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Βιοπηψσ Αχτα , usss otwzx }uz q
≈y 王伯瑶 o吴 琦 q内源性抗生素肽2天然免疫的重要介质 q生
命科学 ot||| ottk¶∏³³¯tl }yw q
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( Ηυαξι Ηοσπιταλ, Μεδιχαλ Χεντερσ οφ Ωεστ Χηινα , Σιχηυαν Υνιϖερσιτψ, Χηενγδυ ytsswt , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ·«¨µ¤³¨ ∏·¬¦° ¦¨«¤±¬¶° ²©µ«∏¥¤µ¥¬± ³µ²·¨¦·¬±ª·«¨ ¬±·¨¶·¬±¤¯ °∏¦²2° °¨¥µ¤±²∏¶¥¤µµ¬¨µ¬±·«¨
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§¬±2t ¤±§¦µ¼³·§¬±2w ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¥¨·º¨¨ ±·«¨ ·º²ªµ²∏³¶k Π s1sxl q Χονχλυσιον : «∏¥¤µ¥¦²∏¯§¬±¦µ¨¤¶¨ ¶¨¦µ¨·¬²± ²©¶¨√ µ¨¤¯ ¬°°∏±¨
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[ Κεψ ωορδσ] «∏¥¤µ¥~¬±·¨¶·¬±¤¯ ¬°°∏±¨ ©∏±¦·¬²±~ª∏·°∏¦²2° °¨¥µ¤±²∏¶¥¤µµ¬¨µ
≈责任编辑 方文贤
≈收稿日期 ussx2sv2ty
≈基金项目 江苏省农业攻关项目k
∞ussuvvyl
≈通讯作者 3马海乐 oר¯ }ksxttlx{yuvyu o∞2°¤¬¯}°«¯ ∏¶q¨§∏q¦±
无花果残渣中抗肿瘤成分的超临界
≤u萃取和抑瘤试验
王振斌 o马海乐 3
k江苏大学 生物与环境工程学院 o江苏 镇江 utustvl
≈摘要 目的 }研究无花果残渣中抗肿瘤功效成分的超临界 ≤u萃取技术及萃取物的体内外抗肿瘤效果 ∀方
法 }采用 ××法检测萃取物质的体外抗肿瘤活性 o研究残渣中抗肿瘤功效成分的最佳萃取条件 ~采用 ×× 法研究
萃取物质对 |vz细胞 !|x⁄细胞和 ≥细胞 v株肿瘤细胞株的体外抑制作用 ~以小鼠移植性肝癌 ³¨¶为对象 o研
#vwwt#
第 vs卷第 t{期
ussx年 |月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs o¶¶∏¨ t{
≥¨ ³·¨°¥¨µoussx
究萃取物对体内肿瘤的抑制作用 ∀结果 }超临界 ≤u提取的最佳工艺条件为 }粉碎度 tss目 o萃取压强 vs °¤o萃
取温度 wx ε o萃取时间 y «o气体流量 tu #«p t o萃取得率为 ux1v ª#®ªpt o得到的萃取物在体外对 |vz细胞 !|x⁄细
胞和 ≥细胞具有一定的抑制作用 o≤xs分别为 zs1tux otuz1|xz otty1sss Λª#°pt ∀萃取物对小鼠移植性肝癌 ³¨¶
在 ux °ª#®ªp t的剂量时抑瘤率为 w|1v h ∀结论 }本萃取工艺合理 !稳定 ∀可以为无花果残渣和无花果中抗肿瘤功
效成分的提取提供参考 ∀
≈关键词 无花果 ~残渣 ~抗肿瘤 ~超临界 ≤u ~××
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussxlt{2twwv2sw
无花果是一种桑科榕属植物 o其花托k即果实l !
