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黄连种质资源遗传多样性的 ＩＳＳＲ研究
陈大霞，李隆云，彭 锐，瞿显友
（重庆市中药研究院，重庆 ４０００６５）
［摘要］ 目的：进行黄连Ｃｏｐｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ种质资源的遗传多样性研究。方法：对３２份黄连种质进行 ＩＳＳＲ分
析。利用ＴＲＥＥＣＯＮＷ软件分析遗传相似系数，ＵＰＧＭＡ方法聚类，构建亲缘关系系统图。结果：１６条引物共得到
１０６条扩增条带，其中有５１条呈现多态性，占４８１％。遗传相似系数变化范围０８２５８～０９３５１。聚类结果显示黄
连种质亲缘关系与地理分布无明显相关性，但可以看出来源于同一地区的部分黄连种质聚在一起，呈现出一定的
地域性分布规律。结论：栽培黄连的遗传多样性水平较低，种质间的亲缘关系较近。
［关键词］ 黄连；ＩＳＳＲ；种质资源；遗传多样性
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００６）２３１９３７０４
［收稿日期］ ２００５０９０８
［基金项目］ 国家科技攻关计划（２００４ＢＡ７２１Ａ３２）；重庆市科
技计划项目（８８４７）
［通讯作者］ 陈大霞，Ｔｅｌ：（０２３）８９０２９１９０，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｄａｘ
ｉａ６８９１＠ｈｏｔｍａｉｌｃｏｍ
黄连ＣｏｐｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＦｒａｎｃｈ（习称味连）为毛茛
科多年生植物，为川产道地药材。具有泻火、解毒、
清热、燥湿和良好的抗菌作用，因而倍受国内外药学
工作者的关注，目前应用分子标记对黄连种质资源
进行研究尚未见报道。本研究运用 ＩＳＳＲ分析技术
从ＤＮＡ分子水平上分析了不同产地黄连的遗传多
样性，为合理地保护、利用与开发黄连遗传资源提供
科学依据。
１ 材料和方法
１１ 材料 黄连 Ｃｃｈｉｎｅｎｓｉｓ采自四川、重庆、陕
西、湖北等主产地，共３２份材料（表１），由本院生药
栽培室李隆云研究员鉴定。每个产地均随机选取５
株以上生长了５年的成熟植株，在植株上选择当年
萌发的幼嫩叶片，低温下带回实验室洗净、晾干，冻
于－８０℃超低温冰箱中备用。
１２ 主要试剂 Ｔａｑ酶（Ｐｒｏｍｅｇａ），ｄＮＴｐｓ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ），λＥｃｏＴ１４ＩｄｉｇｅｓｔＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（ＴａｋａＲａ），
ＣＴＡＢ（Ａｍｒｅｓｃｏ），ＰＶＰ（Ｓｉｇｍａ），β疏基乙醇（Ｓｉｇ
ｍａ），琼脂糖（进口分装），其余均为国产分析纯试剂。
１３ 黄连基因组ＤＮＡ提取 每个产地黄连材料等
量混合，采用 ＣＴＡＢ法提取基因组 ＤＮＡ。用 Ｓｍａｒｔ
ＳｐｅｃＴＭ３０００型分光光度计（ＢｉｏＲａｄ公司）测定其浓
度和纯度，将样品稀释为４０ｎｇ·μＬ－１，用于ＩＳＳＲ分
析。
１４ ＩＳＳＲＰＣＲ扩增与检测 ＩＳＳＲ引物根据加拿
大哥伦比亚大学（ＵＢＣ）公布的序列设计，由北京赛
百盛基因技术有限公司合成。从３６个引物中筛选
出１６个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用
于ＩＳＳＲ分析。变性温度根据引物的Ｔｍ值变化１～
３℃。具体引物、序列及退火温度见表２。
ＰＣＲ扩增在 ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒＤｉｃｅ
ＭｏｄｅｌＮｏＴＰ６００扩增仪（宝生物工程有限公司）上
进行。ＩＳＳＲ反应体系：总体积２５μＬ，内含１×ＰＣＲ
ｂｕｆｅｒ，１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｇ２＋，２００μｍｏｌ·Ｌ－１ｄＮＴＰ，
０４μｍｏｌ·Ｌ－１引物，４０ｎｇ模板，１ＵＴａｑＤＮＡ聚合
酶。扩增程序为９４℃预变性５ｍｉｎ，然后进行３５个
循环：９４℃变性３０ｓ，４８～５７℃复性１ｍｉｎ，７２℃延
