全 文 ：中国生态农业学报 2013年 2月 第 21卷 第 2期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Feb. 2013, 21(2): 207−211


* 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA10Z404)和安徽科技学院预研项目(ZRC2012311)资助
段海明(1982—), 男, 博士, 讲师, 主要从事农药毒理与应用技术研究。E-mail: heminges88@163.com
收稿日期: 2012−08−06 接受日期: 2012−10−17
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2013.00207
两株蜡状芽孢杆菌对毒死蜱的降解动力学研究*
段海明1,2
(1. 山东农业大学植物保护学院 泰安 271018; 2. 安徽科技学院植物科学学院 凤阳 233100)
摘 要 利用微生物消除农药污染是一项安全、经济、有效的方法, 降解动力学模型的构建有助于理解污染
物的生物降解行为和估测系统中特征污染物的浓度变化, 菌株对高浓度污染物的降解效果是降解菌在受污染
水体中实际应用的关键。本研究采用基础培养基中定量添加毒死蜱和定时取样分析毒死蜱残留浓度的方法,
探讨两株蜡状芽孢杆菌(HY-1和 HY-2)的接种体培养时间、接种量和降解菌对毒死蜱的降解动力学, 同时研究
了降解菌对高浓度毒死蜱的降解率。结果表明: HY-1和 HY-2最适接种体培养时间分别为 10 h和 19 h, 接种体
培养时间对菌株降解毒死蜱的影响较大。两菌株最适接菌量为 8%(v/v), 接种量从 4%增至 8%时, 接种量对
HY-1降解毒死蜱的影响大于 HY-2。当毒死蜱的初始浓度为 40 mg·L−1、80 mg·L−1、100 mg·L−1和 120 mg·L−1
时, 一级动力学方程 ln(C0/Ct)=kt 可以用来拟合两菌株对毒死蜱的降解动力学及确定降解动力学参数, 当毒死
蜱初始浓度再次增加时, 仅 HY-2 对毒死蜱的降解符合一级动力学方程。当毒死蜱初始浓度为 40~120 mg·L−1
时, 菌株 HY-1对毒死蜱的降解速率常数分布在 0.013 5~0.015 7; 当毒死蜱初始浓度为 40~200 mg·L−1时, 菌株
HY-2的降解速率常数分布在 0.008 0~0.015 3。菌株HY-2比HY-1可以在较高的毒死蜱浓度下发挥降解作用, 且
降解率较高。因此, 两菌株在毒死蜱污染水体的净化去毒方面具有重要意义。
关键词 毒死蜱 生物降解 蜡状芽孢杆菌 降解动力学
中图分类号: X172 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2013)02-0207-05
Kinetics of chlorpyrifos degradation by Bacillus cereus strains
DUAN Hai-Ming1,2
(1. College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China;
2. College of Plant Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)
Abstract Organophosphorus pesticides have been widely used to control insect pests in agriculture. These compounds have been
implicated in several nerve and muscular diseases in humans. Large-scale manufacturing and handling of organophosphate
insecticides have caused the contamination of soils, air, surface water and groundwater across the globe. Chlorpyrifos degradation
has become an increasingly important area of research in recent years. The current focus has been on the development of cost
effective and eco-friendly technologies for treating polluted environments. Biodegradation has offered an efficient and cheap option
for such decontamination process. Similarly, biodegradation has also been the main mechanism for removed chlorpyrifos residue,
especially in the treatment of discharged wastewater from the varied processes of chlorpyrifos production. The study of the
degradation kinetics was useful for understanding biodegradation processes as well as estimating pollutant concentrations. The
degradation of high concentration pollutants was critical for developing practical applications of degrading bacteria. In this study, two
pure Bacillus cereus strains (HY-1 and HY-2) were used in chlorpyrifos biodegradation in a batch of shake-flasks. The rate and extent
of biodegradation were quantified at different chlorpyrifos initial concentrations (in the range of 40~200 mg·L−1) by B. cereus
through adding chorpyrifos to mineralized medium and analyzing chlorpyrifos residue at a definite time. At the same time, the effects
of incubation times and size of inoculum on chlorpyrifos degradation rate were determined. The degradation rate of high chlorpyrifos
concentration by B. cereus was also measured. The results showed that the appropriate incubation time of inoculum of HY-1 and
