时可能参与几丁质酶的诱
导≈{  ∀因此在两种真菌的互作过程中研究几丁质
酶 !Β2t ov2葡聚糖酶 !蛋白酶及胞外多酚酶活性的动
态变化则有实际意义 ∀
≈收稿日期  ussu2s{2uz
≈基金项目  国家重大科技专项/创新药物和中药现代化0基金
资助项目 ~国家杰出青年科学基金专项kvsvuxswzl
≈通讯作者  3郭顺星 oר¯ }kstslyu{|||yt| o∞2°¤¬¯}¶¬ª∏²ƒ «²·2
°¤¬¯q¦²°
1 材料与方法
1 q1 菌株来源
猪苓与伴生菌菌株均为本室提供 o保存麦麸平
板培养基上 ∀
1 q2 共培养体系的建立
所用培养基为 ≥ 培养基≈| k¶¼±·«¨·¬¦¤ª¤µ°¨ §¬2
∏°l o包含kª#ptl }ª≥’w#z‹u’ os qu ~Žu‹°’w os q| ~
Ž≤¯ os qu ~ ‘‹w‘’v ot qs ~葡萄糖 tx ~ ƒ u¨ n os qssu ~
±u n os qssu ~±u n os qssu ~维生素 …t os qsss t ~琼
脂 us o调 ³‹ y q{ ∀采用 | ¦°培养皿 o每皿加培养基
us °∀取猪苓与伴生菌的平板菌种 o用直径为 s qx
¦°的打孔器延菌落边缘打孔 ~共培养时每皿接入两
者各一块 o相距 v ¦°∀在两者菌丝接触前及发生接
触后的不同时期刮取猪苓菌落一侧菌丝 o用于测定
几丁质酶 oΒ2t ov2葡聚糖酶及蛋白酶的活性 ∀对照组
为单独培养的猪苓菌丝 ∀黑暗条件 ouu ε ∀
1 q3 液体摇瓶培养
用液体 °⁄„ 培养基 o分装到 txs °三角瓶 o每
瓶 xs°∀分别取猪苓及伴生菌平板培养菌种 o用
s qx ¦°直径的打孔器沿平板菌种外围打孔 o每瓶接
y片菌块 ∀实验分 v个处理 o猪苓单独培养 !伴生菌
单独培养及两者共培养 o每个处理 w个重复 o在两者
共培养中每种菌各接入v片 ∀黑暗条件 ouu ε otus
µ#°¬±pt ∀分别在接种后 x ots otx ous oux §测定愈创
木酚氧化酶及邻苯二酚氧化酶活性 ∀取样时均在超
净工作台上进行 o每次取 s qx °o取完样后继续培
养 ∀
1 q4 几丁质酶及 Β2t ov2葡聚糖酶活性的活性测定
#stv#
第 u|卷第 w期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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1 q4 q1 粗酶液的提取 取共培养的猪苓及对照组猪
苓菌丝 o加液氮研磨至粉末状 o然后按 tΒu的比例加
入 u °预冷的 s qt °²¯#ptk³‹ x qul的柠檬酸缓冲
液 o充分混匀 ots sssµ#°¬±pt离心 ts °¬±o取上清作为
粗酶提取液用于活性测定≈ts  ∀
1 q4 q2 几丁质酶活性测定 依照 …²¯¯¨µ等≈tt 所用的
方法 o酶活性单位为 ˜#°ªpt蛋白 ∀
1 q4 q3 Β2t ov2葡聚糖酶活性测定 粗酶提取液用昆
布多糖作底物 o反应液体积 s qx °o内含 t°ª昆布多
糖 os qt °²¯ #pt ³‹ x qu 醋酸缓冲液 ovz ε 保温 vs
°¬±o酶解产生的葡萄糖采用 ≥²°²ª¼≈tu 的方法测定 o
