全 文 ：ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｐｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｇｅｒｍｐｌａｓｍｂａｓｅｄｏｎＩＳＳＲａｎａｌｙｓｉｓ
ＣＨＥＮＤａｘｉａ，ＬＩＬｏｎｇｙｕｎ，ＰＥＮＧｒｕｉ，ＱＵＸｉａｎｙｏｕ
（ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００６５，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｔｅｍｉｎｅｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｐｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭｅｔｈｏｄ：３２ｇｅｒｍｐｌａｓｍｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆＣｃｈｉｎｅｎ
ｓｉｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＩＳＳＲｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓＴｏｍａｋｅｕｐｔｈｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｙＴＲＥＥＣＯＮＷｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄ
ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｂｙＵＰＧＭＡｍｅｔｈｏｄＲｅｓｕｌｔ：Ａｔｏｔａｌｏｆ１０６ＩＳＳＲｂａｎｄｓｗｅｒｅｓｃｏｒｅｄ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈ５１ｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓＴｈｅａｖｅｒａｇｅ
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｗａｓ４８１％Ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｗｅｒｅｃｈａｎｇｅｄｆｒｏｍ０８２５８ｔｏ０９３５１Ｂｙｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙ
ｓｉｓ，ｔｈｅｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｓｎｏｔｖｅｒｙｏｂｖｉｏｕｓ，ｂｕｔｉｔｗａｓａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｓｏｍｅｏｆｔｈｅＣｃｈｉｎｅｎｓｉｓｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｅｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅｉｎｔｈｅ
ｓａｍｅｇｒｏｕｐｗｈｉｃｈｐｒｅｓｅｎｔｅｄｔｈｅｌａｗｏｆｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｅｓｔｅｄｍａｔｅｒｉａｌｓＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｄｉｆｅｒｅｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
ＣｃｈｉｎｅｎｓｉｓｉｓｌｏｗａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆＣｃｈｉｎｅｎｓｉｓｉｓｃｌｏｓｅ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｃｏｐｔｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ；ＩＳＳＲ；ｇｅｒｍｐｌａｓｍｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｓ；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉ
