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Preparationandpurificationof oligosaccharide from Radix Rehmanniae

生地黄中低聚糖的提取和纯化研究



全 文 :中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月·1167··
——上j
7 6 5 4 3 2
8 6 4 2 O
6 4 2 0
8 6 4 2 0
d
图2 p-环糊精(A)、异穿心莲内酯(B)、物理混合物(c)
和包合物(D)的核磁共振氢谱
Fig.21H·NMRSpectrogramf}cD(A),lsoandro-
grapholide(B)·physicsmixture(C),and
inclusioncompound(D)
一0.0025、一0.1096。由此说明萘环部分氢原子受
到屏蔽,十氢萘环全部或者部分插入了p环糊精的
疏水空腔中;包合后H一12、H一14、H一15的化学位移
分别向高场发生了移动,△艿分别为一0.0087、
一0.0090、一0.003。说明五元内酯环上的氢原子
受到屏蔽,五元内酯环全部插入了p环糊精的疏水
空腔中。综上可以推断异穿心莲内酯与p环糊精形
成了1。1的包合物,包合产物为包合十氢萘环和五
元内酯环的两种包合物的混合物;经计算机辅助软
件CAChe6.1计算,异穿心莲内酯的五元内酯环和
十氢萘环可以被包合。这也与实际的验证结果相符。
自20世纪初环糊精被分离得到以来,在医药方
面得到了广泛的应用。一些药物制成环糊精包合物
后,溶解度、生物利用度、化学稳定性、刺激性等方面
都得到了明显的改善,因此环糊精作为一种药物辅
料在医药方面有着重要的应用价值。本实验采用微
波辅助饱和水溶液法将异穿心莲内酯做成包合物,
可提高其稳定性,增加了其水溶性,为异穿心莲内酯
在医药方面的应用提供参考。
参考文献:
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生地黄中低聚糖的提取和纯化研究
唐岚1,刘 力,徐德生2
(1.浙江工业大学药学院,浙江杭州 310014,2.上海中医药大学附属曙光医院,上海200021)
摘 要:目的 研究从生地黄中提取分离低聚糖的工艺。方法 以水苏糖的量为指标,采用正交试验优化水提取工
艺,考察了除杂工艺中大孔树脂种类、洗脱液用量及活性炭脱色方法,并采用葡聚糖凝胶柱纯化得到生地黄低聚
糖。结果优选的水提取工艺为:12倍量水,煎煮3次,每次0.5h。水提取液经D—101大孔吸附树脂除杂,0.1%活
性炭脱色3次,SephadexGl5葡聚糖凝胶分离纯化获得生地黄低聚糖部位,其中水苏糖质量分数大于60%。结论
该工艺从生地黄中提取分离低聚糖部位,工艺合理、可行,低聚糖部位收率达药材量的26%。
关键词:生地黄;低聚糖;提取;分离纯化
中圈分类号:R286.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2008)08—1167—05
收稿日期:2007—11一02
基金项目:上海市科委资助项目(05dzl9102)
作者简介:唐岚(1974一),女.广西柳州人,讲师,博士.主要从事中药、天然药活性成分及制剂研究.E—mail:tanglan@zjut.cn
·通讯作者刘力Tell(021)53821650—721Fax:(021)53825761E—mail:1iuli2750@hotmail.com
万方数据
·1168· 中草1|sChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8,El
PreparationndpurificationofoligosaccharidefromRa ixRehmanniae
TANGLanl,LIUi2。XUDe—shen92
(1·CollegeofPharmaceuticalScience,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,China,2.Shuguang
HospitalAffiliatedtOShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China)
Abstract:ObjectiveToop mizethetechniqueofisolatingandextractingoligosaccharidefromRa ix
Rehmanniae.MethodsTheoptimumconditionsforthewaterxtractingechniqueofRadixRehmanniae
werestudiedbyorthogonaltestdesign.Thenthewaterxtractwasisolatedbymacroporousresinandac..
tirecharcoalsuccessively,meanwhilethp tternofmacroporousresins,thevolumeoftheluents,and
thedecolorizingmethodsfactivecharcoalwerestudied.Andthenthe01igosAccharidewasobtainedafter
beingpurifiedbySephadexgelcolumnchromatography.Thecontentofstachyosewasdeterminedby
HPLC.ResultsTheoptimalpreparationprocesswaasfollows:12foldwater,threetim s,0.5hfor
eachtime.ThenthwaterxtractwasisolatedanpurifiedbyD一101macroporousresins,0.1%active
charcoalandSephadexG15columnchromatographyweresuccessivelyusedtOobtaintheoligosaccharide.