伸１５ｍｉｎ，循环结束后７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。
扩增产物在１５％的琼脂糖凝胶上电泳分离，
电压不超过５Ｖ·ｃｍ－１。当溴酚蓝指示剂距离琼脂
糖凝胶前沿约 ２～３ｃｍ时停止电泳，用 ０５μｇ·
ｍＬ－１的ＥＢ染色１５～３０ｍｉｎ后，在 ＧｅｌＤｏｃ２０００凝
胶成像系统（ＢＩＯＲＡＤ公司）上检测、照相、记录。
１５ 数据的采集、统计 根据各分子标记的迁移率
及其有无统计所有的二元数据，按条带有或无赋值，
有带（显性）记为１，无带（隐性）记为０，强带和弱带
的赋值均为１，以此作为数据记录的标准。对于多
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表１ 研究所用材料
Ｎｏ 来源 Ｎｏ 来源 Ｎｏ 来源
１ 重庆石柱楠木磨子坪 １２ 湖北竹溪县丰溪镇长松村 ２３ 重庆武隆
２ 重庆石柱悦崃 １３ 陕西镇坪百家乡友谊村 ２４ 重庆江津四面山水口寺
３ 重庆石柱三益 １４ 陕西平利八仙镇中朝二组 ２５ 湖北利川谋道
４ 重庆石柱龙潭 １５ 四川成都峨嵋黄连乡 ２６ 湖北利川建南
５ 重庆石柱黄水黄连公司 １６ 四川成都龙池 ２７ 湖北恩施太庙
６ 重庆石柱南宾粟新公司 １７ 四川成都斜源镇 ２８ 湖北利川忠路
７ 重庆石柱枫木乡昌平村苦草湾 １８ 四川成都白鹿乡 ２９ 湖南桑植县八太公的药材场
８ 重庆石柱冷水河源 １９ 四川成都白水河龙门山镇 ３０ 重庆黔江马嗽乡高炉村
９ 湖北利川福宝山 ２０ 重庆城口龙田 ３１ 湖北巴东县
１０ 重庆巫溪双阳乡西安村 ２１ 重庆城口明中乡双利村 ３２ 湖南龙山县太安乡
１１ 重庆巫溪中鹿乡中鹿村 ２２ 重庆南川金佛山扇子坪
表２ ＩＳＳＲ引物、序列、退火温度及扩增结果
引物名 序列 退火温度／℃ 总带数 多态性带数 引物名 序列 退火温度／℃ 总带数 多态性带数
ＵＢＣ８０７ （ＡＧ）８Ｔ ５３．５ ７ ４ ＵＢＣ８４０ （ＧＡ）８ＹＴ ５２ ６ ３
ＵＢＣ８１０ （ＧＡ）８Ｔ ４８ ５ ２ ＵＢＣ８４２ （ＧＡ）８ＹＧ ５７ ７ ４
ＵＢＣ８１１ （ＧＡ）８Ｃ ５３．５ ５ ２ ＵＢＣ８４７ （ＣＡ）８ＲＣ ５５ ６ ３
ＵＢＣ８１５ （ＣＡ）８Ｇ ４８ ９ ７ ＵＢＣ８４８ （ＣＡ）８ＲＧ ５７ ６ ２
ＵＢＣ８１８ （ＣＡ）８Ｇ ５７ ７ ３ ＵＢＣ８５５ （ＣＡ）８ＹＴ ５７ ７ ２
ＵＢＣ８２２ （ＴＣ）８Ａ ４８ ６ ２ ＵＢＣ８５７ （ＡＣ）８ＹＧ ５３．５ １０ ４
ＵＢＣ８２３ （ＴＣ）８Ｃ ５３．５ ５ ３ ＵＢＣ８６６ （ＣＴＣ）６ ５７ ７ ４
ＵＢＣ８２４ （ＴＣ）８Ｇ ５３．５ ４ ３ Ｔｏｔａｌ １０６ ５１
ＵＢＣ８２５ （ＡＣ）８Ｔ ５３．５ ９ ３
态性位点，仅在重复实验中能稳定出现的差异带用
于数据分析。
１６ 聚类分析 任意２个个体（或群体，或物种）
间的遗传相似度（ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）据以下计算公式
计算：Ｓ＝２Ｎｘｙ／Ｎｘ＋Ｎｙ，公式中Ｓ为遗传相似度，Ｎｘ，
Ｎｙ分别为ｘ，ｙ个体（或群体，或物种）各自拥有的全
部谱带数目，Ｎｘｙ为两者共同为１的带的数目。Ｓ值
在这里直接表示ＩＳＳＲ谱带所显示的２个个体（或群
体，或物种）之间基因组相似的程度，Ｓ值愈小，变异
程度就愈大。因此，２个个体（或群体，或物种）之间
的遗传变异（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ，简称 Ｖ）即遗传多样性（ｇｅ
ｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，简称 Ｄ）可通过２个个体（或群体，或
物种）之间基因组不同的程度体现。分析软件采用
ＴＲＥＥＣＯＮＷ［１］，版本为 １３。采用 ＵＰＧＭＡ聚类法
建立系统聚类分支树状图。
２ 结果与分析
２１ ＩＳＳＲ多态性水平 本研究从３６个 ＩＳＳＲ引物
中，筛选出谱带清晰并呈现多态性的引物１６个，对
供试的３２份材料进行 ＩＳＳＲＰＣＲ扩增，扩增结果见
表２。
１６个引物共扩增出 １０６条可区分的 ＤＮＡ条
带，每个引物检测到的位点在４～１０个，平均每个引
物可扩增出７条带。在这１０６条ＤＮＡ扩增条带中，
有５１条带呈多态性，占所观察到的总扩增带的
４８１％，每个引物可扩增出２～７条多态性带，平均
