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≈z 张 毅 q小鼠静脉内注射 2{对动员骨髓造血干r祖细胞的作
用研究 q中华血液学杂志 ot||{ ot|ktul }ywu q
≈{ 洪介民 q黄芪多糖对小鼠巨核系祖细胞的影响 q中药新药与临
床药理 ot||{ o|kvl }tyt q
≈| 杨 岚 q白细胞介素 y 与造血调控 q国外医学#血液学分册 o
t||x ot{ktl }ws q
Εφφεχτ οφ Χοµ πονεντσ οφ ∆ανγ2Γυι2Βυ2Ξυε ∆εχοχτιον ον Ηεµ ατοπενια
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ©¨©¨ ¦·¶¤±§·«¨ µ¨ ¤¯·¨§ ° ¦¨«¤±¬¶°¶²©·«¨ ¦²°³²±¨ ±·¶²© ⁄¤±ª2∏¬2
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[ Κεψ ωορδσ] ⁄¤±ª2¬∏2÷∏¨ §¨¦²¦·¬²± ~³«¤µ°¤¦²¯²ª¬¦¤¯ ° ¦¨«¤±¬¶° ~¦²°³²±¨ ±·~«¨ °¤·²³²¬¨·¬¦©∏±¦·¬²±
≈责任编辑 方文贤
利用稻瘟霉分生孢子筛选海兔抗有丝分裂活性组分
林厚文t o汤海峰u o张 纯t o沈 阳t o郭 澄t o易杨华u
kt q第二军医大学 附属长征医院 药学部 o上海 ussssv ~
u q第二军医大学 药学院 海洋药物研究室 o上海 usswvvl
≈摘要 目的 }利用稻瘟霉生物活性成分跟踪筛选模型 o筛选海兔中抗有丝分裂活性成分 ∀方法 }通过观察样
本引起稻瘟霉的分生孢子或菌丝形态生长异常或生长抑制的情况 o跟踪筛选活性组分 o并与体外肿瘤细胞毒试验
对照 ∀结果 }从海兔乙醇粗提物中筛选得到 u个具有细胞毒活性的组分 o其体外对 °v{{和 2ys的 ≤xs分别为
uv qw ot{ qy ot| qw otu qx Λªq°p t ∀结论 }本模型首次用于海洋天然活性化合物的追踪分离 o方便 !快捷 !成本低 o显
示了广阔的应用前景 ∀
≈关键词 稻瘟霉 ~海兔 ~抗有丝分裂 ~活性筛选
≈中图分类号 u{x qx ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukussulst2ssxv2sv
从生长在海洋特殊生态环境中的海洋生物中跟
踪筛选具有独特生理活性的物质 o已成为人们普遍
关注的新课题 ∀而标准化的生物检测方法的建立 o
≈收稿日期 usst2su2sx
≈基金项目 国家自然科学基金资助项目 okvssssut|l
≈作者通讯 电话 }ksutl uxszs|zt2ysty 传真 }ksutl
yxvsztvv
对海洋抗癌药物的筛选起着很重要的作用 ∀
特别是在初筛阶段 o灵敏 !方便 !快捷且相关性
好的活性筛选模型是提高成功率的保证 ∀近年来 o
以微管系统为靶点筛选新的抗肿瘤 !抗真菌药物已
引起学者的广泛注意≈t ∀日本东京大学开发建立了
以观察稻瘟霉的分生孢子或菌丝形态生长异常或生
长抑制为指标的简易微管活性测试体系 o并成功地
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第 uz卷第 t期
ussu年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quz o²qt
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筛选出了多种具有抗有丝分裂 !抗真菌活性的新化
合物≈u ∀其中 µ«¬½²¬¬±和 ©∏¶¤µ¬§¬± 已开发为抗肿
瘤 !抗真菌新药≈v ow ∀目前 o应用此生物检测模型的
主要有东京大学和沈阳药科大学两家 ∀前者主要用
于对微生物次级代谢产物的筛选上 o年筛选菌株 t
sss个以上 ∀后者将其用于传统中药的活性筛选方
面 o已筛选了数百种植物药的粗提物 o并从其中 v种
植物中追踪分离到 uv个抗肿瘤活性化合物≈x oy ∀
我们引进这一有效的生物检测模型 o并将其首
次用于海洋天然产物的活性筛选 o是对这种新的筛
