全 文 ：中国生态农业学报 2014年 4月 第 22卷 第 4期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Apr. 2014, 22(4): 480−490


* 福建省自然科学基金项目(2012j01082)和福建农林大学园艺学院基金项目(6112c0409)资助
** 通讯作者: 钟凤林, 主要研究方向为蔬菜资源与育种, E-mail: ZFL10305@126.com; 林义章, 主要研究方向为蔬菜遗传育种, E-mail:
lyz2003007@163.com
赵瑞丽, 研究方向为蔬菜遗传育种。E-mail: zrl2013520@163.com
收稿日期: 2013−10−11 接受日期: 2014−01−22
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2014.30985
铜胁迫下小白菜叶片基因表达谱的 cDNA-AFLP分析*
赵瑞丽 钟凤林** 林义章** 高世超 林俊芳 叶丽萍
(福建农林大学园艺学院 福州 350002)
摘 要 本研究以小白菜品种‘上海青’为试验材料, 利用 Cu2+质量浓度为 10 mg·L−1的营养液水培小白菜幼苗,
通过 cDNA-AFLP 技术分析小白菜响应铜胁迫相关基因及其表达情况。试验中利用多态性较好的 135 对引物
进行扩增, 共获得 5 800多条转录衍生片段(TDFs), 平均每个引物组合扩增出 30~60条, 片段大小主要集中在
100~1 000 bp, 根据条带强弱和有无的变化, 其表达模式可以分为持续表达、瞬时表达、上调表达和下调表达
4种情况。通过筛选获得 180条差异表达 TDFs, 其中上调表达 77条(42.8%), 下调表达 61条(33.9%), 瞬时表
达 42条(23.3%)。选取其中 152条差异表达 TDFs进行回收测序, 最终得到 151个有效序列, 其中上调表达 68
条(45%), 下调表达 50条(33.1%), 瞬时表达 33条(21.9%)。Blastx比对结果显示, 112条 TDFs序列与已知基因
具有较高的相似度, 涉及能量代谢、物质合成与运输、逆境响应、信号转导等多种途径, 16条 TDFs序列与功
能未知或假定基因的同源性较高, 其余 23 条 TDFs 序列与已知功能基因的同源性较低或零匹配, 可能是一些
新的铜胁迫应答基因。从 151条 TDFs选取 4条 TDFs, 以小白菜 actin基因为内参照, 对其在不同胁迫处理时
间的表达情况进行荧光定量 RT-PCR验证, 分析结果与 cDNA-AFLP结果基本吻合, 表明 cDNA-AFLP技术是
研究小白菜铜胁迫相关基因差异表达的有效方法。小白菜铜胁迫相关基因表达情况较为复杂, 涉及多种代谢
途径。本研究结果可为探讨小白菜铜胁迫的分子机理和相关基因的克隆提供理论依据。
关键词 小白菜 铜胁迫 基因表达谱 cDNA-AFLP
中图分类号: S634.3 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2014)04-0480-11
Gene expression profiling in response to copper stress in
Brassica rapa L. Chinensis by cDNA-AFLP
ZHAO Ruili, ZHONG Fenglin, LIN Yizhang, GAO Shichao, LIN Junfang, YE Liping
(College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract With the discharge of industrial wastewater, and application of copper-containing pesticides and fertilizers, copper
content in soils has increased steadily. This has had severe effect on yield and quality of Brassica rapa L. Chinensis. However, little
has been done in terms of analyzing the molecular biology of copper stress in B. rapa. In this research, copper stress responding
genes of B. rapa variety ‘Shanghaiqing’ were analyzed using the cDNA-AFLP technique. Seedlings were cultivated in solution with
10 mg·L−1 Cu2+ concentration for the cDNA-AFLP analysis. A total of 5 800 transcript-derived fragments (TDFs) were obtained via
cDNA-AFLP, with 135 primer pairs. Each primer pair was amplified to 30−60 bands with fragment size of 100−1 000 bp. The TDF