Theanalysisofoligosaccharideindicatedi Smainconstituentsarestachyose,rafinose,andmanninotriose,
andthecontentofstachyoseismorethan60%.ConclusionThispreparationtech iqueofextracting
oligosaccharidefromRa ixRehmanniaeiSreasonableandfeasible.Andtheyieldoftheoligosaccharide
fromRadixRehmanniaeachi vesto26%.
Keywords:RadixRehmanniae;oligosaccharide;extraction;isolationandpurification
生地黄清热凉血、养阴生津,其化学成分有100
多种[1],主要成分为苷类、糖类、氨基酸、有机酸、p
谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等,含糖类成分最高,高
达70%[2],以低相对分子质量的糖为主,其中含水
苏糖的量最高。生地黄中含低聚糖的组分具有抑制
大鼠肺间质成纤维细胞I、I型胶原表达的作用[3],
进一步的动物试验表明生地黄的低聚糖部位有明显
抗大肠杆菌脂多糖致大鼠肺部炎症的作用,而水苏
糖对大肠杆菌脂多糖致大鼠肺部炎症也有一定的抑
制作用(另文报道)。本实验采用了水提取,大孔吸附
树脂、活性炭、葡聚糖凝胶联用分离纯化工艺制备生
地黄低聚糖活性部位,以水苏糖的量为评价指标,优
化了提取纯化工艺条件,使生地黄低聚糖得到有效
地富集,提取率较文献报道工艺“3有较大提高。
1实验材料
生地产地:河南,购自上海华宇药业有限公司,
经上海市食品药品检验所吴赵云副主任药师鉴定为
地黄RehmanniaglutinosaLibosch的块茎。
SephadexG15(Amershambiosciences);水苏
糖对照品(批号103k3776,Sigma公司,质量分数为
99%);硅胶G预制板(青岛海洋化工厂);D一101大
孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司);HPDl00
大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司);活性
炭(中国林科院林产化工研究所江苏省溧阳市活性
炭联合化工厂);其他试剂均为分析纯。
AEL一160电子分析天平(日本岛津);LG一5
真空冷冻干燥机(上海离心机械研究所);DL一8A
冷冻离心机(上海离心机械研究所);SBS--100自动
部分收集器(上海青浦沪西仪器厂);Agilentll00高
效液相色谱仪、Agilentll00示差折光检测器(美国
安捷伦公司);ShodexAsahipakNH2P一50色谱柱
(日本昭和电工株式会社)。
2方法与结果
2.1水苏糖的HPLC法测定‘5]
2.1.1色谱条件:ShodexAsahipakNH2P一50(250
mm×4.6mm,5肛m);流动相:乙腈一水(70:30);体
积流量:1.0mL/min;RID检测器。
2.1.2对照品溶液的制备:精密称取水苏糖对照品
19.9mg于2mL量瓶中,加蒸馏水至刻度,配成
9.95mg/mL对照品溶液。
2.1.3线性范围的确定:精密吸取水苏糖对照品溶
液1.5、2.5、5、10,12.5、15pL,注入高效液相仪,测
定峰面积。以进样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐
标,绘制标准曲线,得回归方程Y=8368.2X一
