全 文 ：中国生态农业学报 2014年 4月 第 22卷 第 4期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Apr. 2014, 22(4): 496−500


* 国家自然科学基金项目(81273382)和湖南省自然科学基金项目(11JJ3113)资助
肖竹平, 主要研究方向为药物化学和应用有机化学。E-mail: xiaozhuping2005@163.com
收稿日期: 2013−10−04 接受日期: 2014−02−27
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2014.30961
4-(4-羟基)苯乙基-1,2-二羟基苯对土壤脲酶的抑制作用*
肖竹平 冯玉婷 何 娟 胡桐芳 曾 琴 周 娇
(吉首大学化学化工学院 吉首 416000)
中图分类号: S154.2 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2014)04-0496-05
Inhibitory activity of 4-(4-hydroxyphenethyl)-1,2-dihydroxybenzene
on soil urease
XIAO Zhuping, FENG Yuting, HE Juan, HU Tongfang, ZENG Qin, ZHOU Jiao
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)
(Received Oct. 4, 2013; accepted Feb. 27, 2014)
尿素是我国农作物的主要氮肥之一, 但由于土
壤微生物所产生脲酶的作用, 尿素施入土壤后, 会
迅速分解转化成氨气而造成流失, 使得农作物对尿
素的利用率不到40%[1]。尿素无效分解, 不仅降低肥
效, 而且过量产生氨, 一方面会在各种因素的作用
下转化为硝酸盐, 对地下水造成污染[2−3], 成为环境
恶化、人类患癌症的主要因素之一[4]; 另一方面会对
农作物生长造成不利影响, 严重时会导致烧苗。土壤
中氨含量增加, 还会对正在发芽的种子产生毒性[5]。
此外, 土壤中的氨受土壤酸碱度、离子交换能力、离
子类型及数量、风速等因素的影响, 一部分挥发至
空气中, 随着大气流动扩散, 继而随雨水返回地面 ,
造成水体富营养。脲酶抑制剂不仅可节省肥料用量,
提高作物产量, 而且可以减少环境污染。了解土壤
脲酶的活性和组成、进行脲酶抑制剂的开发和应用
对农业可持续发展具有重要意义。目前脲酶抑制剂
主要有氧肟酸类[6]、磷酸二酰胺类[7−8]、咪唑类[9]、
吖啶[10]和依卡倍特钠[11]等。其中只有磷酸二酰胺类
应用于农业生产。因此开发其他类型的环境友好的
脲酶抑制剂显得十分重要。
本课题组在脲酶抑制剂的研究方面进行了长
期探索 [6,12−14], 发现了有一定应用前景的脲酶抑制
剂——4-(4-羟基)苯乙基-1,2-羟基苯(PEB, 图1), 已证
明它对幽门螺旋杆菌脲酶具有良好的抑制作用[15]。该
化合物易于合成, 而且属于多酚类物质, 在环境中易
于降解[16−18], 符合绿色农业的要求。为此, 本文对PEB
作为土壤脲酶抑制剂的可能性进行了探索, 研究了
PEB对土壤脲酶活性和酶促反应动力学的影响, 为
寻求PEB在农业上的应用准备了条件。此外, 考虑到
土壤的脲酶活性和组成反过来会对脲酶抑制剂的效
果造成影响, 而土壤的脲酶活性和组成是由植被、
微生物菌落群、农业生产等因素决定的, 这些因素
又直接受城市化程度的影响, 因此本文根据城市化
程度的差异, 分别从湖南省长沙市、常德市和吉首
市选取土壤样本, 并对其脲酶活性进行了测定, 这
为合理使用尿素, 指导农业生产, 减少氨释放, 减轻
环境富营养问题提供了依据。