［责任编辑 张宁宁］
［收稿日期］ ２００６０１１９
［通讯作者］ 黄璐琦，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１，Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｌｕｑｉ
＠２６３．ｎｅｔ
利用多重等位基因特异 ＰＣＲ鉴别人参、西洋参
崔光红，唐晓晶，黄璐琦
（中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００）
［摘要］ 目的：查找并发现参类药材的ＳＮＰ位点，利用多重等位基因特异ＰＣＲ同时鉴别人参、西洋参。方法：
查找ＧｅｎＢａｎｋ上已收载的参类药材序列，进行比对分析，根据人参、西洋参的ＳＮＰ位点设计引物，对ＰＣＲ反应体系
进行优选。在此基础上，对２０个不同来源的人参、西洋参样品进行ＰＣＲ扩增，根据各自的特异条带进行鉴别。结
果：当退火温度为６６℃时，出现２４９ｂｐ条带的为人参，１０４９ｂｐ条带的为西洋参。该鉴别反应特异性高、重复性
好，能在同一反应中准确鉴别人参、西洋参。结论：多重等位基因特异ＰＣＲ能成功地对人参、西洋参进行鉴别，在中
药材分子鉴定中具有推广应用价值。
［关键词］ 人参；西洋参；多重等位基因特异ＰＣＲ
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００６）２３１９４００４
随着参类药材ｒＤＮＡ、叶绿体基因的大量测序，使
其物种间单核苷酸的变异，即单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）的发现成为可能，ＺｈｕＳ
等［１］已成功地应用ＭＡＲＭＳ鉴别人参Ｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇ、
西洋参Ｐｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ等几种同属参类药材，但对于
每种药材的鉴别均需要２对引物同时进行ＰＣＲ反应
后才能判断。本研究拟探索更为简便的方法，应用多
重等位基因特异ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｌｅｌｉｃｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＡＳＰＣＲ）［２］，在同一ＰＣＲ反应
中同时检测人参、西洋参各自的ＳＮＰ位点，以达到准
确鉴别人参、西洋参的目的。在此基础上，对反应体
系中的主要影响因素如Ｔａｑ酶用量、Ｍｇ２＋浓度、模板
浓度等进行考察，为等位基因特异 ＰＣＲ在中药材鉴
别中的应用提供依据。
１ 材料和方法
１１ 材料
人参、西洋参药材各１０批样品，分别为新鲜材
料、市售干燥药材、饮片和粉末制剂（见表１），样品
经黄璐琦研究员鉴定为人参 Ｐｇｉｎｓｅｎｇ和西洋参
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第３１卷第２３期
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中 国 中 药 杂 志
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Ｐｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ的根，现存放于中国中医科学院中 药研究所标本室。
表１ 样品来源
Ｎｏ 样品 状态 来源 Ｎｏ 样品 状态 来源
Ｒｅｎ１ 人参 鲜品 吉林集安 Ｘｉ１ 西洋参 鲜品 北京怀柔
Ｒｅｎ２ 人参（大马牙）１） 鲜品 吉林集安 Ｘｉ２ 西洋参 药材 北京同仁堂，３．８０元／ｇ
Ｒｅｎ３ 人参（二马牙）１） 鲜品 吉林集安 Ｘｉ３ 西洋参 药材 北京同仁堂，１．８０元／ｇ
Ｒｅｎ４ 人参（黄果）１） 鲜品 吉林集安 Ｘｉ４ 西洋参 药材 北京同仁堂，０．９８元／ｇ
Ｒｅｎ５ 人参（长脖）１） 鲜品 吉林集安 Ｘｉ５ 西洋参 药材 北京同仁堂，产地美国
Ｒｅｎ６ 人参 药材 北京同仁堂 Ｘｉ６ 西洋参 药材 北京同仁堂，产地加拿大
Ｒｅｎ７ 人参（参须） 药材 北京永安堂 Ｘｉ７ 西洋参 药材 北京永安堂
Ｒｅｎ８ 人参 药材 河北安国药市 Ｘｉ８ 西洋参 标本 中药所标本室
Ｒｅｎ９ 人参 标本 中药所标本室 Ｘｉ９ 西洋参 饮片 北京华颐中药制药厂