HY-2 strains were 10 h and 19 h respectively. The data suggested that inoculum incubation time significantly influenced chlorpyrifos
degradation efficiency. Optimum inoculum amount for the two strains was 8% (v/v) of total volume. The effect of inoculum size on
HY-1 degradation function was greater than that of HY-2 as the ratio increased from 4% to 8%. The simulated results suggested that
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the fit of the first-order kinetics model [ln(C0/Ct)=kt] was good for initial chlorpyrifos concentrations of 40 mg·L−1, 80 mg·L−1, 100
mg·L−1 and 120 mg·L−1. With further increases in chlorpyrifos concentration, only HY-2 followed the first-order kinetics model in
terms of chlorpyrifos degradation. When chlorpyrifos concentration was within 40~120 mg·L−1, HY-1 degradation efficiency constant
was within 0.013 5~0.015 7. Similarly, HY-2 degradation efficiency constant was within 0.008 0~0.015 3 when the chlorpyrifos
concentration was 40~200 mg·L−1. HY-2 strain was possibly more suitable for higher chlorpyrifos concentration than HY-1 in terms
of chlorpyrifos degradation, with HY-2 degradation rate relatively higher as well. The results suggested that further research was
needed on the two microbes to fully understand their use as potential bio-agents in chlorpyrifos water contaminated remediation.
Key words Chlorpyrifos, Biodegradation, Bacillus cereus, Degradation kinetics
(Received Aug. 6, 2012; accepted Oct. 17, 2012)
毒死蜱作为替代高毒有机磷农药的品种之一 ,
是目前我国农药的畅销品种, 但毒死蜱作为一种异
源有毒物质, 大量生产使用的同时也使生态平衡遭
到不同程度的破坏, 而且影响农产品安全, 毒死蜱
在环境中的降解去毒不容忽视[1−3]。利用微生物消除
农药污染是一项安全、经济、有效的方法, 具有广
阔的应用前景[4]。污染物的降解动力学研究无论在
污染物的环境行为预测还是在污染物修复方案的制
订方面都是至关重要的[5]。然而至今还少有蜡状芽
孢杆菌对毒死蜱的降解动力学研究。因此, 深入研
究蜡状芽孢杆菌不同菌株对毒死蜱的降解动力学对
于该菌的实际利用和阐明该菌的生物降解机制具有
重要意义。
降解菌对环境的适应性是菌株在环境中实际应
用的关键所在, 其中对高浓度特征污染物的降解率
是菌株能否成功应用到污染物治理工程中的关键[6]。
一般农药生产会受到淡旺季的影响, 生化废水的水
质和水量的波动性较大, 其中污染物的浓度也随之
变化较大[7]。因此, 降解菌株需要有一定的抗冲击负
荷能力, 菌株对高浓度特征污染物要具有一定的降
解效率。除此之外, 接种体的培养时间和接种量也
是影响降解菌降解效率的重要因子[8]。本文对两株
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的接种体培养时间、
接种量、菌株对毒死蜱的降解动力学和对高浓度毒
死蜱的降解率进行了研究, 以期为毒死蜱污染地区
的生物净化提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 菌种与培养基
1.1.1 供试菌种
以从山东某农药企业生化废水处理池中分离到
的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HY-1 和 HY-2 为研
究对象, 在Genbank上的注册登录号分别为 eu915687
和 eu915686。
1.1.2 供试药品
已知纯度为 95.9%的毒死蜱(Chlorpyrifos)原药
购于山东华阳农药化工集团有限公司, 配成 48%毒
死蜱乳油储存于 4 ℃冰箱备用。其他试剂均为国产
分析纯。
1.1.3 培养基
普通培养基: 牛肉浸膏 3.0 g, 胰蛋白胨 5.0 g,
酵母膏 1.0 g, NaCl 5.0 g, 去离子水 1 L, pH 7.0, 可
加入 1.5%的琼脂制成固体培养基, 用于菌株的平板
培养。
基础培养基 : K2HPO4 1.5 g, KH2PO4 0.5 g,
MgSO4·7H2O 0.2 g, NaCl 0.5 g, NH4NO3 1.5 g, 去离
子水 1 L, pH 7.0。
种子液培养基: 胰蛋白胨 5.0 g, 酵母膏 5.0 g,
KH2PO4 1.0 g, 去离子水 1 L, pH 7.0。
1.2 试验方法
1.2.1 接种体不同培养时间对降解率的影响
无菌条件下将两菌株 HY-1和 HY-2分别接种到
含有 200 mg·L−1毒死蜱的普通培养基平板上, 在 33
℃下培养 72 h。取 2个接菌环菌苔接种于 100 mL种
子液培养基中, 在 33 ℃、170 r·min−1下摇培, 其中
HY-1分别培养 6 h、9 h、10 h、12 h、14 h和 15 h, HY-2
分别培养 12 h、15 h、18 h、19 h、21 h和 23 h, 得
到不同培养时间的菌悬液, 用种子液培养基调节不
同培养时间的菌悬液至 OD600=3.0 备用 , 然后以
8%(v/v)的接种量接种到含 100 mL基础培养基的 250
mL 三角瓶中, 毒死蜱的初始浓度设为 80 mg·L−1,
于 33 ℃、170 r·min−1下摇培 72 h。每个处理重复 3
次。培养结束后提取测定培养液中药剂的残留量 ,
计算降解率, 得出接种体的最适培养时间。
1.2.2 接种量对降解率的影响
在含有 100 mL基础培养基的 250 mL三角瓶中,
毒死蜱初始浓度设为 80 mg·L−1, 设置两菌株不同的
接种量, 分别为 2%、4%、6%、8%和 10%(v/v), 检
测不同接种量对毒死蜱降解率的影响。每个处理重
复 3次。72 h后提取测定培养液中药剂的残留量, 计
算降解率。
1.2.3 两菌株对毒死蜱的降解动力学
在含有 100 mL基础培养基的 250 mL三角瓶中,
第 2期 段海明: 两株蜡状芽孢杆菌对毒死蜱的降解动力学研究 209