图 1 PEB的结构
Fig. 1 The structure of PEB
1 材料与方法
1.1 药品
试验用刀豆脲酶(Jack bean urease, U4002-20KU)
购于Sigma公司, 比活力为100 kU·g−1; 脲酶溶液: 1
mg刀豆脲酶、1 mL土壤脲酶提取液分别溶于10 mL
磷酸盐缓冲溶液。
1.2 试验方法
土壤样本采集: 从长沙市晓园公园、常德市兰
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江公园、吉首市吉首大学化工学院花坛分别采集
0~20 cm表层土壤, 每个地方采集3份土壤样本, 风
干、弃去沙石和植物残体, 过0.9 mm筛, 备用。
土壤脲酶提取 : 从上述土壤样本中各取20 g,
加入到等量的蒸馏水中超声1 h, 过滤, 得到各地土
壤的脲酶提取液。
土壤脲酶酶活力: 参考文献[19−20]的方法测定,
每份样本3次平行, 取各次测定结果的平均值。
PEB对脲酶活性的抑制 : 参照Weatherburn方
法 [12,21−22]测定酶促反应过程中释放NH3的量 , 在96
孔板中加入25 µL刀豆脲酶及土壤脲酶提取溶液, 分
别加入25 µL浓度为0.195 μg·mL−1、0.781 μg·mL−1、
1.562 μg·mL−1、1.897 μg·mL−1、3.125 μg·mL−1、5.261 μg·mL−1
的PEB, 在37 ℃下共培养0.5 h, 再加入50 µL 100 mmol·L−1
尿素的磷酸盐缓冲溶液, 在37 ℃下共培养1 h, 加入
显色液后继续共培养0.5 h, 用Spectra Max Plus 384
连续光谱酶标仪[美国Molecular Devices(MD)公司]
测定630 nm下吸光度(OD), 以乙酰氧肟酸为阳性对
照。按下式计算抑制率(I):
I(%)=100 100
OD OD
OD OD
−− ×−
测试 试剂空白
对照 试剂空白
(1)
PEB对酶促反应动力学的影响: 按上述方法, 在
尿素浓度为3.9 mmol·L−1、4.8 mmol·L−1、6.3 mmol·L−1、
9.1 mmol·L−1、16.7 mmol·L−1、100.0 mmol·L−1时, 测定
PEB浓度不同时所释放NH3的量, 以OD值表示, 所
不同的是, 加入显色液之前的共培养时间为5 min而
不是1 h, 以“OD值/共培养时间”作为酶促反应的初
速度 , 通过Lineweaver-Burk(双倒数图 )图来研究
PEB的抑制类型。
动力学常数Ki的确定: 根据Lineweaver-Burk曲
线相交于第2象限, 可以判断PEB对土壤脲酶具有线
性混合型抑制特性, 根据线性混合型抑制的酶促反
应动力学双倒数方程:
max max
[ ] [ ]1 1
1 1
[ ]
m
IS SI
SI
I IK
K K
V V S V
⎛ ⎞⎟⎜ ⎟+⎜ +⎟⎜ ⎟⎜⎝ ⎠= × + (2)
通过Lineweaver-Burk图分别计算每条曲线的斜
率和截距, 再分别对抑制剂浓度作图确定动力学常
数Ki与Ki′。
1.3 数据统计分析方法
所有数据采用SPSS 16.0进行统计分析, 数值采
用平均值±标准差的形式表达。
2 结果与分析
2.1 不同地区的土壤脲酶活性
吉首、常德和长沙的土壤脲酶活性分别为116.3
U·mL−1、106.9 U·mL−1和101.4 U·mL−1, 3地间土壤脲
酶活性差异显著, 且常德、长沙土壤脲酶活性显著
小于吉首(P=0.036, 0.010)。从城市化角度来看, 吉首
的城市化程度最低, 长沙最高。由此可见, 城市化程
度越高, 土壤脲酶活性越低。出现这种现象的原因
可能是城市化程度高, 农业活动较少或者没有, 尿
素使用量也少, 进而导致具有脲酶活性的微生物也
变少[23]。
2.2 PEB对不同地区脲酶活性的影响
从图2可以看出, PEB对几种脲酶的抑制率随浓
度的增大而提高, 当浓度达到1.56 μg·mL−1时, PEB
对刀豆脲酶和吉首、常德、长沙的土壤脲酶的抑制
率分别为57.11%、66.59%、67.85%、69.58%。经曲线
拟合求得PEB的IC50分别为1.40 μg·mL−1、1.29 μg·mL−1、
1.12 μg·mL−1、1.01 μg·mL−1 , 也即6.08 μmol·L−1、
5.61 μmol·L−1、4.86 μmol·L−1、4.39 μmol·L−1; 求得
阳性对照乙酰氧肟酸的IC50分别为19.10 μmol·L−1、
17.28 μmol·L−1、15.07 μmol·L−1、13.26 μmol·L−1。这表
明PEB比乙酰氧肟酸活性更高。对于相同的抑制剂,
土壤脲酶活性越高, IC50值也越大。因此, 在实际应
用中, 尿素中添加脲酶抑制剂的量应根据土壤情况
确定, 在脲酶活性高的土壤, 为了同时提高尿素利用
率和控制环境富营养, 须添加更多的脲酶抑制剂。

