全 文 ：淫羊藿苷对人成骨细胞增殖与分化的影响
殷晓雪，陈仲强，党耕町，马庆军，刘忠军
（北京大学 第三医院，北京 １０００８３）
［摘要］ 目的：观察淫羊藿苷对人成骨细胞增殖和分化的影响。方法：将人骨髓基质干细胞定向诱导分化为
成骨细胞，取第３，４代细胞，ＭＴＴ法观察淫羊藿苷对人成骨细胞的增殖作用，碱性磷酸酶（ＡＬＰ）比活性测定观察淫
羊藿苷对人成骨细胞分化的影响，ＲＴＰＣＲ方法检测淫羊藿苷对人成骨细胞 ＢＭＰ２ｍＲＮＡ表达的影响。结果：浓度
为２０μｇ·ｍＬ
－１的淫羊藿苷能够显著促进人成骨细胞的增殖和分化，且使ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的表达升高。结论：淫羊藿苷
具有促进人成骨细胞增殖和分化的作用，这一作用可能与其升高人成骨细胞ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的表达有关。
［关键词］ 淫羊藿苷；成骨细胞；增殖；分化
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００５）０４０２８９０３
［收稿日期］ ２００４１１２９
［通讯作者］ 殷晓雪，Ｔｅｌ：（０１０）６２０１７６９１２５５７，Ｅｍａｉｌ：ｙｘｘ２７３３
ｃｎ＠ｓｉｎａｃｏｍ
淫羊藿为小檗科植物大花淫羊藿 Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍ
ｍａｃｒａｎｔｈｕｍ Ｍｏｒｅｔ Ｄｅｃｎｅ、 心 叶 淫 羊 藿
ＥｂｒｅｖｉｃｏｒｎｕｍＭａｘｉｍ和箭叶淫羊藿 Ｅｓａｇｉｔａｔｕｍ
Ｍａｘｉｍ的全草，别名仙灵脾［１］。其主要化学成分为
黄酮、苷和多糖。已有研究表明，淫羊藿总黄酮对摘
除卵巢所致大鼠骨质疏松症有良好的防治作用［２］，
而且能够促进体外培养的大鼠成骨细胞的增殖及分
化［３］。作者在以往的实验中，已经建立起由人骨髓
基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的方法［４］，为
了进一步了解淫羊藿防治骨质疏松的作用机理，本
实验以淫羊藿苷为研究对象，以增殖和分化为指标，
观察其对人成骨细胞的影响。
１ 材料与仪器
ＤＭＥＭ高糖培养基、胰蛋白酶，Ｔｒｉｚｏｌ试剂为
Ｇｉｂｃｏ产品，ＴａｑＤＮＡ聚合酶为 Ｐｒｏｍｅｇｅ公司产品，
ＭＴＴ，β甘油磷酸钠，抗坏血酸为 Ｓｉｇｍａ产品，胎牛血
清为Ｈｙｃｌｏｎｅ兰州合资生产；改良的 Ｌｏｒｙ法蛋白检
测试剂盒购自邦定泰克公司。ＢＭＰ２引物由上海申
工合成，βａｃｔｉｎ引物由赛百胜公司合成。淫羊藿苷
标准品购自中国药品生物制品检定所，编号 ０７３７
２００１１１。
酶标仪（ＥＬＸ８００，Ｂｉｏ－ＴＥＫＩＮＣＡｍｅｒｉｃａ），全
自动生化分析仪（Ｏｌｙｍｐｕｓ５４００，Ｊａｐａｎ），ＰＣＲ仪（Ｇｅ
ｎｅＡｍｐＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００，Ａｍｅｒｉｃａ）
２ 方法
２１ 人成骨细胞的培养 采取人骨髓基质干细胞
定向诱导分化为成骨细胞的方法，具体步骤如另文
所述［４］。人骨髓取自无代谢性骨病的脊柱手术患
者，术前经患者同意，于术中取髂骨块植骨时，顺便
以骨穿针于伤口处抽吸骨髓约４ｍＬ，离心后接种于
７５ｃｍ培养瓶，５ｄ后半量换液，待细胞完全贴壁融
合后，胰酶消化，传代，换诱导培养基继续培养。诱
导培养基组成：含１０％胎牛血清的 ＤＭＥＭ高糖培养
基加入地塞米松、抗坏血酸及β甘油磷酸钠，终浓度
分别为１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１，５０μｇ·ｍＬ
－１，１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１。取
此法定向诱导的第３，４代细胞进行以下实验。
２２ ＭＴＴ法检测淫羊藿苷对成骨细胞增殖的影响
根据预实验的结果，选取效果最好的２０μｇ·ｍＬ
