全 文 ：高效液相色谱法测定犬血浆中丹参素钠
智红英1, 2 ,钟大放1, 3* ,马晓菊2 , 宋吉伦2 ,李桂生2, 4 ,刘 珂2, 4
( 1 沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳 110016; 2 山东绿叶天然药物研究开发有限公司, 山东 烟台 264003;
3 中国科学院上海药物研究所, 上海 201203; 4 烟台大学药学院, 山东 烟台 264005)
摘 要:目的 建立了紫外检测的快速灵敏的高效液相色谱法, 用于测定犬血浆中的丹参素钠。方法 血浆样品
经液-液萃取后,以原儿茶酸为内标, 采用 Discovery C18色谱柱进行分离, H PLC 测定犬血浆中的药物浓度。结果
犬分别静脉滴注给予 10、20、40 mg/ kg 丹参素钠后, AUC0- t、AUC0- 、Cmax均与给药剂量呈线性相关。AUC0-t、
AUC0- 的相关系数分别为 0 964、0 964。Cmax的相关系数为 0 934 7;丹参素钠在犬体内的药动学过程符合二室模
型。结论 通过方法学确证,该方法可以应用于丹参素钠在犬血浆中的药物动力学研究。
关键词:丹参素钠; 二室模型;高效液相色谱
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2009) 06 0886 03
Determination of sodium danshensu in dog plasma by HPLC
ZHI Hong-ying
1, 2
, ZHONG Da-fang
1, 3
, MA Xiao- j2 , SONG J-i lun2 , L I Gu-i sheng2, 4 , L IU Ke2, 4
( 1 School of Pha rmacy, Shenyang Pharmaceut ical Univ ersity , Shenyang 110016, China; 2 Shandong Luye Natural Drug s
Resear ch & Development Co. , L td. , Yantai 264003, China; 3 Shanghai Institute of Mater ia Medica, Chinese Academy
of Sciences, Shanghai 201203, China; 4 Schoo l o f Pharmacy , Yantai University, Yantai 264005, China)
Abstract: Objective To develop a high-per formance liquid chromatog raphic method for the determina-
t ion o f sodium danshensu in dog plasma Methods The samples w ere ext racted from plasma by liquid- liq-
uid ex t ract ion, separated through a Discovery C18 column, and protocatechuic acid w as used as the internal
standard in determ inat ion of sodium danshensu in dog plasma by HPLC Results A fter iv administr at ion
of sodium danshensu to dog s at doses of 10, 20, and 40 mg / kg, r espect ively, the AUC0-t , AU C0- , and
Cmax dose relat ionships w er e evaluated to be linear ( r= 0 964, 0 964, and 0 934 7) . The results o f the
compartmental analysis indicated that the kinet ic pro cess of sodium danshensu in dogs in v iv o was best f it-
ted to a tw o-compartment model Conclusion The method is successful ly applied to def inat ion of the plas-
