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Ribosomal DNA ITS Sequences Analysis of the Chinese Crude Drug Fructus Schisandrae Sphenantherae and Fruts of Schisandra viridis

中药南五味子及其混淆品绿叶五味子果实的ITS序列分析



全 文 :#研究论文#
中药南五味子及其混淆品绿叶五味子
果实的 Œ×≥序列分析
高建平 o王彦涵 o乔春峰 o陈道峰
k复旦大学 药学院 生药学教研室 o上海 usssvu l
≈摘要  目的 }比较研究不同产地南五味子的基源植物华中五味子及混淆品绿叶五味子的 µ⁄‘„ Œ×≥碱基序
列的差异及其规律 o寻找南五味子和绿叶五味子果实之间的分子鉴别方法 ∀方法 } °≤ • 直接测序 o°„ ˜° w qs ¥ts
软件进行对位排列分析 o采用邻接法 k ±¨ ¬ª«¥²µ2­²¬±¬±ª ° ·¨«²§l 构建邻接k ‘l系统树 ∀结果 }华中五味子 Œ×≥长
度范围为 y|t ∗ y|u ¥³oŒ×≥t和 Œ×≥u分别为 u{u ¥³和 uwy ∗ uwz ¥³~绿叶五味子 Œ×≥长度范围为 y|w ∗ y|x ¥³oŒ×≥t
和 Œ×≥u分别为 u{x ∗ u{y ¥³和 uwy ∗ uwz ¥³∀不同产地华中五味子与绿叶五味子在 Œ×≥t有 v个稳定的信息位点 ∀
‘树中 o产于鸡公山 v个居群的绿叶五味子和天目山的 t个居群及引用的 u条绿叶五味子 Œ×≥序列聚为一支 o
¥²²·¶·µ¤³支持率为 y{ h ∀结论 }µ⁄‘„ Œ×≥序列可作为中药南五味子与混淆品绿叶五味子的一种良好的分子标
记 ∀
≈关键词  华中五味子 ~绿叶五味子 ~µ⁄‘„内转录间隔区
≈中图分类号  • u{u qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvls{2szsy2sx
中药南五味子为华中五味子 Σχηισανδρα
σπηεναντηερα • «¨§q¨·• ¬¯¶的干燥果实 o具有收敛固
涩 o益气生津 o补肾宁心之功效 ∀南五味子在5中国
药典6usss年版一部中开始收载≈t  ∀其主要活性成
分包括木脂素类成分五味子甲素 !五味子酯甲 !酯
乙 !酯丙等≈u  ∀华中五味子为五味子科 ≥¦«¬¶¤±2
§µ¤¦¨¤¨ 五味子属 Σχηισανδρα植物 o在我国为一广布
种 ∀不同产地的华中五味子果实所含木脂素成分有
种内变异 o并与其地理分布有一定的相关性≈u ov  ∀
但华中五味子种内遗传变异规律有待研究 ∀
绿叶五味子 Σ . ϖιριδισ „ q≤ q≥°¬·«的化学成分
与南五味子有所不同 ~药理研究表明绿叶五味子没
有南五味子所具有的镇静作用 ≈u  ∀但这两种植物
在地理分布上有重叠 o且二者果实外形相似 o因此绿
叶五味子果实在一些地区常混作南五味子收购 o从
≈收稿日期  ussu2tu2st
≈基金项目  高校博士点基金项目kussssuyxt|l ~高校优秀青
年教师教学和科研奖励基金项目 ~ 国家自然科学基金项目
kvsuztx{yl
≈通讯作者  陈道峰 ר¯ } ksutl xwuvzwxv ƒ¤¬} ksutl
ywswuuy{ ∞2°¤¬¯}§©¦«¨ ± ƒ ¶«°∏q¨§∏q¦±
而使市场上南五味子药材真伪难辨 ∀
⁄‘„分子遗传标记技术用于中药材鉴定和品质评
价等方面的研究已有很多报道≈w ox  o而植物核糖体