expression patterns were divided into four — up-regulation, down-regulation, transient-expression and continuous-expression. A total
of 180 differentially-expressed TDFs were identified from a total of 5 800 TDFs, which included 77 up-regulated (42.8%), 61
down-regulated (33.9%) and 42 transient-expressed (23.3%) genes. About 152 TDFs were recovered and sequenced, and 151 reliable
sequences obtained. The sequences included 68 up-regulated (45.0%), 50 down-regulated (33.1%) and 33 transient-expressed (21.9%)
genes. Also the functions of 151 of the reliable TDF sequences were determined through BLAST search in GenBank database. Out of
the 151 TDFs, 112 were homolog genes with known functions, 16 were similar genes with unknown functions and 23 had no se-
quence homology in GenBank entries. The functions of homologous genes were involved in energy and metabolism, protein
第 4期 赵瑞丽等: 铜胁迫下小白菜叶片基因表达谱的 cDNA-AFLP分析 481


synthesis and ion transport, stress response, signal transduction and regulation. Of the 151 reliable TDFs, 4 homologous genes were
selected for fluorogenic quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analyses. The analysis used actin of B.
rapa as internal reference gene. The results showed that cDNA-AFLP was a reliable technique for analyzing expression patterns of
genes involved in copper stress response. Genes involved in copper stress response were identified and their expression patterns suc-
cessfully determined. This study laid the theoretical basis for the analysis of molecular mechanism and cloning of genes related with
copper stress in B. rapa.
Keywords Brassica rapa L. Chinensis; Copper stress; Gene expression profiling; cDNA-AFLP
(Received Oct. 11, 2013; accepted Jan. 22, 2014)
铜是植物生长发育所必需的微量营养元素, 参
与植物的多种生命活动, 但过量的铜也会对植物产
生毒害作用, 使植物的水分代谢、光合作用、呼吸
作用等各种生理代谢发生紊乱 [1−3], 且铜经食物链
进入人体, 会危害人体健康[4]。小白菜(Brassica rapa
L. Chinensis)是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)
植物 , 营养价值较高 , 栽培面积较广 , 且深受人们
的喜爱。但近年来随着工业废水的排放及含铜农药、
化肥的使用, 土壤中铜含量越来越高, 严重影响了
小白菜的产量和品质。本实验室前期研究表明[5−8],
外界高铜胁迫能使小白菜叶片游离脯氨酸含量显著
增加, 可溶性蛋白、可溶性糖、硝酸盐、Vc含量及
NR活性降低, 保护酶系统受到破坏, 超氧化物歧化
酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性下降, 过氧化物酶
(POD)活性明显上升 , 同时产生更多的膜脂过氧化
产物丙二醛(MDA), 使膜相对透性增加 , 膜的完整
性遭到破坏; 细胞超微结构观察显示, 高铜胁迫下
小白菜叶肉细胞出现质壁分离, 且单位面积叶绿体