选方法的新尝试 ∀本文介绍海兔中抗肿瘤活性成分
的跟踪筛选 ∀
1 材料与方法
1 q1 材料
1 q1 q1 菌种 稻瘟霉 Πψριχυλαρια ορψζαε °2u¥菌
株 o由沈阳药科大学提供 ∀
1 q1 q2 培养基 土豆培养基k h lk蔗糖 t qx o土豆
us o琼脂 u qsl o液体沙氏培养基 k蛋白胨 t qs o¤≤¯
s qx o ¯ ¦w qsl ∀
1 q1 q3 仪器 倒置显微镜 o生化培养箱 o超净工作
台等 ∀
1 q2 方法
1 q2 q1 提取分离 新鲜海兔 t sss ®ªo乙醇冷浸提
取 o减压回收乙醇 o得浸膏k2sl ~2s用 ≤ u≤ u¯ 反
复萃取 o得萃取物 w sss ªk2ul o水层k2tl另置 ~将
2u悬浮于 |s h ¨ 溶液中 o用石油醚萃取 o得
萃取物 t xss ª k2vl ~甲醇溶液层k2wl加水稀释
成 {s h ¨ 溶液 o用 ≤≤ w¯ 萃取 o得萃取物 tw{ ª
k2xl ~甲醇溶液层k2yl加水稀释成 ys h ¨
溶液 o用 ≤ u≤ u¯萃取 o得萃取物 uxu ªk2zl ~甲醇溶
液层k2{l另置 ∀
1 q2 q2 样品溶液配制 样品 u .s °ª超声溶解于
t qs °ts h ¨ 或 y h ⁄ ≥ 水溶液中 ∀如需
要 o可将样品溶于 tss Λ¯ ¨ 或 ws Λ⁄ ≥ o再
加水稀释至 u qs °ª#°p t ∀
1 q2 q3 霉菌培养 菌种接种在土豆培养基上 ouy ∗
u{ ε 培养 { ∗ tw §ots §左右传代 t次 o镜检使用 ∀
1 q2 q4 活性筛选 每一菌斜面加蒸馏水 { ∗ ts
°o刮下孢子 o振摇片刻 o用四层纱布过滤 o滤液中
加入 u h ∗ v h液体沙氏培养基 o镜检调整至孢子数
为 ws osss#°p t ∀用连续加样枪加入 |y孔板中 o每
孔加孢子液 xs Λo再用微量加样枪在第一行孔中加
入 xs Λ样品溶液 o依次倍半稀释为 t °ª# °p t o
xss Λª# °p t ouxs Λª# °p t otux Λª# °p t oyvΛª#
°p t ovtΛª# °p t otyΛª# °p t o{Λª# °p t浓度 ∀
每板均做阴性对照kts h ¨ 或 y h ⁄ ≥ 水溶
液l !空白对照 k不加入样品和试剂l和阳性对照
k «¬½²¬¬±o沈阳药科大学提供l ∀然后置于 uy ∗ u{
ε 培养箱中培养 t{ «o于倒置显微镜下观察孢子和
菌丝形态 o确定活性结果 ∀
1 q2 q5 活性指标 根据菌丝的卷曲 !膨胀 !分枝过
多或念珠状等形态生长异常现象 o可分为 y 个等
级≈u o分别表示为 }生长正常k p l ~生长抑制k ≅ l ~轻
度变形k n l ~中度变形k n n l ~高度变形k n n n l ~
形态可疑k ? l ∀根据以上指标 o判断活性 o确定最小
活性浓度或称最小变形浓度k°¬±¬°∏° °²µ³«²¯²ª¬2
¦¤¯ §¨©²µ°¤·¬²± ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±o ⁄≤l ∀一般认为 o
⁄≤kxss [ Λª# °p t o对粗提物来说 o可以认为
有活性 o对单体化合物则要更低≈x ∀目前上市的许
多抗肿瘤药物的 ⁄≤ 一般小于 x Λª#°p t≈u ∀
1 q2 q6 体外细胞毒活性 采用 × × 法 o于 |y孔
板中每孔加入 t qu ≅ tsx#°p t浓度的肿瘤细胞 o以
不同浓度的药物作用 zu «后加入 × × 工作液 o用
酶标仪测 xws值 o观察在不同浓度下药物对肿瘤细
胞生长的抑制率 ∀肿瘤细胞株采用 °v{{和 2ys o
阳性对照采用羟基喜树碱k≤°×l ∀用 ²ª¬·法以
药理学统计软件计算 ≤xs ∀
2 结果
2 q1 稻瘟酶模型筛选 对海兔各分离组分k2s ∗
2{l进行稻瘟酶模型活性筛选 o观察其最小变形浓
度 ⁄≤ ∀粗提物 2s活性极弱 o经过不断纯化 o
活性逐步提高 o得到了具有较高活性的 u个组分 2
x和 2z o ⁄≤ 分别为 tux oyv Λª#°p tk表 tl ∀
表 t 海兔提取物各组分稻瘟酶活性筛选结果
样品
浓度rª#°p t
tsss xss uxs tux yv vt ty