⁄‘„中的内转录间隔区kŒ×≥l序列的进化速率较
快 o可以提供较丰富的变异位点和信息位点≈y  o近
年来不仅广泛用于近缘属间 !属内的分子系统学研
究≈z2|  o而且也被用于种内居群间的差异性研
究≈ts ott  ∀为此 o本文测定了共 ts个产地 !tu 个居
群华中五味子和绿叶五味子的 µ⁄‘„ Œ×≥序列 o通
过比较不同居群华中五味子和绿叶五味子 µ⁄‘„
Œ×≥区 ⁄‘„序列的差异并探讨这种差异的规律性 o
以期寻找中药南五味子和混淆品绿叶五味子之间的
分子鉴别方法 ∀
1 材料与方法
1 q1 材料
供提取 ⁄‘„及 Œ×≥测序的华中五味子和绿叶
五味子叶片采自湖南 !四川 !陕西 !河南 !山西 !浙江
的 tu个自然居群 o采用硅胶快速干燥 ow ε 保存 ∀
用于测序的华中五味子和绿叶五味子果实于 usst
年 {月 o分别采自陕西留坝和河南鸡公山 o取干燥成
熟果实风干 o室温保存 ∀材料来源见表 t ∀原植物
#ysz#
第 u{卷第 {期
ussv年 {月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ {
„∏ª∏¶·oussv
经作者鉴定学名 ∀所有凭证标本存于复旦大学药学 院生药学教研室 ∀
表 t 华中五味子 !绿叶五味子 Œ×≥序列分析材料
编号 学名tl 凭证标本 采集地 器官
≥∂ …t Σχηισανδρα ϖιριδισ Š stszt{uu 鸡公山 o河南 果实
≥∂ …x Σ . ϖιριδισ Š stszt{t{ 鸡公山 o河南 叶
≥∂ …y Σ . ϖιριδισ Š stszt{ut 鸡公山 o河南 叶
≥∂ y Σ . ϖιριδισ • suswuvsst 天目山 o浙江 叶
≥°v Σ . σπηεναντηερα ° sts|syst 栾川 o河南 叶
≥°x Σ . σπηεναντηερα Š sts{uwu{ 阳城 o山西 叶
≥°{ Σ . σπηεναντηερα Š sts{stst 平利 o陕西 叶
≥°| Σ . σπηεναντηερα Š stszu{uv 留坝 o陕西 叶
≥°tt Σ . σπηεναντηερα Š sts{sxtt 太白山 o陕西 叶
≥°tx Σ . σπηεναντηερα • sts{sz 都江堰 o四川 叶
≥°tz Σ . σπηεναντηερα • susxtu 金佛山 o四川 叶
≥°vx Σ . σπηεναντηερα Š sts{stu 留坝 o陕西 果实
注 }tl作者鉴定
1 q2 方法
1 q2 q1 总 ⁄‘„提取
取硅胶干燥叶片适量 o在液氮中研成粉末 ~干燥
果实经 zs h乙醇消毒和蒸馏水洗净后切碎 o取适量
在乳钵中用液氮冷却粉碎成粉末 ∀然后将粉末置
t qx °离心管中 o加入适量 ⁄‘„ 提取缓冲液≈xs
°°²¯ # p t ×µ¬¶2 ‹≤¯k ³‹ { qs l os qz °°²¯ # pt
‘¤≤¯ots °°²¯#pt ∞⁄× „ ot h十六烷基三甲基溴
化铵k≤ × „…oΩ/ ς l os qtw h u2巯基乙醇k ς/ ςl  o
混匀 oys ε 保温 vs ∗ ys °¬±∀氯仿2异戊醇kuwΒtl
抽提 u 次 otss h 乙醇沉淀 ⁄‘„ ozs h 乙醇洗涤 u
次 o沉淀风干 oxs ˏ重蒸水溶解 ow ε 贮存备用 ∀
1 q2 q2 引物设计
Œ×≥扩增引物引用刘忠/五味子科的系统发育 }
核糖体 ⁄‘„ Œ×≥区序列证据0文中的引物≈|  ∀两个