数目减少, 叶绿体内、外膜解体消失, 线粒体嵴混乱,
有泡状小球出现, 这些结果均表明植株对外界胁迫
的自我调节能力下降。目前, 小白菜铜胁迫已有的
研究多是涉及形态特征和生理生化变化等内容 [9],
对小白菜铜胁迫下基因表达谱的动态变化研究尚少
见报道。
cDNA-AFLP是Bachem等[10]发明的将RT-PCR和
AFLP两种技术组合并应用于RNA指纹分析的一种
分子标记技术。该技术能够非常方便、高效性地将
植物不同组织、不同生理发育阶段或同一组织不同
处理的差异表达基因片段分离出来, 而且扩增条带
的强度能够准确反映不同处理间基因表达量的差异,
从而能够全面获取转录组的表达信息[11]。目前, 该
技术已经分别从小麦、苦瓜、烟草等植物中成功分
离出响应AgNO3、低磷胁迫、低钾胁迫的基因[12−14],
但在小白菜上的应用尚少见报道。
为阐述小白菜响应铜胁迫的基因表达谱的动态
变化, 本研究利用cDNA-AFLP(cDNA amplified fragment
length polymorphism)技术分离鉴定出小白菜响应铜
胁迫的差异表达基因, 并对其功能进行分析, 旨在
为进一步揭示小白菜应答铜胁迫的分子调控机制 ,
提高小白菜抗铜胁迫能力奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验供试小白菜品种为 ‘上海青 ’, 试验于
2012 年 7—9 月在福建农林大学园艺学院设施实验
室进行。培养液配制参考叶菜类营养液标准配方[15],
其中对照组为标准 Cu2+含量, 质量浓度为 20.4 μg·L−1,
选取形态特征和生理生化指标均开始发生变化的
Cu2+质量浓度 10 mg·L−1作为处理组。育苗基质为珍
珠岩和草炭土, 其比例为 3︰18。待幼苗长到 4~5
片真叶时, 选择长势一致的幼苗用清水洗去根部基
质, 然后用泡沫板固定至培养液中培养, 每隔 5 d更
换 1 次培养液, 每次更换前取样。水培至 0、5 d、
10 d、15 d、20 d时采集第 5片真叶(去除主叶脉), 用
液氮充分冷冻后置−80 ℃冰箱保存用于 RNA提取。
每组试验设置 3次重复。
1.2 总 RNA的提取及 cDNA的合成
总 RNA的提取参考 Invitrogen公司的 Trizol试
剂说明书进行。取 5 μL的 RNA用 1%的琼脂糖胶进
行完整性检测。cDNA第 1链的合成参考 Invitrogen
公司的逆转录试剂盒 SuperscriptTM FirstⅢ -strand
cDNA Synthesis System for RT-PCR的说明书。cDNA
第 2链的反应液: cDNA第 1条链的合成产物 10.0 μL,
10×DNA Polymerase I Buffer 5.0 μL, RNase H 1.0 μL,
DNA Polymerase I 2.0 μL, dNTP mixture (10
mmol·L−1) 1.0 μL, ddH2O 31.0 μL, 总体积 50.0 μL。
轻柔混匀后短暂离心, 16 ℃孵育 3 h, 70 ℃ 10 min,
然后加入 2.5 μL(12.5 U)T4 DNA Polymerase和 1 μL
10 mmol·L−1 dNTP mixture, 37 ℃孵育 10 min。最后
加 5 μL 0.5 mol·L−1 EDTA (pH8.0)和 10 μL10%的
SDS终止反应。将合成后的双链 cDNA进行纯化后,
用紫外分光光度法测定其浓度。
1.3 cDNA-AFLP分析
cDNA-AFLP 分析参照 Bachem 等[10]的方法进
行。取 1 μL 限制性内切酶 EcoRⅠ和 MseⅠ对纯化
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后的 cDNA进行双酶切, 37 ℃ 20 min, 80 ℃ 5 min,
立即置冰上冷却。获得的酶切产物可直接与已制备
好的接头 EcoRⅠ和 Mse 16Ⅰ ℃连接过夜。连接产物
直接用于预扩增, 预扩增引物为 E00、M00, 预扩增
产物稀释至 10 ng·μL−1 进行选择性扩增 , 引物为
Exy、Mxy。选择性扩增产物在 6%聚丙烯酰胺凝胶
上 70 W功率进行差异条带的电泳分离。接头及扩增
引物序列见表 1。
表 1 接头和扩增引物序列
Table 1 Primer sequences of joints and amplimer
引物名称
Primer name
引物序列 Primer sequence
5′-CTCGTAGACTGCGATCC-3′ EcoRⅠ接头
EcoRⅠadapter 5′-ATCTGACGCTAGGTTAAP -3′
5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′ MseⅠ接头
MseⅠadapter 5′-TACTCAGGACTCAT-3′
M00 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′
E00 5′-GACTGCGATCCAATTC-3′
Exy 5′-GACTGCGATCCAATTCNN-3′
Mxy 5′-GATGAGTCCTGAGTAANN-3′
N为 A、T、G、C中的一种碱基。N is one base of A, T, G, C.