Ｒｅｎ１０ 人参 粉末 自制 Ｘｉ１０ 西洋参 饮片 江西樟树中药饮片厂
注：１）人参农家品种
１２ 基因组ＤＮＡ的提取
参照文献［３］方法。
１３ ＳＮＰ的确定和引物设计
查找 ＧｅｎＢａｎｋ中参类药材的已知序列，利用
ＤＮＡＭＡＮ进行多序列比对。发现人参、西洋参在
ＩＴＳ，１８Ｓ，ｍａｔＫ基因上均存在种间 ＳＮＰ，如 ＩＴＳ２３７
ｂｐ处，人参为Ａ，西洋参等其他参类药材的为Ｇ，４１１
ｂｐ处西洋参为Ｔ，其他为 Ｃ［４］；１８Ｓ基因５０１ｂｐ处，
人参为Ｃ，其他参类药材如西洋参、竹节参、三七、越
南人参等均为Ｇ；ｍａｔＫ基因９１７ｂｐ处，西洋参为Ａ，
而其他参类药材均为Ｔ。本研究选择已有一定研究
基础的１８Ｓ和 ｍａｔＫ基因上的 ＳＮＰ位点设计引物。
人参引物ＰｇＳ４８１Ｆ５′ＡＴＡＡＣＡＡＴＡＣＣＧＧＧＣＴＧ
ＡＴＴＣ３′，ＰｇＳ７１２Ｒ ５′ＧＣ ＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＣＡＧ
ＧＡＧ３′，位于１８Ｓ，其中引物 ＰｇＳ４８１Ｆ３′端的 Ｃ为人
参的ＳＮＰ位点；西洋参引物ＰｇｊｑｔＫ１９６６Ｒ５′ＧＡＴＴＴ
ＣＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＣＣＣＡＡＡＴＴ３′，ＰｑｔＫ８９６Ｆ５′
ＧＧＡＡＡＡＴＧＣＧＧＧＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡ３′位于 ｍａｔＫ基因
上，ＰｑｔＫ８９６Ｆ的３′端为西洋参的 ＳＮＰ位点［１］。引
物由上海Ｓａｎｇｏｎ合成。
１４ ＰＣＲ扩增
ＰＣＲ反应体系为 ２５μＬ，其中 ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ
８３）１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＫＣｌ５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，Ｍｇ２＋１５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ｄＮＴＰ０１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，Ｔａｑ１Ｕ（Ｔａｋａｒａ
ＥｘＴａｑ），引物各０１５μｍｏｌ·Ｌ－１，模板ＤＮＡ５０ｎｇ。
扩增在ＡＢＩ９７００上进行，程序为９４℃预变性５ｍｉｎ
后，开始９４℃３０ｓ，６６℃１ｍｉｎ，共４０个循环，７２℃
后延伸５ｍｉｎ，４℃保温结束反应。取５μＬ反应产
物在含 ＥＢ的１５％的琼脂糖凝胶上电泳，在 ＳＹＮ
ＧＥＮＥ型凝胶成像系统下观察、拍照。
２ 结果
２１ 实验条件的确定
多重 ＰＣＲ成功的关键是引物特异性好，单一
ＰＣＲ就能得到很好的效果，无非特异性条带出现。
实验所用引物能满足上述要求，当多重ＰＣＲ的退火
温度为６６℃时，人参出现２４９ｂｐ条带，西洋参出现
１０４９ｂｐ条带，无非特异性条带产生。在此基础上，
为明确 ＰＣＲ反应体系中各成分对 ＭＡＳＰＣＲ的影
响，对 Ｔａｑ酶用量、镁离子浓度、模板浓度等因素进
行了考察。
２１１ 最适Ｔａｑ酶用量的确定 ２５μＬ体系中Ｔａｑ
酶量分别设为０２５，０５，１，１５，２Ｕ，结果 Ｔａｑ酶量
分别为０２５，０５Ｕ时，人参、西洋参的特异条带不
清晰；Ｔａｑ酶量分别为１，１５Ｕ时，人参、西洋参的
特异条带清晰；但当Ｔａｑ酶量达到２Ｕ时，人参出现
了非特异条带（图１Ａ）。因此，确定２５μＬ体系中
使用１Ｕ的Ｔａｑ酶量最为合适。
２１２ 最适Ｍｇ２＋浓度的确定 Ｍｇ２＋浓度分别设定
为０５，１０，１５，２０，３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，结果 Ｍｇ２＋浓
度过低（０５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）时，人参、西洋参均没有扩
增。Ｍｇ２＋为１０～１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，人参、西洋参
扩增结果好（图１Ｂ）。当
２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，人参
出现了非特异带。因此，Ｍｇ２＋浓度应控制在１０～