4190.3,r一0.9999,结果表明进样量在24.88~
149.25pg线性关系良好。
2.I.4测定:取相应的进样液,进样测定,以外标一
点法计算水苏糖的量。
2.1.5生地黄中水苏糖的测定:取生地黄适量,制备
供试品溶液,进样,测定,以水苏糖质量占药材量的比
例计,得生地黄中水苏糖的质量分数为29.62%。
2.2生地黄低聚糖成分提取工艺研究
2.2.1因素水平的确定:以生地黄中主要成分水苏
糖的量为评价指标,采用L。(34)正交表进行正交试
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月·1169·
验,对影响水提工艺的主要因素加水量、提取时间、
提取次数进行筛选。因素水平见表1。
表1因素水平
Table1 FactorsandIevels
2.2.2正交试验与结果:取生地黄剪成0.5cm左
右小块,称取9份,每份20g,加水浸泡1h,按表1
中工艺条件提取,滤过,滤液浓缩至每1mL药液含
0.25g生药,4000r/min离心20rain,得上清液。精
密吸取上清液4mL,加于D一101大孔吸附树脂柱,
水洗至Molish反应阴性,收集水洗脱液,减压浓缩
至20mL,经0.45btm微孔滤膜滤过,进样测定,结
果见表2、3。
裹2 L。(34)正交试验结果
Table2 ResultsofL。(3‘)orthogonaitest
试验号 A B C D(误差)水苏糖/%
误差来源 SS f MS F显著性
A
B
C
D(误差)
55.06
7.89
295.79
9.68
27.53 5.69
3.95 0.82
147.9030.56P4.84
Fo.05(Z,Z)=19·00
直观分析发现,3个因素对提取影响的程度为
C(提取次数)最大,其次为B(提取时间),最佳提取
工艺为A。B。C。,即12倍量水,煎煮3次,每次0.5
h。由方差分析可知,C(提取次数)有显著性差异,A
(加水量)虽无显著性差异,但从直观上看,加水量越
大,提取效果之间有一定的差异,为保证提取充分,
仍以12倍水为宜。
2.2.3验证试验:按照确定的工艺进行验证,重复3
次,结果,水苏糖的质量分数平均为27.55%,RSD值
为1.65%,干浸膏得率为65%,RSD值为1.05%。
2.3大孔吸附树脂除杂研究
2.3.1大孔吸附树脂种类筛选:6种大孔吸附树脂
对生地黄水提物中环烯醚萜类成分梓醇的富集效果
以非极性大孔吸附树脂HPDl00、D一101为好[5]。本
研究发现,生地黄水提液经大孔树脂处理后,颜色由
黑褐色变为棕色,由于环烯醚萜类成分被大孔树脂
吸附,因此水洗脱液颜色变浅。本研究中大孔吸附树
脂主要是用于生地黄提取液的脱色及除掉非糖类成
分,因此主要考察HPDloo、D一101大孔吸附树脂对
生地黄中低聚糖类成分是否有吸附作用。
各取等量HPDl00与D—101大孔吸附树脂,装
于30am×1.1cm小柱,各取等量生地总糖溶液
5mL(含水苏糖的质量为252.29mg),加于大孔吸
附树脂柱上,用10倍体积的水洗脱,收集水洗脱液,
减压浓缩至一定体积,经0.45弘m微孔滤膜滤过,
测定其中水苏糖的量,结果HPDl00洗脱液中水苏
糖的洗脱质量为246.55mg,D一101洗脱液中水苏
糖的洗脱质量为248.48mg。可见,总糖溶液上
HPDloo与D一101大孔吸附树脂经水洗脱后,水苏
糖分别为过柱前的97.72%与98.49%,几乎不被树
脂吸附。此外,洗脱液的颜色两者相差不大,提示两
种树脂对色素的吸附效果相当。因此这2种树脂均
可选用。鉴于D一101大孔树脂价廉易得,本研究选
取D一101大孔树脂用于提取液的脱色除杂。
2.3.2洗脱液用量考察:取D—101大孔吸附树脂装
30cm×1.1cm小柱,生地黄提取液4000r/min离