酶活性单位为 ˜#°ªpt蛋白 ∀
1 q5 蛋白酶活性测定
粗酶液提取方法同前 o所用的缓冲液为 ts °°²¯#
pt ³‹ z qu磷酸钾液 o含 s qt °°²¯#pt ∞⁄ׄ ∀蛋白
酶活性参照 „±¶²±≈tv 的血红蛋白水解法 o反应体系包
含 w °的底物和 s qx °的酶液 ovz ε 温浴 t «o加入
v °x h三氯乙酸终止反应 o上清液于 u{s ±°处测
吸光值 ∀酶活性单位为 ’⁄#°ªpt蛋白 ∀
1 q6 胞外多酚氧化酶的活性测定
愈创木酚氧化酶和邻苯二酚氧化酶的活性测定
参照文献≈tw 的方法 o测定波长分别为 w|s ±°和 wss
±°∀酶活单位均为 ’⁄#°ªpt蛋白 ∀
1 q7 提取液中蛋白浓度测定
用考马斯亮蓝法≈tx 测定 o以牛血清蛋白k…≥„l
为标准蛋白 ∀
2 结果
2 q1 几丁质酶的活性变化
图 t 与伴生菌共培养过程中猪苓菌丝中几丁质酶的活性变化
由图 t可以看出 o在接种后第 { §猪苓和伴生菌
菌丝开始发生接触 o在双方菌丝未发生接触前k共培
养至 { §前l o与伴生菌共培养中的猪苓菌丝与单独
培养的猪苓菌丝内几丁质酶活性没有明显区别 ~而
在双方菌丝发生接触后k共培养 { §后l o共培养中的
猪苓菌丝略高于单独培养的猪苓菌丝内的几丁质酶
活性 ~培养至第 tw §后 o共培养中的猪苓几丁质酶活
性急速增加 o在第 ty ∗ t{ §达到几丁质酶活性高峰 o
之后呈显著的下降趋势 ~而猪苓单独培养时 o几丁质
酶的活性并没有大的变化 ∀
2 q2 Β2t ov2葡聚糖酶的活性变化
图 u 与伴生菌共培养过程中猪苓菌丝中
Β2t ov2葡聚糖酶的活性变化
由图 u可见 o在猪苓和伴生菌菌丝未发生接触前
k共培养至 { §前l o共培养中的猪苓菌丝与单独培养
的猪苓菌丝内 Β2t ov2葡聚糖酶活性没有明显区别 ~
而在刚发生接触及接触后 w §内k共培养后 { ∗ tu
§l o单独培养的猪苓菌丝内略高于共培养中的猪苓
菌丝内的 ~在 tu天后 o与伴生菌共培养的猪苓菌丝内
的 Β2t ov2葡聚糖酶要高于单独培养猪苓菌丝内的酶
活性 ~在第 t{天时达到酶活性高峰 ~随即缓慢下降 ∀
2 q3 蛋白酶的活性变化
蛋白酶的活性测定结果见图 v ∀结果表明 o猪苓
单独培养或是与伴生菌共培养蛋白酶活性基本上没
有明显变化 o只有在培养的第 tw §及培养的后期 o与
伴生菌共培养的猪苓菌丝内蛋白酶活性才略微高于
单独培养 ∀
图 v 猪苓与伴生菌共培养过程中蛋白酶的活性变化
2 q4 胞外多酚氧化酶的活性变化
由图 w可以看出 o在接种后培养至 ts §以前 o猪
苓 !伴生菌及两者共培养的发酵液中邻苯二酚氧化
酶的活性基本相同 o而在 ts §后 o猪苓单独培养的发
酵液中邻苯二酚氧化酶活性明显高于伴生菌单独培
养及共培养 o伴生菌的邻苯二酚氧化酶活性最低 o两
者共培养发酵液中邻苯二酚氧化酶活性居于两者单
独培养中间 ∀由图 x可以看出 o伴生菌单独培养的愈
#ttv#
第 u|卷第 w期
ussw年 w月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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创木酚氧化酶活性则明显高于猪苓单独培养及两者