根 !叶均可药用 o具有润肺止咳 !健胃清肠 !消肿解
毒 !增强机体免疫功能 !抑制多种肿瘤功效 o主治咽
喉肿痛 !喘咳 !肠炎 !痢疾 !便秘 !痔疮 !疥癣等 o近年
来无花果抗肿瘤特性尤其受到人们的重视≈t2v ∀研
究认为无花果的抗肿瘤活性部位在石油醚和醋酸乙
酯等脂溶部分≈v o所以无花果榨汁以后 o抗肿瘤功效
成分大部分还留在残渣中 ∀目前无花果加工过程中
产生大量的残渣常常作为废弃物处理 o不但造成资
源的白白浪费 o而且还会引起环境污染 ∀笔者采用
近年来新兴的超临界 ≤u 萃取技术≈w ox o研究了无
花果残渣中抗肿瘤功效成分的提取方法 o并对萃取
物进行了体内外抗肿瘤试验 ∀本研究不仅可以大大
的降低无花果抗肿瘤药物生产的成本 o而且对无花
果的综合利用也具有积极的意义 ∀
1 材料与仪器
无花果残渣 }由江苏省丰县中研无花果开发有限
公司提供无花果 o经江苏大学生药研究所欧阳臻研究
员鉴定为桑科榕属植物无花果 Φιχυσ χαριχα 1 o品种
为日本紫果 ∀压榨取汁后得到残渣 o经 wx ε 烘干备
用 ∀肿瘤细胞系 }|vzk人白血病细胞株l o|x⁄k猪肺
癌细胞株l o≥k人胃癌细胞株l o中国科学院上海药
物研究所肿瘤细胞库引进 o并在本室长期传代培养 ∀
细胞生长于含 ⁄∞ !谷氨酰胺 !碳酸氢盐及 ts h小
牛血清的培养液中 o每间隔 w{ «更换 t次培养基 ∀
小鼠移植性肿瘤模型 }肝癌实体型 ³¨¶o由中
国科学院上海药物研究所提供 ∀ 小鼠 }雌雄各
半 o体重 t{ ∗ uv ªo由南京青龙山动物伺养中心提
供 ∀细胞生物级试剂 }××k四甲基偶氮唑l o≥¬ª°¤
公司 ~⁄∞ o¬¥¦²公司 ~新生小牛血清 o杭州四季
青公司 ~x氟脲嘧啶kx2ƒ∏l o江苏南通制药厂 ∀试验
设备及仪器 }二氧化碳培养箱 o µ¨¤¨ ∏¶公司 ~酶标仪
k∞p vwsl o美国
¬²·¨¦®公司 ~|y 孔培养板 o美国
≤²µ±¬±ª公司 ∀ 超临界 ≤u 萃取设备 o江苏华安
超临界萃取设备公司 ∀
2 方法
211 无花果残渣中抗肿瘤功效成分的超临界 ≤u
萃取技术≈w ox
21111 物料粉碎度和气体流速的确定 选取粉碎
度为 tss目 o二氧化碳流速为 tu #«pt ∀
21112 抗肿瘤功效成分萃取压强的确定 无花果
残渣经干燥 o粉碎至 tss目 o称取 t sss ªo在萃取温
度 wx ε o分离压强 y °¤o分离温度 v{ ε o气体流量
tu #«pt的条件下 o初始萃取压强 ts °¤o依次提高
x °¤o各压强段分别提取 { «o分别得到 x个压强段
的组分 o即 ks ∗ ts °¤l o
kts ∗ tx °¤l o≤ktx ∗ us
°¤l o⁄kus ∗ ux °¤l o∞kux ∗ vs °¤l ∀采用 ××
法≈y2ts 测定各组分的抗肿瘤性能 o取对数期生长的
|vz肿瘤细胞株 o细胞数调整为 u ≅ tsx#°pt o加入
|y孔板中 o每孔 |s Λ∀细胞在培养箱中放置 w «待
贴壁后再加待测样品 o样品用丙酮溶解 o终含量为
tss Λª#°pt o每孔 ts Λo阴性对照为等体积的丙
酮 ~细胞在 vz ε ox h ≤u培养箱中孵育 zu «后 o分
别加入 x °ª#°pt ×× o每孔 ts Λ∀继续培养 w «
后 o每孔加入 ⁄≥ tss Λo放置 t «后 o用酶标仪在
xzs ±°波长下测定各孔的 Α值 ∀实验重复 v次 ∀
21113 萃取温度与得率的关系 无花果残渣经干
燥 o粉碎至 tss目 o称取 t sss ªo萃取压强 vs °¤o分
离压强 y °¤o分离温度 v{ ε o气体流量 tu #«pt o
萃取时间 { «的条件下 o分别研究在萃取温度 vx o
ws owx oxs oxx oys ε 时 o萃取温度与得率的关系 ∀
21114 萃取时间与得率的关系 无花果残渣经干
燥 o粉碎至 tss目 o称取 t sss ªo萃取压强 vs °¤o萃
取温度 wx ε o分离压强 y °¤o分离温度 v{ ε o气体
流量 tu #«pt o研究萃取时间 t ou ov ow ox oy oz o{ «
时 o萃取时间与得率的关系 ∀
212 萃取物的抗肿瘤试验
21211 体外抗肿瘤试验 采用 ××比色法≈y2ts o即
#wwwt#
第 vs卷第 t{期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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≥¨ ³·¨°¥¨µoussx
取对数期生长的细胞 o|vz细胞数调整为 u ≅ tsx#