1.4 差异表达 TDFs(transcript derived fragments)
的回收与分析
用灭菌刀片切下具有明显差异的片段放入灭过
菌的 1.5 mL离心管中, 加入 60 μL双蒸水, 用枪头将
其捣碎, 放置沸水浴中 15 min, 冷却后, 12 000 r·min−1
离心 10 min, 取 5 μL 上清作为二次扩增模板。二次
PCR 所用的引物必须与该差异片段选择性扩增时所
用的引物对相一致。用天根 DNA Back 试剂盒对二
次 PCR产物进行回收纯化。将回收纯化后的差异条
带经连接、转化、验证后送上海博尚公司测序。测
序后的TDFs核苷酸序列于NCBI上进行Blastx比对,
预测其功能, 筛选出与铜胁迫相关的基因。
1.5 差异表达 TDFs的 RT-PCR验证
为验证 cDNA-AFLP 分析结果的可靠程度, 以
小白菜 Actin基因为内参照, 选取 TDF6B、TDF71A、
TDF87A、TDF100 4个 TDFs, 分别对其在不同胁迫
处理时间的表达情况进行荧光定量 PCR 验证, 内参
引物为小白菜 Actin基因 actin-F和 actin-R。实时定
量 PCR(RT-PCR)的具体步骤参考大连宝生物工程有
限公司的 SYBR Premix ExTaq试剂盒说明书进行。
其引物序列见表 2。
2 结果与分析
2.1 cDNA-AFLP分析
试验中首先随机选取 5 对引物组合, 对不同取
样时期的对照组植株进行 cDNA-AFLP 分析, 没有
表 2 荧光定量 PCR引物序列
Table 2 Primer sequences of real-time PCR
编号 Number 引物序列 Primer sequence
TDF100-F 5′-TGCTCCACAAGACAACAACATC-3′
TDF100-R 5′-TCCGAGAAACAAACCGAACA-3′
TDF6B-F 5′-CTATTTGTTGTTCCTCGTCCTTCTC-3′
TDF6B-R 5′-GCTGATGATTCCCCGTTTTC-3′
TDF87A-F 5′-CGGTCTAATCGCCGTTTCTC -3′
TDF87A-R 5′-TGGAGCACTTTCTTCTTCAGTCC-3′
TDF71A-F 5′-TAAGCAAGCCGCTCTATGACCT -3′’
TDF71A-R 5′-TTCTCTTCGTTCTTGAGTCCTGTG -3′
actin-F 5′-GTCCTGTTCCAGCCTTCGTTC-3′
actin-R 5′-CAAGTCCTTCCTGATATCCACGTC-3′

发现差异表达基因, 说明获得的基因差异性表达图
谱是由于铜胁迫引起的, 没有受到其他外来因素的
干扰。
利用筛选出的多态性较好的 135 对引物组合对
铜胁迫处理后 5 个取样时期小白菜叶片 cDNA 进行
选择性扩增, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 共获得
5 800多条转录衍生片段(TDFs), 平均每个引物组合
扩增出 30~60条, 大小主要集中在 100~1 000 bp范
围内。135 对引物组合共筛选出 180 条差异表达
TDFs, 约占扩增条带总数的 3%, 部分引物电泳结
果如图 1所示。

图 1 小白菜铜胁迫下部分引物组合的 cDNA-AFLP图谱
Fig. 1 cDNA-AFLP maps of Brassica rapa L. Chinensis under
copper stress with several primer pairs
A: 上调表达; B: 下调表达; C: 瞬时表达; D: 持续表达;
下同。A: up-regulation; B: down-regulation; C: transient-expression;
D: continuous-expression. The same below.