共培养 o在培养的 tx §后 o愈创木酚氧化酶的活性均
有所下降 o共培养发酵液中愈创木酚氧化酶活性仍
居于两者单独培养的酶活性中间 ∀
图 w 猪苓与伴生菌共培养过程中发酵液内
邻苯二酚氧化酶的活性变化
图 x 猪苓与伴生菌共培养过程中发酵液内
愈创木酚氧化酶的活性变化
3 讨论
真菌的互作可以诱导几丁质酶产生 o如 Œ±¥¤µ和
≤«¨·≈y 发现寄主菌 Σ . ρολφσιι中的活性成分k可能是蛋
白酶l参与菌寄生真菌哈茨木霉 Τριχηοδερµα ηαρζινυµ
几丁质酶的诱导 o作者也发现在猪苓与伴生菌的共
培养过程中 o伴生菌能在不同程度上影响猪苓的几
丁质酶活性 o在培养的后期 o与伴生菌共培养的猪苓
菌丝内几丁质酶及 Β2t ov2葡聚糖酶活性均高于猪苓
单独培养 ∀对猪苓和伴生菌共培养的宏观形态观察
发现 o在双方菌丝刚开始接触 o彼此并没有表现出相
互的抑制作用 o而是相互交织生长 o在培养约 vx §
后 o则在接触界面形成明显的拮抗线 o说明两者菌丝
之间发生了相互作用 ∀通过对培养前期几丁质酶及
Β2t ov2葡聚糖酶活性的测定正说明了伴生菌对猪苓
几丁质酶及 Β2t ov2葡聚糖酶活性的诱导 o而最终导致
拮抗线的形成 ∀但与伴生菌共培养的猪苓菌丝内蛋
白酶的活性与猪苓单独培养相比并没有发生明显的
变化 o说明在伴生菌对猪苓几丁质酶活性的诱导过
程中 o蛋白酶并不是其主要的活性成分 ∀
多数真菌依赖分泌胞外酶将一些大分子物质降
解为能吸收的小分子营养物质 o胞外酶的活性强弱
在一定程度上决定了菌株对培养料的生物转化率 ∀
实验发现伴生菌与猪苓共培养 wx §后能使猪苓形成
菌核 o而猪苓单独培养则不形成菌核 o通过对猪苓与
伴生菌培养过程中发酵液中两种胞外多酚氧化酶的
活性测定发现 o在培养的后期两者共培养的发酵液
中胞外酶活性均处于两者单独培养的中间 o说明猪
苓与伴生菌之间可能存在一定的营养互补 o在猪苓
菌核形成过程中所需的一些物质可能通过伴生菌分
泌一些胞外酶降解供其吸收 o同样伴生菌在生长过
程中的一些物质也可能由猪苓降解 ∀通过研究两者
共培养的胞外酶活性后可以初步得出这样的结论 o
伴生菌与猪苓的营养互补可能为猪苓提供一些菌核
形成的相关物质 o从而有利于猪苓形成菌核 ∀
≈参考文献 
≈t  郭顺星 o王秋颖 o张集慧 o等 q猪苓菌丝形成菌核栽培方法的
研究 o中国药学杂志 ousst ovy }yx{ q
≈u  Š∏² ≥ ÷ o • ¤±ª ± ≠ o«∏¤±ª • ≠ o ετ αλ. ⁄¬¶¦²√¨ µ¼ ¤±§¤³³¯¬¦¤·¬²±
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ΦΕΜΣ Μιχροβιολ Λεττ , t|{| oyu }ust q
≈z  杨文博 o冯 波 o佟树敏 q链霉菌 ≥st菌株对植物病原菌的拮
抗作用 q微生物学通报 ot||z ouw }uuw q
≈{  Œ±¥¤µo ≤«¨·Œq ׫¨ µ²¯¨ ²© µ¨¦²ª±¬·¬²± ¬± ·«¨ ¬±§∏¦·¬²± ²©¶³¨¦¬©¬¦
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t||x otwt }u{uv q