ma concentrat ion- t ime curves after iv dr op administ rat ion of sodium danshensu to dogs
Key words: sodium danshensu; tw o-compar tment model; HPLC
丹参素[ D( + )--( 3, 4-二羟基苯基)-乳酸]是
丹参的主要有效成分之一,具有抗心肌缺血, 改善微
循环,抗炎 [ 1] 和对脑损伤有良好的保护等作用 [ 2]。
丹参单味药材及其复方制剂口服或注射的丹参素体
内过程研究结果相差较大[ 3~ 5]。本实验建立了丹参
素钠在犬血浆中的定量分析, 获得了可靠的药动学
参数,为临床药动学研究提供参考。
1 仪器与材料
美国安捷伦公司 Agilent1100高效液相色谱仪
(在线脱气机,四元泵, 自动进样器,柱温箱, UV检测
器, Chemstat ions 色谱工作站) , 飞鸽牌 Anke DC
6000B低速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。
丹参素钠对照品和丹参素钠原料药均由山东省
天然药物工程技术研究中心提供, 质量分数分别为
99 4%、99 4%;内标原儿茶酸购自中国药品生物制
品鉴定所(批号: 809-200102) ; 甲醇为色谱纯, 水为
重蒸馏水,其他试剂均为分析纯。
健康 Beag le犬 18只,雌雄各半, 体质量 9 5~
11 5 kg ,南海市科金实验动物科技有限公司提供,
合格证号: Scxk(粤) 2003-0006。
2 方法与结果
2 1 丹参素钠对照品溶液的配制:精密称取丹参素
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* 收稿日期: 2008- 10-12 作者简介:智红英 ( 1973 )女,山东郓城人,主管药师,主要从事药代和毒代方面研究工作。
T el : (0535) 2128672 E-mail: zhihongying@ 126 com
* 通讯作者 钟大放 T el: ( 021) 50800738 E-m ail: Dfzh on g@ mail shcn c ac cn
钠对照品 12 5 mg ,用 0 1 mol/ L 盐酸(含 0 2%亚
硫酸氢钠)溶解并定容至 50 mL,配制成 250 g / mL
的对照品溶液, 并依次稀释成 100、25、10、2 5、1 0、
0 2 g/ mL 系列对照品溶液。
2 2 内标原儿茶酸溶液的配制:精密称取原儿茶酸
对照品 10 mg , 用 0 1mo l/ L 盐酸(含 0 2% 亚硫酸
氢钠)溶解并定容至 50 mL, 并稀释成 10 g/ mL 的
内标溶液。
2 3 色谱条件: Discovery C18色谱柱 ( 250 mm
46 mm,5 m);流动相:甲醇-水-磷酸( 109002) ;检
测波长: 281 nm;体积流量: 08 mL/ min;柱温: 35 。
2 4 给药方案与样品采集: Beag le犬 18只随机分
成 3个剂量组, 雌雄各半, 试验期间自由进食与饮
水。丹参素钠原料用生理盐水配制成 10、20、40
mg/ kg 的剂量经犬前肢静脉点滴给药, 30 m in 点滴
完成, 于点滴过程中第 10、20分钟及给药前( 0 h)和
点滴结束后 0 083、0 17、0 33、0 5、0 75、1 0、1 5、
2 0、2 5、3 0、3 5、4 0 h经犬前或后肢中静脉取血
约 2 mL, 置肝素化离心管中, 离心, 分离血浆,
- 20 冰箱中保存待测。
2 5 血浆样品的预处理: 取肝素抗凝血浆 100 L,
加内标溶液( 10 g/ mL 原儿茶酸溶液) 100 L, 再
加 0 1 mol/ L 盐酸(含 0 2%亚硫酸氢钠) 100 L,
1 mo l/ L盐酸 100 L, 混匀; 加入 4 mL 醋酸乙酯,涡
流混合 5 min,离心 10 min( 4 000 r / min)取上层有
机相于另一试管中, 40 水浴缓和氮气流下吹干,
残渣加入流动相 100 L,涡旋溶解, 取 20 L 注入
液相色谱仪,记录色谱图。
2 6 方法专属性: 分别取 6只受试犬的空白血浆
( 0 h) 100 L,除不加内标溶液并补加 0 1 mol/ L 盐酸
(含 0 2%亚硫酸氢钠) 100 L,其余按血浆样品的预