°pt o|x⁄和 ≥为 u ≅ tsw#°pt o加入 |y孔板中 o
每孔 |s Λo细胞在培养箱中放置 w «待贴壁后再加
待测样品 o无花果残渣超临界 ≤u萃取物k以下简称
为 • l用丙酮溶解 o每孔 ts Λ∀阴性对照为等体
积的丙酮 o受试样品终含量为 uss otxs otss oxs oux Λª
#°pt ~细胞在 vz ε ox h ≤u 培养箱中孵育 zu «
后 o分别加入 x °ª#°pt ×× o每孔 ts Λ∀继续培
养 w «后 o每孔加入 ⁄≥ tss Λo放置 t «后 o用酶
标仪在 xzs ±°波长下测定各孔的 Α值 ∀实验重复
v次 ∀抑瘤率计算公式为 }
抑瘤率k h l k受试药品的 Α值2阴性对照的 Α值l ≅
tss h r阴性对照的 Α值
21212 体内抗移植性肿瘤试验 按照中华人民共
和国卫生部药政局5抗肿瘤药物药效学指导原则6进
行≈tt ∀取健康 !肿瘤生长旺盛的荷瘤小鼠 o颈椎脱
臼处死 o无菌条件下取出瘤块 o制备成单细胞悬液 o
调节细胞密度为 t ≅ ts{#°pt o接种于健康小鼠右
前肢下 o每只 s1u °∀接种后 uw «随机分组 o每组
ts只 o分对照组k给予相应溶媒l !给药组k给予不同
剂量的 • l和阳性药对照组kx2ƒ∏l o并开始分别
灌胃给药 o每日给药 t次 o连续 {日 o停药 uw «后颈
椎脱臼处死小鼠 o称体重 o解剖剥离瘤块 !胸腺和脾
脏 o分别称重 o对照组平均瘤重 t ª以上可进行结果
分析 ∀按公式计算抑瘤率 !脾指数和胸腺指数 oτ检
验统计处理 ∀试验重复 v次 o抑瘤率 ∴vs h以上判
断为有一定的抗癌作用 ∀
抑瘤率k h l kt p给药组平均瘤重r对照组平均瘤重l ≅
tss h
脾指数 ≈脾脏重k°ªlr体重kªl ≅ ts
胸腺指数 ≈胸腺重k°ªlr体重kªl ≅ ts
213 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对小鼠碳廓清
作用的影响≈tu
小鼠随机分成 v组 o每组 ts只 o分对照组k给予
相应溶媒 us °#®ªpt#§ptl !低剂量组k给予 • ux
°#®ªpt#§ptl和高剂量组k给予 • tss °#®ªpt#
§ptl o并开始分别灌胃给药 o每日给药 t次 o连续 {
§o最后 t次给药后 uw «o尾静脉注射印度墨汁k用前
以生理盐水稀释 {倍lts °#®ªpt ∀注射后 tx °¬±
于眼静脉窦取血 vs Λo置于含蒸馏水 t1x °的小
试管内 ∀含血的标本于 yss ±°波长比色 ∀按下列
公式计算吞噬指数 和校正廓清指数 Αoτ检验统计
处理 ∀试验重复 v次 ∀
Κ ²¯ªΑt p ²¯ªΑu·u p·t
Α v ≅体重rk肝重 n脾重l
上式中 : Αt , Αu为不同时间所取血样的吸光度 o
τu2τt为取两血样的时间差 ∀
214 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对小鼠溶血素
形成的影响≈tu
小鼠随机分成 v组 o每组小鼠 ts只 o分对照组
k给予生理盐水 us °#®ªpt#§ptl o低剂量组k给予
• ux °ª#®ªpt#§ptl ~高剂量组k给予 • tss °ª
#®ªpt#§ptl o灌胃给药 o连续 | §∀给药 u §后 o腹腔
注射 x h鸡红细胞 s1u °免疫 o免疫 z §后 o摘除眼
球取血 o分离得到血清 ∀取用生理盐水稀释 tss倍
血清 t1s °ox h 鸡红细胞悬液 s1x °ots h 补体
s1x °混合 o在 vz ε 恒温水浴中孵育 vs °¬±后 s ε
中止反应 ∀离心 o取上清液于 zut分光光度计 xws
±°波长处比色 o以不加血清作空白对照调零 ∀按下
式计算每个样品的半数溶血值k≤xsl oτ检验统计
处理 ∀试验重复 v次 ∀
≤xs 样品的吸收度羊红细胞半数溶血时的吸收度 ≅稀释倍数
3 结果与分析
311 无花果残渣中抗肿瘤功效成分的超临界 ≤2
萃取
31111 不同压强段的超临界 ≤u 萃取物对肿瘤细
胞的抑制率 表 t表明在 x个压强段萃取得到的物
质均有抗肿瘤效果 ∀
表 t 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对
|vz细胞的抑制率
压强段r°¤ ∗ ts ts ∗ tx tx ∗ us us ∗ ux ux ∗ vs
抑瘤率r h zt qvw {w qxw ys qws ws qz| yx q{t
31112 萃取温度对萃取得率的影响 当温度低于