根据条带的有无和表达的强弱, 其表达模式大
致可以分为4种情况: 1)上调表达(图1中A类), 此类
基因在铜胁迫下诱导表达或增强表达, 其可能在抵
抗铜胁迫过程中起着重要作用; 2)下调表达(图1中B
第 4期 赵瑞丽等: 铜胁迫下小白菜叶片基因表达谱的 cDNA-AFLP分析 483


类), 此类基因在铜胁迫下表达受到抑制或表达减弱,
其可能与小白菜的某些生理代谢相关; 3)瞬时表达
(图1中C类), 此类基因在铜胁迫的特定时间段表达,
可能是某些具有特殊功能的调控因子, 也可能是植
物产生的临时应急反应, 在铜胁迫达到一定程度后
启动表达, 其表达产物在发挥作用后迅速降解; 4)持
续表达(图1中D类), 此类基因在对照和铜胁迫的各
个时间段均有表达, 且表达量无明显差异, 这类基
因可能是一些比较保守的组成型基因。180条差异表
达TDFs中 , 上调表达77条 (42.8%), 下调表达61条
(33.9%), 瞬时表达42条(23.3%)。cDNA-AFLP分析结
果显示, 小白菜在受到铜胁迫时, 体内的基因会发
生很大的变化, 一部分基因被铜胁迫诱导而上调表
达, 一部分基因被铜胁迫抑制而下调表达, 另一部
分基因则瞬时表达, 这些基因的产物可能参与提高
小白菜对铜胁迫的耐受性和抵御能力, 在响应铜胁
迫方面发挥作用。
2.2 差异表达 TDFs的序列比对与功能分析
为了解小白菜对铜胁迫的分子调控机制, 对部
分差异明显的基因进行测序和功能分析。180 条差
异表达 TDFs中挑选 152条进行二次 PCR扩增、回
收、测序, 最终得到 151条有效序列, 其中上调表达
68条(45%), 下调表达 50条(33.1%), 瞬时表达 33条
(21.9%)。将这 151 条 TDFs 序列在 NCBI 上进行
Blastx比对, 结果显示, 112条 TDFs序列与已知功能
基因具有较高的同源性, 16条 TDFs序列与功能未知
或假定基因的同源性较高, 其余 23 条 TDFs 序列与
已知功能基因的同源性较低或零匹配, 可能是一些
新的铜胁迫应答基因。112条 TDFs序列中上调表达
51 条(45.5%), 下调表达 36 条(32.1%), 瞬时表达 25
条(22.3%)。
112条TDFs序列功能分析结果显示(表 3), 小白
菜中与铜胁迫相关的差异基因较为丰富, 涉及能量代
谢、蛋白代谢、物质合成与运输、信号转导、转录
调控、逆境响应等多种途径。其中能量代谢相关基
因占 26.8%, 蛋白代谢相关基因占 17.9%, 物质合
成与运输相关基因占 6.3%, 信号转导相关基因占
10.7%, 转录调控相关基因占 16.1%, 逆境响应相
关基因占 22.3%。这些基因可能直接参与调控功能
蛋白的表达或者通过信号转导、转录调控途径调节
下游基因的表达。由此可见, 小白菜抵御铜胁迫的
分子机制相当复杂, 有大量的各种类型的基因参与
其中。
2.3 差异表达基因的 RT-PCR分析
为确保cDNA-AFLP分析结果的可靠性, 以小白
菜Actin基因为内参照 , 利用荧光定量PCR对4个差
异表达TDFs进行了验证。结果表明, 片段TDF6B、
TDF71A、TDF87A、TDF100在不同胁迫处理间呈现
差异表达, 且与cDNA-AFLP结果基本吻合(图2)。
在正常生长条件下, TDF71A(NEDD8活化酶E1
催化亚基)表达水平较低, 随胁迫时间的延长持续上
调表达, 在胁迫处理后期出现转录高峰且较稳定表