１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
２１３ 最适 ｄＮＴＰ浓度的确定 ｄＮＴＰ浓度分别设
定为０１，０２，０３，０４，０５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，结果 ｄＮＴＰ
为０１，０２ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，人参、西洋参出现条带，
而高于 ０３ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，两者均没有条带（图 １
Ｃ），表明 ｄＮＴＰ浓度高后抑制 ＰＣＲ扩增。因此，将
ｄＮＴＰ浓度定为０１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
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图１ 人参、西洋参不同ＰＣＲ反应条件的电泳图
Ａ不同Ｔａｑ酶用量；Ｂ不同Ｍｇ２＋浓度；Ｃ不同ｄＮＴＰ浓度；Ｄ
不同引物浓度；Ｅ不同模板；Ｆ不同循环次数；Ａ～Ｅ中，样品
１～５为人参，６～１０为西洋参；Ｆ中１，２，５～７为人参，３，４，８～１０
为西洋参；Ｍ１２００，９００，７５０，５００，２５０，１００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ａ中
从左至右，２５μＬ反应体系中分别为０２５，０５，１，１５，２ＵＴａｋａｒａ
ＥｘＴａｑ；Ｂ中从左至右，Ｍｇ２＋浓度分别为 ０５，１，１５，２０，３０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１；Ｃ中从左至右，ｄＮＴＰ浓度分别为０１，０２，０３，０４，
０５ｍｍｏｌ·Ｌ－１；Ｄ中从左至右，引物浓度分别为０１，０２，０３，
０４，０５μｍｏｌ·Ｌ－１；Ｅ中从左至右，２５μＬ反应体系中模板量分
别为２０，５０，１００，１５０，２００ｎｇ；Ｆ中１～４为３５个循环，５～１０为
３０个循环
２１４ 最适引物浓度的确定 引物浓度分别设定
为０１，０２，０３，０４，０５μｍｏｌ·Ｌ－１。结果 ０１～
０５μｍｏｌ·Ｌ－１对ＰＣＲ结果没有影响（图１Ｄ）。
２１５ 最适模板量的确定 ２５μＬ体系中模板量分
别为２０，５０，１００，１５０，２００ｎｇ，结果人参２０～２００ｎｇ均
扩增出带，而西洋参当模板量为２００ｎｇ时，条带不清
晰（图１Ｅ）。因此，模板量在２０～２００ｎｇ较合适。
２１６ 最适循环数的确定 将 ＰＣＲ循环数分别设
为３５个和３０个循环，结果３５个循环时条带均较
好。３０个循环时，有一个西洋参样品的条带较不清
晰（图 １Ｆ）。由于鲜品、药材以及饮片中所含的
ＤＮＡ的质量不同，如饮片和粉末制剂中，ＤＮＡ严重
降解，因此，可以根据材料的来源确定循环次数，如
为新鲜样品，３０个循环就能达到检测的效果，而当
为ＤＮＡ严重降解的材料时，需要适当提高循环数。
２２ 重复性试验
按上述确定的最佳条件进行组合，对３批Ｔａｋａ
ｒａｅｘＴａｑ酶进行实验，结果均十分稳定。表明该条
件的重复性好。
２３ 适用范围试验
人参在长期的栽培过程中，产生了不同的农家
品种，如大马牙、二马牙、黄果和长脖［３］。西洋参原
产地在美国、加拿大，自从成功引种到我国后，已有
不少地区开始大规模栽培。根据西洋参品质的不
同，其价格表现出极大的差异，如在同仁堂药店就有
每克３８０，１８０，０９８元不等的西洋参出售。同时
西洋参还被大量的加工成饮片，从而加大了人参、西
洋参鉴别的难度。因此，对不同药材来源，如不同产
地、不同价格、不同加工方式以及不同储藏时间的药
材进行正确鉴别，是保证临床用药安全的第一步。
为此，本试验选用人参的４个农家品种、不同药店出
售药材、标本以及粉末和西洋参的不同产地、不同价
格药材、饮片以及标本作为实验材料，具有广泛的代
表性。对收集到的代表性样品各１０批进行检测，结
果人参均能稳定扩增２４９ｂｐ条带，西洋参均能扩增
１０４９ｂｐ条带（图２）。
图２ 人参、西洋参ＭＡＳＰＣＲ鉴别电泳图
１～１０人参；１１～２０西洋参（分别对应表１中的各编号）；Ｍ１
２００，９００，７５０，５００，２５０，１００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ
３ 讨论
单核苷酸多态性（ＳＮＰ）是指在基因组水平上由
单个核苷酸的变异所引起的ＤＮＡ序列多态性，以其