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¤±§¨¯¬¦¬·²µq Πλαντ Πηασιολ, t|{w ozy }ysz q
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«¤¨ °²ª¯²¥¬±q ϑ Γεν Πηψσιολ, t|v{ ouu }z| q
≈tw  倪新江 o潘迎捷 o冯志勇 q香菇生长过程中几种胞外酶活性的
变化 q食用菌学报 ot||x oukwl }uu q
≈tx  …µ¤§©²µ§   q蛋白质的定量法 q第二版 q北京 }农业出版社 q
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第 u|卷第 w期
ussw年 w月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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Εφφεχτσ οφ χοµ πανιον φυνγυσ ον σεϖεραλ ενζψµατιχ αχτιϖιτιεσ οφ Γροφολα υµβελλατα
÷Œ‘Š ÷¬¤²2®¨ o Š˜’ ≥«∏±2¬¬±ª
(Ινστιτυτε οφ Μεδιχιναλ Πλαντ ∆εϖελοπµεντ , Χηινεσε Αχαδεµψ οφ Μεδιχαλ Σχιενχεσ & Πεκινγ Υνιον Μεδιχαλ Χολλεγε , Βειϕινγ tsss|w , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ ©¨©¨¦·²©¦²°³¤±¬²±©∏±ª∏¶²± ¶¨√ µ¨¤¯ ±¨½¼°¤·¬¦¤¦·¬√¬·¬¨¶²© Γριφολα υµβελλατα . Μετηοδ : ≤«¬·¬2
±¤¶¨ oΒ2t ov2ª¯∏¦¤±¤¶¨ o³µ²·¨¬±¤¶¨ ¤±§ ¬¨·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ ±¨½¼° ¶¨²© Γ . υµβελλατα º µ¨¨ ° ¤¨¶∏µ¨§§∏µ¬±ª§∏¤¯ ¦∏¯·∏µ¬±ª º¬·«¦²°³¤±¬²± ©∏±ª∏¶q
Ρεσυλτ : ≤²°³¤±¬²±©∏±ª∏¶¦²∏¯§¬±§∏¦¨ ·«¨ ¬±¦µ¨¤¶¨ ²© ¦«¬·¬±¤¶¨ ¤±§ Β2t ov2ª¯∏¦¤±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶²© Γ . υµβελλατα q ±²¨ √¬§¨±·¦«¤±ª¨¶º µ¨¨
©²∏±§¬± ³µ²·¨¬±¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼q • «¨ ±¬± ¬¯´∏¬§¦∏¯·∏µ¨ o·«¨ ¤¦·¬√¬·¬¨¶²© ¬¨·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ ±¨½¼° ¶¨¬± §∏¤¯ ¦∏¯·∏µ¨§©¬¯·µ¤·¨ º µ¨¨ ¥¨·º¨¨ ± ²©·«¨ ¶¨ ²© Γ .