达 , 暗示TDF71A可能参与了铜胁迫早期的响应过
程, 在抵御铜胁迫过程中起着关键的作用; 在正常
生长条件下, TDF87A(RING锌指蛋白)维持较高表达
水平, 铜胁迫处理后下调表达, 且在胁迫初期表达
量就显著降低, 胁迫后期表达量基本稳定, 在铜胁
迫后第20 d转录水平降至最低; TDF100(泛素结合酶
E2)和TDF6B(CLC-d氯离子通道蛋白)在正常生长条
件下均低水平表达, 经铜胁迫诱导而上调表达, 但
在铜胁迫期间转录水平出现先上调后下调的变化 ,
且表达量均在胁迫后第10 d达到最大值, 胁迫后第
15 d两个片段的转录水平均显著下降, 此类基因的
表达首先被铜胁迫信号所诱导, 而被持续或严重的
铜胁迫抑制。上述结果表明, 本研究中得到的差异
表达cDNA片段真实可靠, cDNA-AFLP用于小白菜
铜胁迫应答基因表达分析完全可行。

图 2 小白菜铜胁迫下部分差异片段的 cDNA-AFLP图谱(A)和荧光定量 RT-PCR分析比对(B)
Fig. 2 Comparison of cDNA-AFLP map (A) and fluorogenic quantitative RT-PCR analysis (B) of Brassica rapa L. Chinensis under
copper stress
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3 讨论与结论
近年来土壤环境铜污染日益严重, 植物的铜毒
害问题逐渐显现, 植物抗铜毒害的研究成为科研热
点[16]。蔬菜受铜毒害较为明显, 早已引起研究者的
注意, 目前已有关于苋菜、小白菜等抗铜胁迫的研
究报道, 并且相关研究主要集中在光合作用、细胞
结构、酶学系统和其他营养元素的吸收等表观形态
变化的观测和生理生化机制等方面 [8], 尚无有关其
分子机理的研究报道。本研究利用cDNA-AFLP技术
从小白菜中成功分离出响应铜胁迫的151条TDFs序
列 , 对112条同源性较高的TDFs序列进行功能分析
发现, 铜胁迫响应过程涉及信号转导、转录调控、
蛋白质代谢、能量代谢、逆境响应、物质合成运输
等多种途径, 说明铜胁迫响应过程是对胁迫信号的
感受、传递和转导以及下游功能基因应答等众多的
基因通过多条通路综合协调作用的结果。
试验中发现的6类响应基因均以上调表达为主,
其中参与基因调控和信号转导的相关基因中56%为
上调表达, 表明小白菜更多地是通过主动调控来抵
抗铜胁迫的伤害 , 而非被动耐受。如钙调蛋白
(TDF35B)是钙信号转导过程中的重要感受器, 具有
调节重金属耐受性能力, 烟草超表达NtCBP4的植株
对Ni2+具有较强的耐受性[17]。TDF35B在铜胁迫下表
现为上调表达, 表明在铜胁迫过程中钙调蛋白与其
他效应物结合的亲和力增强, 从而诱导下游基因的
表达, 增强植物的抗铜性。ATP合酶β亚基(TDF120)
是ATP合酶的催化中心, 在跨膜质子梯度存在下能
将ADP转化为ATP, 促进光合作用过程中光合磷酸
化和电子传递的进行[18−20]。本研究中TDF120在铜胁
迫下表达量降低, ATP合酶活性下降, 光合作用受到
抑制。RNA解旋酶(TDF110D)位于各种应答途径的
上游, 在植物的生长发育、激素应答以及逆境反应
中起重要作用 [21−22], 有研究表明水稻DEAD-box
RNA解旋酶OsBIRHl基因转拟南芥植株提高了对黑