－１
作为淫羊藿的最终实验浓度。将淫羊藿溶解在微量
的ＤＭＳＯ中，用诱导培养液配制为所需浓度。取体
外扩增的第３代成骨细胞，以每孔５×１０４的浓度铺
于９６孔板。实验共分３组，淫羊藿组，对照组，空白
组。每组１２个复孔。淫羊藿组加入终浓度为２０μｇ
·ｍＬ－１的药液；对照组仅有等量细胞，不加药物；空
白组既无细胞也无药物。各孔均补足培养液至２００
μＬ，ＣＯ２孵箱中培养。４８ｈ后取出培养板，吸弃培养
液，ＰＢＳ清洗２遍，每孔加０１ｍＬＰＢＳ及１０μＬＭＴＴ
（５ｍｇ·ｍＬ－１），置入温箱中继续培养。４～６ｈ后每孔
加裂解液（含１０％ ＳＤＳ的１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ）１００μＬ
继续置入温箱中，３７℃孵育过夜，酶标仪检测每孔
５７０ｎｍ波长的吸光度，即 Ａ值。此实验重复３遍。
２．３ ＡＬＰ比活性检测淫羊藿苷对成骨细胞分化的
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第３０卷第４期
２００５年２月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３０，Ｉｓｓｕｅ ４
Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２００５
影响 取体外扩增的第３代成骨细胞，以２×１０５／孔
的浓度铺于 ４８孔板。同上分为淫羊藿组和对照组
２组，每组６个复孔。ＣＯ２孵箱中培养。７２ｈ后取出
培养板，吸弃培养液，ＰＢＳ清洗 ２遍，每孔加入细胞
裂解液３００μＬ，细胞刮刀刮掉贴壁细胞，收集每孔细
胞裂解悬液，液氮反复冻融 ３次，６０００ｒ·ｍｉｎ－１４℃
离心１５ｍｉｎ，吸取上清 ２００μＬ，一分为二，１００μＬ用
于测定蛋白含量（改良的Ｌｏｒｙ法蛋白检测试剂盒），
另 １００μＬ在全自动生化分析仪上测定 ＡＬＰ含量。
ＡＬＰ含量与蛋白含量的比值即为 ＡＬＰ的比活性。
本实验重复３遍。
２．４ ＲＴＰＣＲ检测ＢＭＰ２ｍＲＮＡ表达 取体外扩增
的第４代成骨细胞，以每瓶２×１０６的浓度分别接种
于２个培养瓶，一瓶为淫羊藿组，另一瓶为对照组。
淫羊藿组在细胞接种 ８ｈ后加入终浓度为 ２０μｇ·
ｍＬ－１的淫羊藿苷，对照组不加药物仅加入等量培养
液。ＣＯ２孵箱中培养。５ｄ后取出培养瓶，Ｔｒｉｚｏｌ法提
取ＲＮＡ，逆转录合成 ｃＤＮＡ；２０μＬ反应体系包括：样
品ＲＮＡ２μＬ，５×逆转录缓冲液４μＬ，ＭＭＬＶ逆转录
酶２００，Ｒｎａｓｉｎ２５Ｕ，随机引物 １μＬ，ｄＮＴＰｓ２μＬ，
ＤＥＰＣ水补至２０μＬ，３７℃温育１ｈ，９４℃２ｍｉｎ终止
反应。对照管用 ＴＥｂｕｆｅｒ代替总 ＲＮＡ，其余均相
同。ＰＣＲ：取３μＬ逆转录产物进行 ＰＣＲ扩增，２５μＬ
反应体系，其中ＭｇＣｌ２２５μＬ，４种ｄＮＴＰ各２５０μｍｏｌ·
Ｌ－１，Ｔａｑ酶 ２５Ｕ，ＢＭＰ２上下游引物各 ２５ｐｍｏｌ·
Ｌ－１，βａｃｔｉｎ上下游引物各 １０ｐｍｏｌ·Ｌ
－１。９４℃预变
性５ｍｉｎ，进入ＰＣＲ循环：９４℃１５ｓ，５９℃１５ｓ，７２℃
３０ｓ，３０个循环后７２℃延伸５ｍｉｎ。
ＢＭＰ２上游引物：５’ＧＴＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴＴＣ
ＧＡＧＴＴ３’；下游引物５’ＴＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＧ
ＧＴＧＡＴ３’。ＰＣＲ产物３０８ｂｐ［５］。
βａｃｔｉｎ上游引物：５’ＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴ
ＧＣＣＧＣＡ３’；下游引物：５’ＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣ
ＴＧＴＣＡＧＣＡ３’。ＰＣＲ产物２７５ｂｐ［６］。