wx ε 时 o得率随着温度的升高而增加 o当温度高于
wx ε 时 o得率随温度的升高有所下降 o因此萃取温
度选择 wx ε 为宜 ∀
31113 萃取时间与得率的关系 萃取时间以 y «为
宜 o此时萃取得率为 ux1v ª#®ªpt ∀
312 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对肿瘤细胞的
抑制作用
采用 ××法检测 • 的体外抗肿瘤效果 o从
表 u可以看出 • 的瘤谱较广 o对 |vz细胞 !|x⁄
#xwwt#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs o¶¶∏¨ t{
≥¨ ³·¨°¥¨µoussx
细胞和 ≥细胞均表现出一定的细胞毒性 o并且在
试验浓度范围内 o毒性随着药品剂量的增加而增加 o
表现出良好的量效关系 ∀
表 u 无花果残渣超临界 ≤u萃取物k • l体外对肿瘤
细胞的抑制率
肿瘤细
胞株
不同 • 剂量kΛª#°ptl 抑瘤率r h
ux xs tss txs uss
≤xs
rΛª#°pt
|vz vu qu wz qw xy qx {u q{ {z qz zs qtux
|x⁄ uu qw vv q| xs qy w| qs yz qx tuz q|xz
≥ ux qy vy qt w{ q{ xy q| zs qu tty qsss
313 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对小鼠体内肿瘤
的抑制作用
为进一步研究无花果残渣中萃取物质的抗肿瘤
效果 o笔者采用灌胃的给药方式进行了体内抗肿瘤试
验 o研究 • 对小鼠移植性肝癌 ³¨¶的抑制作用 o
同时检测了脾指数和胸腺指数 o结果如表 v所示 ∀
从表 v可以看出 • 对移植性肝癌 ³¨¶有良
好的抑制作用 o给药剂量为 ux1ss °ª#®ªpt o抑瘤率
达 w|1vs h ~试验最高抑瘤率为 yy1uv h ∀在试验的
剂量范围内 o抑瘤率kΨ)和药物剂量( Ξl间呈良好的
线性关系 oΨ s1s| Ξ n w{1|w oΡu s1|xt v ∀
314 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对小鼠免疫促
表 v 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对小鼠移植性肝癌 ³¨¶的抑制作用及对其脾 !胸腺指数的影响kcξ ? σ, ν tsl
组别
剂量
r°ª#®ªpt ≅ §
给药前体重
rª
给药后体重
rª
瘤重
rª
抑瘤率
r h 脾指数 胸腺指数
对照组 uu qv vu qx v qs{ ? s qzw zw q|z ? ty qwv vt qxt ? w qwv
• ux ≅ { uu qs vt qs t qxz ? s qw{ w| qvsul {v qzs ? ty quxtl vz qyu ? z qzttl
• xs ≅ { uu qs vt qz t qv| ? s qux xw q{zul {y q{u ? uw qyvtl vu qss ? { qwytl
• tss ≅ { ut q| u{ qs t quy ? s qu{ x| qs|ul {u qxz ? tu qwztl xt q|t ? u| qtstl
• uss ≅ { ut qx uz qz t qsw ? s qvx yy quvul {t qyy ? ts qvytl vz qxz ? tt qwztl
x2ƒ∏ ux ≅ { uu qx u| qw s q{| ? s qus zt qtsul |t qzz ? us qu{tl vu qtw ? ts qt|tl
注 }与对照组相比tl Π s1st ~ul Π s1sstk表 w ox同l
进作用的研究
31411 无花果残渣超临界 ≤u 萃取物对小鼠碳廓
清作用的影响 从 • 对小鼠碳廓清实验结果
k表 wl可以看出 o• 能显著提高正常小鼠的单核
吞噬系统的碳粒廓清的指数及校正廓清指数 ∀
31412 血清溶血素的测定 表 x可以看出 o•
明显增加了小鼠血清中溶血素的含量 ∀
表 w 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对碳廓清
作用的影响 kcξ ? σl
组别 剂量r°ª#®ªpt 吞噬指数 Κ 校正廓清指数 Α
空白 s qszx st ? s qssv | z qu|s w ? s qt{s {
• ux s qtw| { ? s qstt tul | qxzs x ? s qus| |