每个引物产生３条多态性带。以上数据表明，黄连
种质资源的多态性并不丰富。
２２ 遗传相似系数 用 ＴＲＥＥＣＯＮＷ软件计算供
试材料间的遗传相似系数。结果表明：石柱三益与
南宾粟新公司、重庆石柱冷水河源与湖北利川福宝
山之间的遗传相似系数最高，为０９３５１；重庆江津
四面山水口寺与湖北利川谋道之间遗传相似系数最
低，为０８２５８。各供试材料间的遗传相似系数平均
０８８２５，均在８０％以上，显示各黄连种质之间亲缘
关系较近。
２３ 聚类分析 据 ＩＳＳＲ数据计算的遗传相似系
数，按ＵＰＧＭＡ法进行聚类分析，建立聚类分支树状
图（图１）。３２个不同产地的黄连聚为７大类：第一
类最为混杂，包括来源于重庆、四川、湖北、湖南、陕
西的１３份种质；第二、四、六类主要为重庆产黄连，
但均不同程度的混杂有湖北、湖南、陕西的黄连种
质，如第二类中有来源湖北竹溪县（１２）的黄连种
质，第四类中有来源于陕西平利（１４）、湖南龙山县
（３２）、湖北利川福宝山（９）的黄连种质，第六类中有
来源于湖北利川谋道（２５）的黄连种质；来源于四川
成都的５份种质有３份聚为第三类，其余２份混杂
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在第一类中；重庆石柱悦崃（２）的黄连独为第五类；
重庆南川金佛山扇子坪的黄连（２２）单独聚为第七
类，区别于所有其他样品。从以上聚类结果可以看
出，各黄连种质并不是按地理界限严格的聚在一起，
如来自于陕西镇坪（１３）和陕西平利（１４）的２份种
质并未聚在一起，来自于湖南桑植县（２９）和湖南龙
山县（３２）的２份种质也未聚在一起。但还是可以
看出，来源于同一地区的部分黄连种质聚在同一类，
呈现出一定的地域性分布规律。如来自于湖北利川
建南（２６）、利川忠路（２８）、恩施太庙（２７）、巴东县
（３１）的４份黄连种质聚在同一类；来自于四川成都
峨嵋黄连乡（１５）、成都斜源镇（１７）、成都白鹿乡
（１８）的３份黄连单独聚为一类；来自于重庆石柱三
益（３）、冷水河源（８）、楠木磨子坪（１）、南宾粟新公
司（６）以及黄水黄连公司（５）的共５份种质聚在同
一类，重庆金佛山扇子坪（２２）黄连种质单独成一
类，其余重庆产黄连分散在各类。从上述ＩＳＳＲ分析
可以看出黄连种的分类上有一定的地域界限，但并
不明显。
图１ ３２份黄连种质的聚类图
３ 讨论
从本研究的结果来看，来自我国不同产地的３２
份黄连种质的遗传多样性仅４８１％，各种质间遗传
相似系数均在８０％以上，表明供试材料之间的亲缘
关系较近。推测可能与黄连在各地大面积栽培时的
引种现状有一定关系。黄连虽然种植历史悠久，但
大面积栽培只是近 ３０年的事情，各地在引种黄连
时，并不是采集当地的野生黄连种子进行人工驯化，
大多数是从主产地购买种子进行栽培。据文献报
道，从２０世纪６０～７０年代，各地纷纷引种味连，四
川盆地周边近４０个县以及湖北、陕西、贵州、福建、
云南等近１０个省从石柱引种黄连［２，３］。从本研究
结果中也可以看出这一点，如第二、四、六类主要为
重庆产黄连，但均不同程度的混杂有其他产地的黄
连种质，第二类中，来源于湖北竹溪县的黄连种质可
能直接来自重庆，第六类中，湖北利川谋道的黄连种
质亦如此，最有明显的是第四类中大多数为重庆石
柱产黄连，其中混杂的陕西平利、湖南龙山县、湖北
利川福宝山的黄连种质有可能也是直接来自重庆石
柱。此外，各地之间也存在相互引种的现象，如第一
类混杂有重庆、四川、湖北、湖南、陕西的黄连，无明
显地理界限。综上所述，黄连种子来源的这种复杂
性导致亲缘关系实际上已经与地理隔离无明显相关
性，较多的异地引种降低了黄连居群间的遗传多样
性水平。针对以上栽培黄连遗传多样性的特点，在
对黄连种质的多样性保护上，需注意地方品种、特色
品种的保存和野生种的保护以提高自然居群的遗传
多样性水平，同时要辅以各种人工的办法以促进各
个栽培群体之间的基因交流，最大限度地保护黄连
的遗传多样性，为进一步选育黄连优良品种提供遗
传基础。
在聚类结果中，重庆南川金佛山扇子坪的黄连
为单独的一支，此处黄连引自重庆石柱黄水，周边并
无其他黄连种植，但却并未与石柱黄水的黄连聚为
一类，推测可能是由于黄连在引种后的长期栽培中，
受南川金佛山独特的自然地理环境影响而产生了一
些变异的基因型个体，导致重庆南川金佛山的黄连
区别于所有其他样品，具体的原因尚需进一步探索。