分别加入适量的毒死蜱 , 使其终浓度分别为 40
mg·L−1、80 mg·L−1、100 mg·L−1、120 mg·L−1、150
mg·L−1和 200 mg·L−1, 接菌量为 8%(v/v)。于 33 ℃、
170 r·min−1下摇培。分别于 12 h、24 h、36 h、48 h、
60 h和 72 h取样, 分析毒死蜱的残留量, 对毒死蜱
的降解动力学进行线性拟合。以不接种降解菌的处
理作为对照。每个处理重复 5次。
1.2.4 两菌株对高浓度毒死蜱的降解率测定
在含有 100 mL基础培养基的 250 mL三角瓶中,
分别加入适量的毒死蜱 , 使其终浓度分别为 300
mg·L−1、400 mg·L−1、500 mg·L−1和 600 mg·L−1, 接
种量为 8%(v/v)。于 33 ℃、170 r·min−1下摇培。72 h
后提取测定培养液中药剂的残留量, 计算降解率。
每个处理重复 3次。
1.2.5 毒死碑降解率的测定方法
降解结束之后, 取 5 mL反应液用等体积的石油
醚提取 2 次, 合并 2 次提取液后检测。利用毒死蜱
在 λ=290 nm左右处有紫外特征吸收峰的特性[9], 通
过紫外分光光度计扫描确定在 λ=292 nm 处测定样
品的 OD292, 根据标准曲线计算样品中毒死蜱的含
量, 计算毒死蜱的降解率。
1.3 数据分析
试验数据均采用 SPSS 13.0软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 接种体不同培养时间对毒死蜱降解率的影响
从图 1 可见, 当接种体的培养时间小于 9 h 时,
菌株 HY-1对毒死蜱的降解率非常低。然而从 9 h到
10 h, 降解率增长很快, 当培养时间为 10 h时, 降解
率达到最大(69%), 当培养时间大于 10 h, 降解率逐
渐降低。从图中还可以得出, HY-2 最适的接种体培
养时间比HY-1长, HY-2接种体的培养时间小于 18 h
时, HY-2 对毒死蜱的降解率随着培养时间的增加而
缓慢提高; 当培养时间达到 19 h 时, 降解率达到最
大(60%); 当培养时间大于 19 h时, 降解率则随着培
养时间的延长而有所下降。因此确定 HY-1 和 HY-2
两菌株最适接种体培养时间分别为 10 h和 19 h。
2.2 接种量对毒死蜱降解率的影响
从图 1 可见, 菌株 HY-1 的接种量从 2%增加到
8%时, 接菌培养 72 h 后的降解率从 7%增至 61%,
再增加接种量, 降解率有所下降。这表明在 100 mL
含药基础培养基中, 接种量为 8%时可以达到最高的
毒死蜱降解率。随着接种量的增加, HY-2 对毒死蜱
的降解率也在逐渐增加, 最适接种量为 8%。从图中
还可以看出, 当接种量从 4%增至 8%时, 接种量对
菌株 HY-1降解毒死蜱的影响大于 HY-2。
2.3 两菌株对毒死蜱的降解动力学
一级动力学方程已经被广泛用于描述有机污染
物的生物降解过程[10]。本试验所用的动力学方程为:
ln(C0/Ct)=kt, Ct 代表降解后某时间点的毒死蜱浓度;
C0代表毒死蜱的初始浓度; k代表降解速率常数; t代
表降解时间。方程的拟合度由 R2进行评价[11]。图 2(a,
b)显示了 ln(C0/Ct)与时间 t之间的关系。当毒死蜱的
初始浓度为 40 mg·L−1、80 mg·L−1、100 mg·L−1和 120
mg·L−1 时, 两菌株的降解曲线均符合一级动力学方
程。然而, 当毒死蜱的初始浓度为 150 mg·L−1和 200
mg·L−1时, HY-2对毒死蜱的降解符合一级动力学方
程而 HY-1不再符合。
从表 1 可见, 当毒死蜱初始浓度范围为 40~120
mg·L−1时, 菌株HY-1对毒死蜱的降解速率常数分布
在 0.013 5~0.015 7。当毒死蜱初始浓度范围为
40~200 mg·L−1时, 菌株 HY-2 的降解速率常数分布
在 0.008 0~0.015 3。