处理项下方法操作, HPLC进样 20 L。将丹参素钠
对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中,依同法操
作,进样测定。取受试犬给药后收集的血浆样品,依
同法操作, 进样测定, 结果见图 1。结果表明空白血
浆中的内源性物质不干扰丹参素与内标的测定。
图 1 空白血浆色谱图( A)、空白血浆加入丹参素钠和内标(B)以及犬静脉滴注丹参素钠的血浆( C) HPLC图谱
Fig 1 HPLC Chromatograms of blank plasma ( A) , blank plasma spiked with sodium danshensu and protocatechuic acid
( internal standard) ( B) , and plasma sample after iv administration of sodium danshensu (C)
2 7 工作曲线的绘制:空白血浆 100 L,加入丹参
素钠系列对照品溶液 100 L, 配制成含丹参素钠
0 2、1 0、2 5、10、25、100、250 g/ mL 血浆样品, 每
个质量浓度 3个样本,除不加 100 L 0 1 mol/ L 盐
酸(含 0 2%亚硫酸氢钠)外,其他按照血浆样品的
预处理项下方法操作, 进样 20 L, 记录色谱图。
以血浆中待测物的质量浓度为横坐标, 待测物与内
标物的峰面积之比为纵坐标, 用加权最小二乘法进
行回归运算, 得回归方程 Y = 0 035 27 X +
0 001 54, r> 0998 3。根据工作曲线,本方法的线性
范围为 02~ 250 g/ mL,定量下限为02 g/ mL。
2 8 方法的准确度和精密度:取空白血浆 100 L,
分别取含丹参素钠 0 2、10、100 g/ mL 样品各 6个
样本,按 2. 7项下方法操作,连续测定 3 d,以当日的
工作曲线回归方程计算质量浓度,与配制质量浓度
比较,计算本法的准确度和精密度,结果见表 1。
2 9 提取方法回收率试验: 取空白血浆100L, 按
表 1 准确度和精密度试验结果
Table 1 Precision and accuracy test
质量浓度
/ ( g mL- 1 )
测定质量浓度
/ ( g mL- 1 )
日内
RSD/ %
日间
RSD/ %
准确度 RE
/ %
0 2 0 21 0 01 4 5 9 1 4 50
10 9 8 0 44 3 5 8 7 - 1 98
100 100 3 3 32 3 1 4 5 0 29
标准曲线的绘制项下方法操作, 分别取含丹参素
钠 1 0、10、100 g/ mL 样品各 6份,进样测定, 记录
被测物的峰面积, 与未经处理的相同质量浓度的对
照品溶液峰面积比较, 计算得提取回收率分别为
84 9%、78 7%、77 5%。内标物经相同提取过程处
理,其回收率为 88 7%。
2 10 稳定性试验: 取空白血浆 100 L,分别取含丹
参素钠 1 0、10、100 g/ mL 样品各 6份,按标准曲线
的绘制项下方法操作,即时测定质量浓度,室温放置
22 h后,重复测定 1次,并以当日的工作曲线计算质
量浓度,计算测定值与加入值之间的平均相对偏差,
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分别是 2 4%、- 0 7%、- 2 3%。表明血浆样品经过
处理后室温放置22 h,待测物仍可被准确测定。血浆
样品在冷冻-融溶循环3次试验中, 3个质量浓度的相
对偏差分别为1 0%、2 1%、4 1%。
2 11 数据处理:采用 DAS2 0药动学软件,对犬体
内的动力学过程进行房室模拟并计算药动学参数,
结果见图 2。
图 2 犬静脉点滴不同剂量丹参素的平均血药浓度-
时间曲线( n= 6)
Fig 2 Mean plasma concentration-time curves
after iv sodium danshensu in dogs ( n= 6)
犬分别静脉给 10、20、40 mg / kg 丹参素钠,
AUC0-t、AUC0- 、Cmax 均与给药剂量呈线性相关。
AUC0-t和 AU C0- 的相关系数为 0 964 和 0 964
( P< 0 001)。Cmax 的相关系数为 0 934 7 ( P <
0 05)。丹参素钠在犬体内的药动学过程符合二室