ＰＣＲ产物行 ２％琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像
系统分析照相。
２．５ 统计学处理 所有数据均用珋ｘ±ｓ表示，用
ＳＰＳＳ软件对实验数据进行分析，组间比较采用 ｔ检
验。
３ 结果
３．１ 对细胞增殖的影响 浓度为２０μｇ·ｍＬ
－１的淫
羊藿苷能显著促进人成骨细胞的增殖，与对照组比
较 Ｐ＜００５，差异有显著性（表１）。
表１ 淫羊藿苷４８ｈ对人成骨细胞增殖的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）
组别 Ａ５７０
淫羊藿组／２０μｇ·ｍＬ
－１ ０６８６±００３９１）
对照组 ０３６７±００２３
空白对照组 ００３９１±００１
注：与对照组比较１）Ｐ＜００５（表２同）
３２ 对细胞分化的影响 浓度为２０μｇ·ｍＬ
－１的淫
羊藿苷能显著提高人成骨细胞的碱性磷酸酶比活
性。与对照组比较 Ｐ＜００５，差异有显著性（表２）。
表２ ７２ｈＡＬＰ比活性测定结果（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 比活性／Ｕ·μｇ
－１
淫羊藿组／２０μｇ·ｍＬ
－１ ６６００８７６±２６６３４８１）
对照组 ４０２１０２８±１２８６９４
３３ 对 ＢＭＰ２ｍＲＮＡ表达的影响 加入淫羊藿苷
培养 ５ｄ后，人成骨细胞 ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的表达比对
照组显著升高（图１）。
图１ ＲＴＰＣＲ检测ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的表达
Ｍ：ＤＬ２０００；１淫羊藿苷作用的人成骨细胞 ＢＭＰ２和βａｃｔｉｎｍＲ
ＮＡ扩增产物；２对照组ＢＭＰ２和βａｃｔｉｎｍＲＮＡ扩增产物
４ 讨论
骨质疏松症在世界常见病、多发病中位居第 ７
位，中国目前骨质疏松症患者已超过９０００万，即每
１４人中有 １人患病，绝经后妇女的发病率更高［７］。
由骨质疏松引发的骨折不仅给患者造成身心痛苦，
而且给社会造成巨大的经济负担。因此，骨质疏松
症的预防和治疗势在必行。利用祖国医学的优势，
开发经济、安全、有效的中医药，是防治骨质疏松症
的重要方面。
现代药理学研究证实，淫羊藿具有性激素样作
用，能促进骨髓细胞 ＤＮＡ合成，促进骨组织蛋白质
合成及促进大鼠成骨细胞生长，同时还能够诱导兔
破骨细胞的凋亡［８］。由于种属的差异，以上基于动
物骨细胞的研究结果并不能完全替代淫羊藿对人骨
细胞的作用。因此，我们采用定向诱导分化骨髓基
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质干细胞的方法培养人成骨细胞，以测定淫羊藿苷
对其增殖和分化的影响，所得结果可能更接近临床。
骨质疏松病理机制的一个重要方面是成骨细胞
的增殖与分化受到抑制，不能形成足量的骨胶原蛋
白和非胶原性蛋白，从而使骨小梁变得稀疏、断裂，
骨质量和骨量均下降。成骨细胞不仅决定骨的形
成，同时也调节破骨细胞对骨的吸收，是骨代谢的主
要功能细胞，其增殖很大程度上决定了最终形成的
骨量。因此防治骨质疏松的关键是提高成骨细胞的
增殖能力和分化水平。作者在预实验中发现，浓度
为５，１０μｇ·ｍＬ
－１的淫羊藿苷对成骨细胞的增殖没有
显著影响，４０μｇ·ｍＬ
－１淫羊藿苷对成骨细胞的增殖
有一定的抑制作用，而２０μｇ·ｍＬ
－１淫羊藿苷对成骨
细胞的增殖有显著的促进作用。因此本实验选择
２０μｇ·ｍＬ
－１作为实验浓度。结果表明：２０μｇ·ｍＬ
－１
淫羊藿苷能够增加ＭＴＴ的吸光度值，刺激人成骨细
胞增殖，并且能显著提高人成骨细胞的碱性磷酸酶
比活性。碱性磷酸酶是参与骨代谢的重要蛋白质，
被认为是细胞外基质成熟的早期标志［９］，碱性磷酸
酶的活性可以代表成骨细胞的早期分化水平。因
此，可以认为２０μｇ·ｍＬ
－１淫羊藿苷能够促进人成骨
细胞分化成熟。
但是淫羊藿通过什么途径促进人成骨细胞的增