图 1 蜡状芽孢杆菌两菌株不同培养时间和不同接种量对毒死蜱降解率的影响
Fig. 1 Effect of incubation time and inoculation amount of two strains of B. cereus on the degradation rate of chlorpyrifos
图中数据为 3个重复的平均值。柱状图上方的不同小写字母表示同一菌株不同接种量在 0.05水平上降解率差异显著(Duncan检验)。Each value
is the average of three replicates. Different lowercase letters indicate significant difference among different incubation amounts at 0.05 level (Duncan test).
210 中国生态农业学报 2013 第 21卷




降解时间 Degradation time (h)

图 2 菌株 HY-1(a)和 HY-2(b)对不同初始浓度毒死蜱降解曲线的线性拟合
Fig. 2 Linear fitting of degradation curves of chlorpyrifos with different initial concentrations by two B. cereus strains (a: HY-1; b: HY-2)


表 1 菌株 HY-1和 HY-2对不同初始浓度毒死蜱的降解
动力学参数
Table 1 Parameters of the degradation kinetics of different initial
concentrations of chlorpyrifos by B. cereus strains HY-1 and HY-2
HY-1 HY-2 毒死蜱初始浓度
Chlorpyrifos initial concentration
(mg·L−1) k R
2 k R2
40 0.014 5 0.989 1 0.008 0 0.951 7
80 0.015 7 0.979 4 0.012 0 0.968 2
100 0.013 7 0.962 1 0.012 5 0.955 8
120 0.013 5 0.962 5 0.013 0 0.978 8
150 — — 0.015 3 0.955 7
200 — — 0.014 4 0.956 2

2.4 两菌株对高浓度毒死蜱的降解率
从表 2可见, 当毒死蜱浓度为 300 mg·L−1和 400
mg·L−1 时, 两菌株对毒死蜱的降解率相差不大。当
毒死蜱浓度继续升高时, 两菌株对毒死蜱的降解率
则开始下降, 两菌株对毒死蜱的降解率差异也开始
变大。菌株 HY-2比 HY-1可以在较高的毒死蜱浓度
下发挥降解作用, 且降解率较高。