模型,其主要药动学参数见表 2。
表 2 犬静脉点滴丹参素的药动学参数(n= 6)
Table 2 Pharmacokinetic parameters af ter iv administration
of sodium danshensu in dogs (n= 6)
参数 单 位 剂量/ ( mg kg- 1)
10 20 40
t1/2 h 0 12 0 12 0 19 0 10 0 11 0 14
t1/2 h 0 52 0 26 0 87 0 39 0 57 0 21
K 10 h- 1 10 09 16 39 2 12 0 32 4 13 2 18
K 12 h- 1 35 71 73 87 3 49 6 1738 81 70 74
K 21 h- 1 4 21 3 19 2 90 3 88 7 85 8 83
CL L h- 1 kg- 1 0 95 0 12 0 92 0 24 0 91 1 23
AU C0-t h g mL- 1 9 96 1 29 21 39 4 12 41 49 5 29
AU C0- h g mL- 1 10 68 1 34 22 74 4 42 44 56 5 99
V c L kg- 1 0 28 1 18 0 44 0 11 0 32 0 24
3 讨论
本实验曾选用乙睛、甲醇等沉淀蛋白,结果由于
丹参素极性大,保留时间短, 内源性杂质干扰大, 灵
敏度达不到分析的要求;采用醋酸乙酯进行液-液萃
取,在酸性条件下,游离的丹参素容易被醋酸乙酯提
取,且回收率高,重现性好, 内源性杂质干扰小。采
用结构和极性相近的原儿茶酸做内标, 保留时间比
对羟基苯甲酸短, 可以加快样品分析速度。
丹参素和原儿茶酸结构中含有邻二酚羟基, 易
被氧化成苯醌而变色, 水溶液不稳定。经试验, 用
0 1 mol/ L 盐酸(含 0 2%亚硫酸氢钠)配制对照品
溶液,室温下放置两周,两成分的量及溶液颜色基本
不变。
由药动学参数消除半衰期 t 1/ 2> t 1/ 2,表明丹参
素钠在体内主要以消除为主, 并且消除较快。这与
高晔等[ 6, 7] 的研究结果相一致。而洪馨[ 8] 和王娟[ 9]
的研究结果为丹参素在大鼠体内的药动学过程符合
二室模型,以消除相为主, 以上结果有一定差异, 其
原因一方面可能为实验对象存在种属差异,另一方
面也可能是所给药物形式不同, 不排除其他成分对
丹参素体内过程存在影响的可能。
参考文献:
[ 1] 杨春欣 丹参素的药理研究进展 [ J] 中国药理学通报, 1997,
13( 4) : 298- 301
[ 2] 张 婷, 王超云, 田京伟, 等 丹参素对脑损伤的保护作用
[ J] 中草药, 2005, 36( 7) : 1041-1043
[ 3] 刘 琦,晁若冰 尿中丹参素的测定及其在人体的药代动力学
[ J] 药学学报, 2003, 38( 10) : 771-774
[ 4] 潘桂湘,张伯礼,高秀梅 大鼠灌服复方丹参方后血清中丹参
素的测定 [ J ] 中国中药杂志, 2003, 27( 6) : 562-565
[ 5] 赵新峰,祝忠民,刘爱芳,等 柱切换法在复方丹参滴丸中丹参
素药代动力学研究中的应用 [ J ] 中成药, 2004, 26( 6 ) : 490-
492
[ 6] 高 晔,刘长义,林 阳 益脉灵注射液在兔体内的药代动力
学研究 [ J ] 中国中医药科技, 1995, 2( 3) : 28-29
[ 7] Zhao F Q, Zh eng N X, Lsato H , et al Ph armacokinet ics of a
Chin ese t radit ion al medicine danshensu ( 3, 4- dihydroxy-l phe-
nylact ic acid) in rabbit s using high-performance l iqu id chroma-
tography [ J] Bicl Pharm Bul l , 1997, 20( 3) : 285-287
[ 8] 洪 馨,宓穗卿,王宁生 复方丹参滴丸中丹参素的药代动力
学研究 [ J ] 中国新药与临床药理, 2000, 11 ( 5) : 286-288
[ 9] 王 娟,马张庆,宋建国 丹参注射液在大鼠体内的药动学研
究 [ J] 中国临床药理学与治疗学, 2003, 8( 2) : 183-185
888 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月