引物分别为 }
°t }x. 2„Š„„Š× ≤ Š× „„≤ „„ŠŠ× × × ≤≤ Š× „ŠŠ2v. ~
°w }x. 2× ≤≤ × ≤ ≤ × ≤≤ Š≤ × × „× × Š„× „× Š≤2v. ∀
1 q2 q3 Œ×≥扩增 !纯化 !测序及分析
Œ×≥扩增采用 °t和 °w双引物做相向扩增 ∀扩
增程序 o|w ε 预变性 w °¬±然后进入如下循环 }|w
ε 变性 t °¬± xw ε 退火 wx ¶ ozu ε 延伸 t °¬± o
vs个循环后 ozu ε 延伸 v °¬±∀反应体积均为 xs
ˏo其中含 xs °°²¯ #pt ×µ¬¶2‹≤¯o u °°²¯ #pt
 ª≤ u¯ o t qx ˜ פ´ ⁄‘„ 聚合酶k上海 ≥¤±ª²±l o
§„×° o§Š×° o§≤ ×° o§× ×°各 uss Λ°²¯ #pt ots
∗ us ±ª总 ⁄‘„ o相应的正反引物各 s qux °°²¯ #
pt ∀ °≤ • 产物采用 ⁄‘„ 快速纯化试剂盒 k上海
华舜生物技术有限公司l进行纯化 ∀测序用 „±¤¯¼¦2
µ¨vzss ⁄‘„测序仪k美国 „…Œ公司 l进行 ∀
Œ×≥序列k编号为 ≥∂ {s和 ≥∂ {t的绿叶五味子
Œ×≥ 序列引自 ª¨ ±¨ ¥¤±®o注册号 } „ƒuyvwv{ o
„ƒtyvzsvl排列后经 °„ ˜°w qs¥ts分析 o以中泰南
五味子 Καδσυρα ανανοµ α和黑老虎 Κ . χοχχινεα为
外类群 o用分支分界法k ¥µ¤±¦«¤±§¥²∏±§l获取邻
接k‘l树 ∀
2 结果
华中五味子整个 Œ×≥ 的长度范围为 y|t ∗ y|u
¥³ o其中 Œ×≥t oŒ×≥u 和 x q{≥ µ⁄‘„ 长度分别为
u{u ouwy ∗ uwz和 tyv ¥³∀绿叶五味子 Œ×≥长度范
围为 y|w ∗ y|x ¥³o其中 Œ×≥t oŒ×≥u及 x q{ ≥ µ⁄‘„
的长度范围分别为 u{x ∗ u{y ouwy ∗ uwz和 tyv ¥³∀
华中五味子和绿叶五味子的 Œ×≥ 序列之间共
有 tx 个变异位点 ∀其中在 Œ×≥t 序列中 o第 uvw o
uxz和 ux{个碱基k自 x. 端起l o为 v个稳定的信息
位点 o用产于鸡公山的绿叶五味子和留坝的华中五
味子干燥果实为实验材料 o进行 Œ×≥ 序列测定 o结
果这 v个信息位点同样存在k 图 tl ∀
不同产地的华中五味子中 o平利k叶片l及留坝
k果实l的Œ×≥序列 o分别有 u个变异位点 o其中产于
平利的华中五味子 ⁄‘„ 序列中 o有一个变异位点
发生在 x q{≥区第 vs个碱基位点 ~产于天目山的绿
叶五味子 Œ×≥序列与其他产地的相比 o在 Œ×≥t第
txt和 uuv个碱基位点为 u个变异位点k图 tl ∀
邻接树图中 o产于鸡公山的 v个居群的绿叶五
味子 ≥∂ …t o≥∂ …y o≥∂ …x o天目山的 ≥∂ y 以及引用
的 u条绿叶五味子 Œ×≥序列k≥∂ {s o≥∂ {tl聚为一
支 o华中五味子的样品都聚为另外一支k图 ul ~在严
格一致性树中 o绿叶五味子也同样聚为一支 o其
¥²²·¶·µ¤³分析支持率为 y{ h ∀
#zsz#
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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图 t 华中五味子 !绿叶五味子 Œ×≥ ¤±§x q{≥ µ⁄‘„ 全序列