2s ? p p p p p p
2t ? p p p p p p
2u n n ≅ p p p p p
2v n n n ≅ p p p p p
2w ≅ n n n n n n n ? p p
2x ≅ ≅ n ? p p
2y ≅ n ≅ p p p
2z ≅ ≅ ≅ n n n n ? p
2{ ? p p p p pp
注 }/ p 0生长正常 / ≅ 0生长抑制 / n 0轻度变形 / n n 0中
度变形 / n n n 0高度变形 / ? 0形态可疑
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第 uz卷第 t期
ussu年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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2 q2 细胞毒模型筛选结果 对海兔各分离组分k2
s ∗ 2{l进行细胞毒模型活性筛选 o观察其半数有
效浓度 ≤xs值 o结果见表 u ∀同样 o活性跟踪也显示
活性部位为 2w o 2x o 2y o 2z ∀
表 u 海兔提取物各组分细胞毒活性筛选结果
≤xsrΛª#°p t 2s 2t 2u 2v 2w 2x 2y 2z 2{
2ys p p p |y xw qy t{ qy wv qx tu qx p
°2v{{ p p p p yy qw uv qw xu q{ t| qw p
注 }/ p 0 q无活性 ≤xs tss Λª#°p t
3 讨论
与文献≈u oz 方法比较 o作者对实验方法稍作
了调整和改进 ∀如根据菌种生长情况在 { ∗ tw §内
可随时镜检使用 o孢子液中加入液体沙氏培养基控
制在 u h ∗ v h o孢子生长时间延长至 t{ «等 o从而
提高了本法的稳定性 ∀
本模型机理尚不完全清楚 ∀经大量实验初步认
为 o具有使稻瘟霉变形活性的化合物一般具有抗有
丝分裂的作用 o可抑制微管的聚合或解聚≈u ov ∀作
者首次将此模型应用于海洋天然活性组分的跟踪筛
选 o并与肿瘤细胞毒筛选的结果进行了比较 o两者结
果比较一致 ∀本方法成本低廉 !用样量少 !相关性
好 ∀海洋生物中活性成分的含量一般很低 o一般在
十万分之一 o甚至百万分之一以下 o对其活性成分的
筛选应尽量深入 o避免造成漏筛 ∀本方法虽然阳性
率稍高 o但阴性率较低 o不易造成漏筛≈z ∀而且 o本
方法方便快捷 o从加样到观察只需 t{ «o是一理想的
粗筛模型 o在海洋抗有丝分裂 !抗真菌药物的跟踪筛
选方面 o无疑有着广阔的应用前景 ∀
≈参考文献
≈t 杨 军 o邵 刚 o姚新生 q微管蛋白活性抑制剂研究进展 q沈阳
药科大学学报 ot||{ otx kvl }uty q
≈u ²¥¤¼¤¶«¬ o ¤°¬®²¶«¬ o ≠²¶«¬°²·² × o ·¨¤¯ q ≥¦µ¨ ±¨¬±ª
·¨«²§©²µ±·¬°¬·²·¬¦¤±§ ±·¬©∏±ª¤¯ ≥∏¥¶·¤±¦¨¶ ¶¬±ª ≤²±§¬¤²©
Πψριχυλαρια ορψζαε o ²§¬©¬¦¤·¬²±¤±§³³¯¬¦¤·¬²±·² ×µ²³¬¦¤¯ ¤µ¬±¨
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¶¤¼ ° ·¨«²§ º¤¶ ©¨©¬¦¬¨±·¯¼ ¤³³¯¬¨§·²·«¨ ³µ¬°¤µ¼ ¶¦µ¨ ±¨¬±ª²©¤±·¬°¬·²·¬¦³²µ·¬²±¶©µ²° °¤µ¬±¨ ¤±¬°¤¯¶©²µ·«¨ ©¬µ¶··¬°¨q
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√ ±¨¬¨±·o¶³¨ §¨¼ ¤±§¦«¨ ¤³o·«¨ ¶¦µ¨ ±¨¬±ª °²§¨¯¬¶¶∏¬·¤¥¯¨©²µ·«¨ ¥¬²¤¶¶¤¼ ²©¤¦·¬√¨¦²±¶·¬·∏¨ ±·¶©µ²° °¤µ¬±¨ ¬¯©¨ q
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中 国 中 药 杂 志
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