斑病和细菌性叶斑病的抗病性, 同时也增强了对干
旱胁迫和氧化胁迫的抗性[21]。本研究中TDF110D在
铜胁迫下表达量增加, 能够有效阻止RNA的错误折
叠, 使RNA正确折叠后行使正确的功能, 在转录水
平、转录后水平或翻译水平上调控下游功能基因的
表达。泛素结合酶(TDF100)在调控细胞周期、细胞
死亡(如凋亡)、信号传导、胁迫响应等方面具有重要
作用[23−25]。Feussner等[26]研究发现, 番茄LeUBC1基
因受热激和重金属诱导表达增强, 本研究发现在铜
胁迫下, TDF100表现为上调表达, 可能在铜胁迫中
更多地参与了信号传导过程, 其表达在胁迫初期明
显增强, 而后开始降低。
植物响应逆境的应答基因主要分为功能基因和
调节基因两大类。试验中获得的25个与逆境相关
TDFs中有许多与已鉴定的逆境胁迫相关功能基因
具有较高的同源性, 表明植物对于不同的逆境具有
相似的应答机理。如木糖基转移酶 (TDF26B、
TDF26D)通过催化转糖苷来调节细胞壁弹性、延展性,
进而影响植物的生长发育、逆境应答等功能[27−29]。水
稻OsXTH11过表达转基因植株对盐胁迫具有较强的
抗性 [30], 且XTHs的表达与植物细胞的延伸生长呈
正相关[31−32]。本研究中TDF26B、TDF26D在铜胁迫
后期表达量增强, 推测其可能通过促进细胞壁伸长
生长、调节细胞壁弹性延展性提高小白菜的抗铜性。
锌指蛋白(TDF74B、TDF87A、TDF109E、TDF111)
是一类具有手指状结构域的转录因子, 在基因表达
调控、细胞分化、胚胎发育等方面具有重要的作用,
导入外源锌指蛋白基因可提高植物抗逆性 [33]; Kim
等 [34]通过酵母双杂交系统证明SCOF-1蛋白能够与
SGBF-1蛋白发生相互作用, 共同调节下游耐冷基因
的表达, 进而增强植物的抗低温胁迫的能力; 王雷
等 [35]研究发现C3HC4型锌指蛋白的过量表达能够
提高小黑杨的抗盐能力。但目前有关锌指蛋白在
植物抗铜胁迫中所起作用的研究尚鲜见报道。本
研究发现, TDF74B(C2H2型)、TDF109E(C3H4型)、
TDF111(C3H4型)在铜胁迫下均表现为上调表达, 而
TDF87A(C3HC4型 )为下调表达 , 且4种锌指蛋白
隶属于不同的亚族 , 说明锌指蛋白家族各成员通
过不同的方式响应胁迫。此外, AP2/ERF(TDF16B)、
MYB(TDF87D)类转录因子也能调节植物对ABA、病
原、低温、干旱及高盐等的分子应答反应, 提高作
物对逆境胁迫的耐受能力 [36−39], 在铜胁迫下
TDF16B、TDF87D均表现为上调表达, 此类基因可
能在响应铜胁迫中发挥较为重要的作用, 值得进一
步深入研究。
本研究结果显示小白菜铜胁迫响应涉及的基因
表达情况较为复杂, 与信号转导、能量代谢、蛋白
代谢、物质合成运输、逆境响应、转录调控等均有
关系。尽管我们得到了大量的响应铜胁迫的差异表
达 TDFs, 但是这些 TDFs 在铜响应过程中的作用还
只是推测, 需要进一步通过克隆、转基因等手段对
其功能进行分析、验证, 明确其在抗铜胁迫过程中
的具体作用。这将为揭示小白菜响应铜胁迫的分子
遗传机理提供重要的参考, 从而为提高小白菜铜抗
性研究奠定基础。
第 4期 赵瑞丽等: 铜胁迫下小白菜叶片基因表达谱的 cDNA-AFLP分析 489


参考文献
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