殖和分化？为了解答这一问题，作者检测了 ＢＭＰ２
ｍＲＮＡ的表达，结果表明，淫羊藿苷能使 ＢＭＰ２ｍＲ
ＮＡ的表达显著升高。ＢＭＰ２被认为是 ＴＧＦβ家族
活性最高且唯一能单独诱导成骨的因子［１０］，ＢＭＰ２
的高表达可以促进成骨细胞的分化。作者的结果表
明淫羊藿苷可能通过上调 ＢＭＰ２的表达来促进人
成骨细胞增殖和分化。目前尚未见淫羊藿对成骨细
胞调控机制的报道，作者的实验结果为此提供了借
鉴。细胞调控是一个非常复杂的过程，除了 ＢＭＰ２，
其他细胞因子可能也发挥着重要作用，这些将在以
后的工作中继续探讨。
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Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｐｉｍｅｄｉｕｍｐｕｂｅｓｃｅｎｓｉｃａｒｉｎｅｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ
ＹＩＮＸｉａｏｘｕｅ，ＣＨＥＮＺｈｏｎｇｑｉａｎｇ，ＤＡＮＧＧｅｎｇｔｉｎｇ，ＭＡＱｉｎｇｊｕｎ，ＬＩＵＺｈｏｎｇｊｕｎ
（ＴｈｉｒｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｅｐｉｍｅｄｉｕｍｐｕｂｅｓｃｅｎｓｉｃａｒｉｎｅｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｏｓ
ｔｅｏｂｌａｓｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｉｎｄｕｃｔｉｎｇｈｕｍａｎｍａｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｓ（ｈＭＳＣｓ）ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｙ．ＭＴＴｗａｓ
ｕｓｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡＬＰｗａｓａｓｓａｙｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｉｒｄｐａｓｓａｇｅｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎ
ｖｉｔｒｏ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＰ２ｍＲＮＡｗａｓｃｈｅｃｋｅｄｂｙＲＴＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍｐｕｂｅｓｃｅｎｓｉｃａｒｉｎｅａｔｔｈｅｄｏｓｅｏｆ２０μｇ·ｍＬ
－１ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｇｒｅａｔｌｙｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＰ２ｍＲＮＡ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍ
ｐｕｂｅｓｃｅｎｓｉｃａｒｉｎｅｅｎｈａｎｃｅｓｉｓｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，ｗｈｉｃｈｍａｙｂｅｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＰ２ｍＲＮＡ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｅｐｉｍｅｄｉｕｍｐｕｂｅｓｃｅｎｓｉｃａｒｉｎｅ；ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ［责任编辑 方文贤］
·１９２·
第３０卷第４期
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