表 2 HY-1和 HY-2对高浓度毒死蜱的降解率
Table 2 Degradation rates of high concentrations of
chlorpyrifos by B. cereus strains HY-1 and HY-2
降解率 Degradation rate (%)毒死蜱浓度
Chlorpyrifos concentration (mg·L−1) HY-1 HY-2
300 35.7±1.8a 30.6±0.1a
400 13.5±0.3a 24.4±4.4a
500 6.4±0.9b 20.3±0.5a
600 6.2±1.3b 17.3±1.9a
同行数据(平均值±标准误)后的不同小写字母表示处理间 0.05水
平上差异显著(t-检验) Different lowercase letters after the data (mean
± S. E.) in the same line indicate significant difference at 0.05 level
(t-test).
3 讨论与结论
为了保证作物的高产、稳产, 农药的生产和使用
量逐渐加大, 但是伴随着农药的广泛使用, 农药残
毒问题日益突出。毒死蜱作为有机磷农药的代表品
种, 现已成为有害生物防治的骨干品种。但是基于
毒死蜱对高等动物的毒性和潜在风险, 应该重视和
解决该药剂的残留降解, 以减缓其对环境造成的影
响[12]。微生物降解由于具有诸多优点, 已成为当今
研究的热点[13]。本研究在前期试验中筛选到两株毒
死蜱降解菌, 为毒死蜱污染环境的治理提供了一条
有效途径。接种体的培养时间和接种量被认为是微
生物降解农药或生物修复受农药污染地区是否成功
的关键[14]。接种体的培养时间决定了降解菌对污染
物启动快速降解的时间[15]。Adhikari 等[16]分离到 1
株降解马拉硫磷的降解菌(Bacillus sp. S14), 当接种
体培养时间为 20 h, 接种量为 4%时, 于 28 ℃、120
r·min−1下摇培一定时间后, 对 50 mg·L−1的马拉硫磷
具有较高的降解率。本研究也发现接种体培养时间
对菌株降解毒死蜱有显著影响, 两菌株适宜的接种
体培养时间存在差异性, 不同的菌株对应着不同的
最适接种体培养时间, 这就从一个侧面反映了两菌
株在遗传进化上的差异性。微生物在降解污染物时
主要依靠自身产生的酶, 酶活性越大, 降解效果越
趋于良好, 而微生物体内酶活性及酶的数量与培养
时间密切相关[17]。菌体接种量的多少也是影响污染
物有效降解的重要因素[18]。接种量少, 将使污染物
降解的适应期延长, 增加降解能耗, 而且也会增加
杂菌污染的机会。适当增加接种量可以加快污染物
的去除效率, 但是接菌量较多时, 培养液中的营养
物质相对不足会导致菌体无法得到充足的营养而影
响其生长, 菌体之间竞争加剧, 此时菌体发挥降解
作用受到限制, 促使菌体“早衰”或者“自溶”, 因此
降解率降低。因此, 选择适宜的接种体培养时间和
接种量对污染物的有效降解是非常必要的。所以本
研究确定在 100 mL 基础培养基中, 毒死蜱浓度为
80 mg·L−1时, HY-1和 HY-2两降解菌株最适接种体
第 2期 段海明: 两株蜡状芽孢杆菌对毒死蜱的降解动力学研究 211


培养时间分别为 10 h和 19 h, 接种量为 8%(v/v)时可
以达到最高的毒死蜱降解率。降解动力学模型的构
建能够有助于理解污染物的生物降解行为以及估测
系统中污染物的浓度变化[19]。吴祥为等[20]从江苏某
农药企业毒死蜱生产废水处理系统采集污泥, 采用
富集驯化培养的方法分离出 3 株毒死蜱高效降解菌
株 B、D1和 D3, 当基础培养基中毒死蜱初始浓度为
10 mg·L−1时, 3 个菌株对毒死蜱的降解符合一级动
力学方程, 降解动力学常数分别为 0.054 3、0.047 9
和 0.062 0, 其中 D3菌株(Rhodococcus rhodochrous)
对毒死蜱的降解效果较好。本研究发现, 毒死蜱初
始浓度在 120 mg·L−1以下时可以用一级动力学方程
ln(C0/Ct)=kt 来拟合两菌株对毒死蜱的降解动力学,
但降解动力学常数比 D3 菌株小, 这可能是降解菌
株之间的差异造成的。由于受污染地区农药的浓度
变化较大, 微生物对高浓度特征污染物的有效降解
是保证降解菌连续稳定使用的关键[21]。本研究发现,
两菌株对高浓度的毒死蜱有一定的降解能力, 但是
降解率较低。推测原因: 一是高浓度毒死蜱对降解
菌的生长有一定抑制作用, 在短期内达不到使毒死
蜱发生快速降解的菌量, 毒死蜱降解酶的产生也受
到抑制; 二是降解菌在短期内还不能适应高浓度毒死
蜱的环境或菌体自身正在发生一系列变化来应对高浓
度的毒死蜱, 从而使毒死蜱的快速降解期延迟。
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