tss s qt|| z ? s qstu vul | qssu ? s qvuw v
注 }本试验重复 v次k表 x同l
表 x 无花果残渣超临界 ≤u萃取物对小鼠溶血素
形成的影响kcξ ? σl
组别 剂量r°ª#®ªpt ≤xs
对照 vtu ? xy
• ux z{s ? |stl
tss {tu ? zttl
4 讨论
无花果残渣的超临界 ≤u萃取物在体外对 v种
肿瘤细胞均表现一定的抑制作用 o说明其在体外具
有一定的细胞毒性 ∀体内试验也表现较明显的抗肿
瘤特性 o体内服用剂量 ux °ª#®ªpt时 o对移植性肝癌
³¨¶的抑制率达到 w|1v h o动物在饲养期间体重增
加 o活动正常 o说明萃取物对小鼠没有明显毒性 o有
望成为一种良好的抗肿瘤药物 ∀
无花果残渣超临界 ≤u萃取物抗肿瘤的原理可
能是通过增强免疫能力k尤其是细胞免疫能力l和直
接杀伤肿瘤细胞两条途径达到抑制肿瘤效果的 ∀
无花果榨汁后的残渣中抗肿瘤的有效物质在各
个压强段均有分布 o说明残渣中的抗肿瘤活性成分
复杂 ~已经报道无花果中抗肿瘤活性成分有苯甲醛
和香豆素类等物质 o更多的有效成分有待进一步的
发现 ∀
对无花果残渣k包括无花果l抗肿瘤有效成分提
取技术的研究还远远不够 ∀笔者认为还有很多的工
作需要进一步的研究 o包括 ≠ 超临界 ≤u 萃取技术
得到的粗提物的进一步分离 ~ 抗肿瘤活性物质的
纯化和结构鉴定 ~≈抗肿瘤机制的探索 ∀
≈参考文献
≈t 曹尚银 o杨福兰 o吴 顺 q无花果抗癌作用研究新进展 q林业
科技开发 oussw okul }tv1
≈u 张华英 q无花果的研究与产业化发展对策 q资源开发与市场 o
#ywwt#
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∂²¯1vs o¶¶∏¨ t{
≥¨ ³·¨°¥¨µoussx
ussv okxl }vtw1
≈v 徐新春 q吴明光 1 无花果本草考证 q中国中药杂志 ousst o
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仙碱 q中南大学学报k自然科学版l oussw okul }uww1
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社 ousss1{t1
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究 1 中国中医药信息杂志 oussw okvl }usy1
≈z 聂小华 o敖宗华 o尹光耀 o等 q提取技术对温莪术挥发油化学
成分及其体外抗肿瘤活性的影响 q药物生物技术 oussv okvl }
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≈{ 赵东旭 o杨新林 o陈 霖 o等 q灵芝孢子中抗肿瘤成分的提取
与分离 q中国中药杂志 ousss okxl }u{{1
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协和医科大学联合出版社 ot||z1u{w1
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人民卫生出版社 oussu1tz{x1
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导原则汇编 }抗肿瘤药效学指导原则 1t||v1tvz1
≈tu 李仪奎 1 中药药理实验方法学 1 上海 }上海科学技术出版
社 ot||t1txz1
Στυδψ ον αντι2χανχερ χοµ πονεντσ οφ Φιγ Ρεσιδυεσ ωιτη
συππερχριτιχαλφλυιδ ΧΟu εξτραχτινγ τεχηνιθυε
• «¨ ±2¥¬±o ¤¬2¯ ¨
(ϑιανγσυ Υνιϖερσιτψ, Σχηοολ οφ Βιολογιχαλ ανδ Ενϖιρονµενταλ Ενγινεερινγ , Ζηενϕιανγ utustv , Χηινα)
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≈责任编辑 方文贤
5中国医院药学杂志6征订启事
5中国医院药学杂志6系中国科协主管 !中国药学会主办的综合性医院药学专业性学术核心期刊 ∀本刊主要面向全国医
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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