［致谢］ 分子生物学实验在西南农业大学蚕桑学重点
实验室完成。
［参考文献］
［１］ ＮｅｉＭ，ＬｉＷＨ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｍｏｄｅｌｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎ
ｉｎｔｅｒｍｓｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄｏｆＳｃｉ
ＵＳＡ，１９７９，７６：５２６９．
［２］ 范俊安，易尚平，张爱军，等．川产道地药材受 ＧＢＳ制约效应
［Ｊ］．中国中药杂志，１９９６，２１（１）：１２．
［３］ 范俊安，李 军，易尚平．四川省黄连生产现状调查［Ｊ］．中国
中药杂志，１９９３，１８（９）：５３０．
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ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｐｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｇｅｒｍｐｌａｓｍｂａｓｅｄｏｎＩＳＳＲａｎａｌｙｓｉｓ
ＣＨＥＮＤａｘｉａ，ＬＩＬｏｎｇｙｕｎ，ＰＥＮＧｒｕｉ，ＱＵＸｉａｎｙｏｕ
（ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００６５，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｔｅｍｉｎｅｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｐｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭｅｔｈｏｄ：３２ｇｅｒｍｐｌａｓｍｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆＣｃｈｉｎｅｎ
ｓｉｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＩＳＳＲｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓＴｏｍａｋｅｕｐｔｈｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｙＴＲＥＥＣＯＮＷｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄ
ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｂｙＵＰＧＭＡｍｅｔｈｏｄＲｅｓｕｌｔ：Ａｔｏｔａｌｏｆ１０６ＩＳＳＲｂａｎｄｓｗｅｒｅｓｃｏｒｅｄ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈ５１ｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓＴｈｅａｖｅｒａｇｅ
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｗａｓ４８１％Ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｗｅｒｅｃｈａｎｇｅｄｆｒｏｍ０８２５８ｔｏ０９３５１Ｂｙｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙ
ｓｉｓ，ｔｈｅｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｓｎｏｔｖｅｒｙｏｂｖｉｏｕｓ，ｂｕｔｉｔｗａｓａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｓｏｍｅｏｆｔｈｅＣｃｈｉｎｅｎｓｉｓｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｅｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅｉｎｔｈｅ
ｓａｍｅｇｒｏｕｐｗｈｉｃｈｐｒｅｓｅｎｔｅｄｔｈｅｌａｗｏｆｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｅｓｔｅｄｍａｔｅｒｉａｌｓＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｄｉｆｅｒｅｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
ＣｃｈｉｎｅｎｓｉｓｉｓｌｏｗａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆＣｃｈｉｎｅｎｓｉｓｉｓｃｌｏｓｅ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｃｏｐｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ；ＩＳＳＲ；ｇｅｒｍｐｌａｓｍｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｓ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉ
［责任编辑 张宁宁］
［收稿日期］ ２００６０１１９
［通讯作者］ 黄璐琦，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１，Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｌｕｑｉ
＠２６３．ｎｅｔ
利用多重等位基因特异 ＰＣＲ鉴别人参、西洋参
崔光红，唐晓晶，黄璐琦
（中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００）
［摘要］ 目的：查找并发现参类药材的ＳＮＰ位点，利用多重等位基因特异ＰＣＲ同时鉴别人参、西洋参。方法：
查找ＧｅｎＢａｎｋ上已收载的参类药材序列，进行比对分析，根据人参、西洋参的ＳＮＰ位点设计引物，对ＰＣＲ反应体系
进行优选。在此基础上，对２０个不同来源的人参、西洋参样品进行ＰＣＲ扩增，根据各自的特异条带进行鉴别。结
果：当退火温度为６６℃时，出现２４９ｂｐ条带的为人参，１０４９ｂｐ条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性
好，能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论：多重等位基因特异ＰＣＲ能成功地对人参、西洋参进行鉴别，在中
药材分子鉴定中具有推广应用价值。
［关键词］ 人参；西洋参；多重等位基因特异ＰＣＲ
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００６）２３１９４００４
随着参类药材ｒＤＮＡ、叶绿体基因的大量测序，使
其物种间单核苷酸的变异，即单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）的发现成为可能，ＺｈｕＳ
等［１］已成功地应用ＭＡＲＭＳ鉴别人参Ｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇ、
西洋参Ｐｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ等几种同属参类药材，但对于
每种药材的鉴别均需要２对引物同时进行ＰＣＲ反应
后才能判断。本研究拟探索更为简便的方法，应用多
重等位基因特异ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｌｅｌｉｃｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＡＳＰＣＲ）［２］，在同一ＰＣＲ反应
中同时检测人参、西洋参各自的ＳＮＰ位点，以达到准
确鉴别人参、西洋参的目的。在此基础上，对反应体
系中的主要影响因素如Ｔａｑ酶用量、Ｍｇ２＋浓度、模板
浓度等进行考察，为等位基因特异 ＰＣＲ在中药材鉴
别中的应用提供依据。
１ 材料和方法
１１ 材料
人参、西洋参药材各１０批样品，分别为新鲜材
料、市售干燥药材、饮片和粉末制剂（见表１），样品
经黄璐琦研究员鉴定为人参 Ｐｇｉｎｓｅｎｇ和西洋参
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