分布广泛、数量众多、易于批量检测等优点而成为最
具前途的第３代遗传标记。在物种鉴定、物种起源
与亲缘关系、遗传育种等领域得到了广泛的应用，特
别是在区分近缘种的研究中非常有效［５］。目前，检
测ＳＮＰ的技术大量涌现，如等位基因特异 ＰＣＲ法、
Ｔａｑｍａｎ探针技术、分子信标等［６］，其中等位基因特
异ＰＣＲ（ａｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ，ＡＳＰＣＲ），又称为 ＡＲＭＳ
（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ），ＰＡＳＡ
（ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｅｌｅｓ），ＡＳＡ（ａｌｅｌｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）是应用最广泛的一种方法，主
要通过引物３′端碱基与模板的严格配对来实现对
ＳＮＰ位点的检测［１］。多重 ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）则
是同时加入几对引物，使几个ＰＣＲ在同一反应体系
中完成［７］。在上述２种方法的基础上，作者建立了
人参、西洋参的多重等位基因 ＰＣＲ，在一个 ＰＣＲ反
应过程中同时检测人参、西洋参的 ＳＮＰ位点，达到
同时特异性鉴别人参、西洋参的目的。
由于只存在一个碱基的变异，因此，引物设计、
ＰＣＲ反应体系、循环参数等均直接影响ＰＣＲ扩增的
效果。适宜的反应体系和反应条件是获得良好扩增
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效果的关键。本研究从 Ｔａｑ酶用量、ｄＮＴＰ浓度、
Ｍｇ２＋浓度、模板浓度和循环参数等方面，对人参、西
洋参的２个ＳＮＰ检测条件进行了摸索，发现特异等
位基因ＰＣＲ反应条件属于严紧型，高 ｐＨ、低盐浓
度、低Ｍｇ２＋浓度、模板ＤＮＡ、引物浓度和Ｔａｑ酶用量
均不宜太高，否则扩增反应易出现假阳性，造成误
判。有研究认为在 ＳＮＰ检测过程中，高保真 ＤＮＡ
聚合酶是成功的关键［８］，作者的试验也得到了同样
的结果，发现不同品质的 Ｔａｑ酶有可能导致假阳性
结果的产生，因此，在推广应用过程中需要设置阳性
对照药材，以保证所用Ｔａｑ酶和体系的可靠性。
本研究从 ＳＮＰ的发现途径、引物设计、ＰＣＲ反
应体系等方面全面证实了等位基因特异 ＰＣＲ在人
参、西洋参药材鉴别中的可行性和注意事项。随着
大量中药材基因组测序结果的出现，寻找和发现种
间以及种内ＳＮＰ，将在解决中药材近缘混淆品种、多
来源品种以及道地药材的鉴定问题上提供广阔的空
间。
［参考文献］
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ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｆｏｒａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆＰａｎａｘＧｉｎｓｅｎｇａｎｄＰｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ
ＣＵＩＧｕａｎｇｈｏｎｇ，ＴＡＮＧＸｉａｏｊｉｎｇ，ＨＵＡＮＧＬｕｑｉ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＳｅａｒｃｈｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＳＮＰｉｎＰａｎａｘｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｕｓｉｎｇｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ（ＭＡＳＰＣＲ）ｔｏ
ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅＰｇｉｎｓｅｎｇａｎｄＰｑｕｅｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍＭｅｔｈｏｄ：ＢａｓｅｄｏｎｇｅｎｂａｎｋｄａｔａｂａｓｅｏｆＰａｎａｘｓｐｅｃｉｅｓ，ｕｓｉｎｇＤＮＡＭＡＮｔｏａｌｉｇｎｔｈｅ
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