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第 u{卷第 {期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ {
„∏ª∏¶·oussv
图 u 基于华中五味子 !绿叶五味子
tw个样本 µ⁄‘„ Œ×≥ 序列构建的 ‘系统树
中泰南五味子 Καδσυρα αναµοσµ α和黑老虎 Κ . χοχχινεα为外类群
3 讨论
中药南五味子以其果实较小 o果皮较薄无光泽 o
种子较小 o表面略呈颗粒状与北五味子相区别≈tt  o
绿叶五味子干燥果实也具有与南五味子相似的性状
特征 ~据5中国植物志6记载 o华中五味子种子近肾
形 o种皮不光滑 o绿叶五味子种子近球形 o种皮不光
滑或有瘤状突起≈tu  o但仅以这些特征难以辨别南五
味子和伪品绿叶五味子干燥果实 ∀本文通过对 ts
个产地 tt个居群的华中五味子和绿叶五味子干燥
叶片 Œ×≥序列的测定 o发现两者在 Œ×≥t第 uvw !uxz
和 ux{个碱基为 v个稳定的信息位点k图 t l o这 v
个位点可以作为这两种植物的鉴别位点 ∀在此基础
之上 o我们以南五味子及绿叶五味子干燥果实为实
验材料进行 Œ×≥测序 o测定结果证实了这一点 ∀因
此 oŒ×≥序列可以作为鉴别南五味子和混淆品绿叶
五味子的有效手段 ∀同时 o这一结果为建立位点特
异性 °≤ • 及 °≤ •2• ƒ°鉴定方法提供了依据 ∀
华中五味子 o绿叶五味子同属于五味子属中在
系统学上有争议的中华五味子亚属 Σινοσχηισανδρα
植物 ∀它们不仅在地理分布上有重叠 o而且植物形
态特征很相似 ∀由此 o林祁≈tu 曾将华中五味子 !绿
叶五味子 !同东亚五味子 Σ . ελονγατα k…ql …¤¬¯¯ q
‹¬¶·q°¯ q!阿里山五味子 Σ . αρισανενσισ ‹¤¼¤·¤!滇
藏五味子 Σ . νεγλεχτα „ q ≤ q≥°¬·«!小花五味子 Σ .
µιχραντηα „ q≤ q≥°¬·«!狭叶五味子 Σ .λανχιφολια k
• «¨§q¨·• ¬¯¶l „ q≤ q≥°¬·«以及 Σ . γραχιλισ „ q≤ q
≥°¬·«合并成一个种即东亚五味子 Σχηισανδρα ελον2
γατα k…ql …¤¬¯¯ q ‹¬¶·q °¯ q∀我们认为这种处理不
甚合理 ∀一方面 o因为华中五味子和绿叶五味子在
形态上有所差异 o华中五味子的花被橙黄色 o绿叶五
味子花被片为黄色 ~与华中五味子相比 o绿叶五味子
成熟果实在果穗轴上排列较为稀疏 ~种子的特征也
有区别 ∀另一方面 o根据本文的研究结果 o二者在
µ⁄‘„ Œ×≥序列中有着稳定的信息位点 o在 ‘树
中 o产于天目山的绿叶五味子与鸡公山 v个不同居
群的绿叶五味子以及引用的另外 u个居群的绿叶五
味子聚为一支 o华中五味子的样品都聚为另外一支
k图 ul ~在严格一致性树中 o绿叶五味子也同样聚为
一支 o其 ¥²²·¶·µ¤³分析支持率为 y{ h ∀所以 o我们
认为绿叶五味子作为一个种存在较为合理 ∀ 5中国
植物志6 !5河南植物志6记载 o河南无绿叶五味子分
布≈tt otv  oŒ×≥序列分析结果表明河南鸡公山样品均
应为绿叶五味子 o由此看出 oŒ×≥序列分析在中药种
质资源鉴定中也有重要的作用 ∀
≈致谢  西北大学植物研究所胡正海教授 !西北大学生
命科学院任毅教授 !汉中师范学院科研处赵铧教授 !湖南师
范大学生命科学院刘克明教授 !安康市中医院魏翠英医师 !