υµβελλατα ¤±§¦²°³¤±¬²±©∏±ª∏¶¬± °²±²¦∏¯·∏µ¨¶qΧονχλυσιον : ≥¦¯ µ¨²·¬¤§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±µ¨ ¤¯·¨§°¤·¨µ¬¤¯¶¶∏³³¯¬¨§¥¼ °∏·∏¤¯ ±∏·µ¬·¬²±¤¯ ¶∏³³¯ 2¨
° ±¨·¥¨·º¨¨ ± Γ . υµβελλατα ¤±§¦²°³¤±¬²±©∏±ª∏¶¦²±§∏¦¨ ·²¶¦¯ µ¨²·¬¤¯ ©²µ°¤·¬²± ²© Γ . υµβελλατα q
[ Κεψ ωορδσ] Γροτολα υµβελλατα~¦²°³¤±¬²±©∏±ª∏¶~¦«¬·¬±¤¶¨ ~³µ²·¨¬±¤¶¨ ~³²¯¼³«¨ ±²¯ ²¬¬§¤¶¨
≈责任编辑 王康正 
喇叭唇石斛组织培养的研究
常 俊 o丁小余 3 o保曙琳 o刘冬扬 o贺 佳 o唐 凤 o丁秉中
k南京师范大学 生命科学院 o江苏 南京 utss|zl
≈摘要  目的 }筛选喇叭唇石斛快速繁殖体系的适宜培养基及培养条件 ∀方法 }对基本培养基 !光照条件 !激
素 !天然提取物浓度等进行比较研究 ∀进行叶绿素含量 !可溶性蛋白含量测定 ∀结果 }‘y 培养基是种胚萌发成苗
适宜培养基 o而 tru ≥ n ‘„„ s qx °ª#pt易于原球茎膨大增殖 ∀先暗培养 us §再光照培养有利于胚的萌发及苗的
生长 ∀tru ≥ n ‘„„ s ∗ s qx °ª#pt有利于原球茎大量增殖 o‘y n y2…„ u qs °ª#pt n ‘„„ s qx °ª#pt n ts h马铃薯
汁是原球茎分化的适宜培养基 o添加激素和马铃薯汁促进叶绿素和可溶性蛋白含量上升 ∀ ‘y n ‘„„ s qx °ª#pt n
ts h香蕉汁生根壮苗最适宜 ∀结论 }无机盐浓度 !氮源形态 !光照条件对胚萌发生长影响较大 ~氮源形态对原球茎
增殖有影响 ~叶绿素含量 !可溶性蛋白含量能反映组培苗的生长状态 o可作为筛选培养基参考指标 ∀
≈关键词  喇叭唇石斛 ~组织培养
≈中图分类号  • u{v ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlsw2svtv2sv
石斛是常用名贵中药材 o在5神农本草经6中被
列为上品 !有滋阴清热 !生津益胃 !润肺止咳 !明目强
身等功效≈t  ∀近年来 o野生石斛资源日渐枯竭 o铁皮
石斛已处于濒危状态 o市场上枫斗类石斛的商品种
类繁多 !基源复杂 ∀经调查 o我国国内上海等地市场
上所售的紫皮枫斗主要由两种石斛属植物加工而
成 o一种为齿瓣石斛 ∆ενδροβιυµ δεϖονιανυµ °¤¬·q≈u  !
另一种为喇叭唇石斛 ∆ . λιτυιφλορυµ ¬±§¯ q¬± Š¤µ§∀
由这两种石斛加工成的枫斗味甘 !柔韧 !黏性强 o被
视为仅次于铁皮枫斗的药材珍品 ∀喇叭唇石斛的植
≈收稿日期  ussv2s|2us
≈通讯作者  3 丁小余 oר¯ }ksuxl{vx|{uty o∞2°¤¬¯}§¬±ª¬¼±­ƒ
uyv q±¨ ·
株高达 vs ∗ ws ¦°或更长 o粗 z ∗ ts °° o在枫斗类石
斛药材中产量较高 !黏性强 ∀因此 o对质优高产的喇
叭唇石斛 !齿瓣石斛进行组织培养研究十分必要 o但
尚未见有此类报道 ∀本试验首先对野生喇叭唇石斛
进行了胚培养和快速繁殖等研究 ∀
1 材料
实验所用喇叭唇石斛的原植物k带蒴果l采自我
国石斛主产区云南勐腊与老挝边境地区的原始森
林 ∀为避免与相似种的混淆 o在经典形态学观察的
基础上利用其 µ⁄‘„ Œ×≥区全序列对所采集的喇叭
唇石斛进行了分子鉴定≈v  ∀
2 方法
2 q1 材料处理 取生长良好未开裂的果实 o用
#vtv#
第 u|卷第 w期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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