图 2 不同浓度 PEB对刀豆脲酶和 3种土壤脲酶活性的
抑制作用
Fig. 2 Inhibitory effect of different concentrations of PEB on
activities of Jack bean urease and soil urease in different areas
2.3 PEB对刀豆脲酶的酶促反应动力学影响
当刀豆脲酶溶液浓度固定时, 在某一PEB浓度
下, 分别测定尿素浓度([S])不同时酶促反应的初速
率Vc, 按Lineweaver-Burk作图法, 以“1/Vc”为纵坐标,
“1/[S]”为横坐标作图 , 得一直线 , 再改变PEB浓度 ,
得直线簇如图3所示(双倒数曲线)。从图中可以看出,
直线簇相交于纵轴, 表明PEB是刀豆脲酶的竞争性
抑制剂, 即PEB与尿素竞争脲酶的活性点。
498 中国生态农业学报 2014 第 22卷



图 3 不同 PEB浓度下刀豆脲酶的双倒数曲线
Fig. 3 Lineweaver-Burk plots of Jack bean urease under dif-
ferent PEB concentrations
从图3可以求出各直线的斜率k, 以斜率k对PEB
浓度[I]作图, 得一直线如图4所示(k-[I]图), 该直线
与横轴[I]的交点(−Ki)为−0.91 μg·mL−1, 因此PEB对
刀豆脲酶的抑制常数Ki为0.91 μg·mL−1。
2.4 PEB对土壤脲酶的酶促反应动力学影响
图 5为 PEB对吉首、常德、长沙 3地土壤脲酶
的酶促反应动力学的影响。从图中可以看出, 与刀豆
脲酶的情况不同, 这些 Lineweaver-Burk 曲线均相交
于第 2象限, 表明 PEB对土壤脲酶的抑制类型, 属于
线性混合型抑制。相应的 k-[I]直线和截距-[I]直线分
别如图 4和图 6所示, 吉首、常德、长沙的抑制常数
Ki分别为 0.88 μg·mL−1、0.72 μg·mL−1、0.68 μg·mL−1,
Ki′分别为 1.70 μg·mL−1、1.55 μg·mL−1、1.44 μg·mL−1。
显然, Ki小于对应的 Ki′, 表明 PEB与土壤脲酶直接结
合的强度比它与脲酶−尿素复合物的结合强度更大。
Ki和Ki′是反映抑制剂的特定常数, 当测定的温
度和pH等条件相同时, 与抑制剂本身及酶的浓度无
关, 只跟抑制剂和酶的种类有关。对上述K值进行统
计学分析, 发现PEB对刀豆脲酶以及吉首、常德、长

图 4 刀豆脲酶和不同土壤脲酶的双倒数曲线斜率−抑制
剂浓度曲线
Fig. 4 Ki determination plots of Jack bean urease and soil
urease from different areas

图 5 不同 PEB浓度下吉首(a)、常德(b)和长沙(c)3地土
壤脲酶双倒数曲线
Fig. 5 Lineweaver-Burk plots of soil urease from Jishou (a),
Changde (b) and Changsha (c) under different PEB concentrations

图 6 不同土壤脲酶双倒数曲线截距−抑制剂浓度曲线
Fig. 6 Ki′ determination plots against soil urease from
different areas
第 4期 肖竹平等: 4-(4-羟基)苯乙基-1,2-二羟基苯对土壤脲酶的抑制作用 499


沙3地土壤脲酶的抑制常数存在显著差异 , 并且与
酶活性、PEB的IC50存在正相关性。表明土壤脲酶的
活性越高 , K值也越大 , PEB的抑制效果也就越差 ;
同时还表明3地土壤脲酶的主要成分是相同的 , 但
种类和组成上还存在一些差异。由于土壤脲酶来自
于土壤中的微生物和植被[24−27], 因此不同地方植物
种类和微生物群的差异是导致土壤脲酶成分差异的
原因。
3 结论
通过PEB对刀豆脲酶与湖南省3地土壤脲酶活
性和酶促反应动力学的影响研究, 结果表明: 1)PEB
对土壤脲酶抑制属于线性混合型抑制; 2)吉首、常德
和长沙的土壤脲酶在组成上有所不同, 酶活力有显
著差异; 3)活力高的土壤脲酶, PEB对应的IC50也高,
两者之间存在正相关性; 4)对脲酶酶活性偏高的土
壤, 需要添加更多的脲酶抑制剂, 才能有效地利用
尿素和控制环境富营养问题。
这些研究结果为合理利用脲酶抑制剂, 提高尿
素利用率 , 减少空气中NH3含量 , 治理生态富营养
问题提供了理论指导, 为寻找生态环保型脲酶抑制
剂及其在农业和环境保护方面的应用准备了基础。
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