安康市药检所朱朝德 !天水市小陇山植物园 安定国 高级
工程师和裴会明工程师 o在标本及实验材料采集中给予协
助 ~郑州大学药学院潘成学讲师提供 t份实验材料 ∀
≈参考文献 
≈t  中国药典 o一部 qusss qt|z q
≈u  楼之岑 o秦 波 q常用中药品种整理和质量研究 q北京 }北京
医科大学 协和医科大学联合出版社 ousss qu|z q
≈v  黄梅芬 o方圣鼎 o高耀良 q华中五味子的研究 ŒŒŒq新木脂体 δ2
³¨¬ª¤¯¥¤¦¬±的结构及不同产区木酯体成分 q植物学报 ot|{u ouw
kxl }wxt q
≈w  王建云 o熊丽娟 q分子生物学技术鉴定药材 q中国中药杂志 o
t||{ ovvktul }zxz q
≈x  肖小河 o刘峰群 o袁海龙 o等 q中药 ⁄‘„ 分子标识鉴定研究进
展 q中草药 ousss ovtk{l }xyt q
≈y  王建波 o张文驹 o陈家宽 q核µ⁄‘„ 的 Œ×≥序列在被子植物系统
与进化研究中的应用 q植物分类学报 ot||| ovzkwl }wsz q
≈z  ≤ µ¨¥¤«  o≥²∏½¤2≤«¬¨¶× o∏¥∏¨µ ƒ o ·¨¤¯ q ²¯ ¦¨∏¯¤µ°«¼¯ ²ª¨ 2
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中 国 中 药 杂 志
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第一分册 q北京 }科学出版社 ot||y quxu q
≈tu  林 祁 q五味子属植物的分类学订正 q植物分类学报 ousss o
v{ kyl }xvu q
≈tv  河南植物志编辑委会 q河南植物志 q郑州 }河南科学技术出版
社 ot||{ qxt| q
Ριβοσοµ αλ ∆ΝΑ ΙΤΣ Σεθυενχεσ Αναλψσισ οφ τηε Χηινεσε Χρυδε ∆ρυγ
Φρυχτυσ Σχηισανδραε Σπηεναντηεραε ανδ Φρυτσ οφ Σχηισανδρα ϖιριδισ
Š„’ ¬¤±2³¬±ªo • „‘Š ≠¤±2«¤±o ±Œ„’ ≤«∏±2©¨ ±ªo≤ ‹∞‘⁄¤²2©¨ ±ª
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ©¬±§·«¨ ³¤··¨µ±¶²©·«¨ µ⁄‘„ Œ×≥ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ √¤µ¬¤·¬²± ²© Σχηισανδρα σπηεναντηερα ¤±§ Σ . ϖιριδισo
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Καδσυρα αναµοσµ α ¤±§ Κ . χοχχινεα ¤¶²∏·ªµ²∏³¶o©¬√¨§¬©©¨ µ¨±·³²³∏¯¤·¬²±¶²© Σ . ϖιριδισ º µ¨¨ ·«¨ °²±²³«¼¯ ·¨¬¦ªµ²∏³ º¬·«·«¨
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‹ ±¨¤± °µ²√¬±¦¨ ¤±§·«¨ ²·«¨µ·º²³²³∏¯¤·¬²±¶²© Σ . ϖιριδι󦬷¨§·«¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶©µ²° Š ±¨¨ …¤±®kµ¨ª¬¶·µ¤·¬²± ±∏°¥¨µ¶¤µ¨ „ƒuyvwv{
¤±§ „ƒtyvzsv µ¨¶³¨ ¦·¬√¨¯¼l qΧονχλυσιον : × «¨ µ⁄‘„ ¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µ¬¶¤ª²²§ °¤µ®¨ µ·²§¬¶·¬±ª∏¬¶«·«¨ ƒµ∏¦·∏¶≥¦«¬¶¤±2
§µ¤¨ ≥³«¨ ±¤±·«¨µ¤¨ ©µ²° ·«¨ ©µ∏¬·¶²© Σ . ϖιριδισ.
[ Κεψ ωορδσ] Σχηισανδρα σπηεναντηερα ; Σχηισανδρα ϖιριδισ; µ⁄‘„ ¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µ
≈责任编辑 袁桂京 
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