心后,按药材量与树脂量比为1t 12上样[5],取上清
液5mL加于柱上,以水洗脱,按树脂床体积收集水
洗脱液,每体积洗脱液取20pL,用苯酚一硫酸法显
色,于488nm测定吸光度(A),根据吸光度变化判
断生地黄提取液中糖类成分是否洗脱完全,从而确
定洗脱液用量,结果见图1。可见,5倍体积量的水已
基本将糖洗脱干净。
1.5
l

O.5
O
0 2 4 6 8
树脂床体积/BV
图1 D一101树脂柱洗脱液用量比较
Fig.1Comparisonofeluentadded
onD—101resins’column
2.4活性炭脱色研究:生地黄水提液经大孔吸附树
脂处理后,洗脱液呈棕色,为进一步除去有色物质,
万方数据
·1170· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第8期2008年8月
选用活性炭脱色。
2.4.1药液质量浓度对脱色效果的影响:取D一101
大孑L吸附树脂水洗脱液两等份,各500mL,其中一
份70℃以下减压浓缩至原体积的一半,各加入
0.1%活性炭煮沸10min,滤过,重复脱色3次,比
较滤液颜色。结果质量浓度低的脱色液几近无色,质
量浓度高的脱色液仍呈黄棕色,可见药液质量浓度
提高并不有利于活性炭对有色物质的吸附。
2.4.2活性炭用量和脱色次数对脱色效果的影响:
取D一101大孔吸附树脂水洗脱液两等份,各500mL
(水苏糖质量浓度为60mg/mL),一份加入0.3%活
性炭煮沸脱色1次,滤过;另一份加入0.1%活性炭
煮沸脱色,重复脱色3次,比较滤液颜色。结果
0.1%活性炭脱色3次,脱色液几近无色,0.3%活性
炭脱色1次的脱色液呈黄色,可见0.1%活性炭脱
色3次比0.3%活性炭脱色1次效果好。
2.4.3 活性炭脱色对组分的量的影响:取D一101
大孔吸附树脂水洗脱液500mL加入0.1%活性炭
煮沸脱色,重复脱色3次,计算脱色前后水苏糖的质
量,结果脱色前水苏糖的质量为30.0g,脱色后水苏
糖的质量为21.2g。可见,药液经活性炭脱色后,水
苏糖减少了29.33%。
2.5 凝胶柱色谱分离生地低聚糖成分:活性炭脱色
液在70℃以下减压浓缩,冷冻干燥得到浅棕黄色的
生地总糖。取生地总糖加少量蒸馏水溶解,加于
SephadexG15凝胶柱上,用蒸馏水洗脱,流速为
1 mL/min,每5mL收集一管,每管点样于经0.1
mol/LNaH。PO。处理的硅胶G板,展开剂为正丁
醇一吡啶一水(4:4:1),取出,晾干,喷以苯胺一二苯
胺一磷酸溶液(苯胺2mL,二苯胺2g,磷酸20mL,
加丙酮至200mL),105℃加热至斑点显色。各洗脱
液样品经TLC法检测,结果见图2。结合文献报
道r6]可知,样品经SephadexG15凝胶柱分离后,合
并三、四糖部分作为混合低聚糖部位,减压浓缩,冷
冻干燥得类白色结晶状物。
图2各收集管样品的TLC图
Fig.2TLCChromatogramsofsamples
2.6低聚糖部位中水苏糖的测定:精密称取低聚糖
部位50mg3份,用蒸馏水定容于5mL量瓶中,配
成10mg/mL的样品溶液,经0.45弘m微孔滤膜滤
过,注入高效液相色谱仪,测定,计算水苏糖的质量
分数,结果见表4。生地黄水提取物经过大孔树脂、
活性炭、凝胶柱色谱分离纯化后,水苏糖的质量分数
从水提取物中的42%提高到低聚糖部位中的
61.87%,低聚糖部位收率约为药材量的26%。
表4低聚糖部位中水苏糖的测定结果
Table4 Determinationofs achyoseinfraction
OfOligosaccharide
3讨论
采用D一101大孔吸附树脂可以分离生地黄中
环烯醚萜和糖类[5],本实验则利用其除去环烯醚萜
类及其他非极性成分,生地黄水提液经洗脱颜色由
黑褐色变为棕色。可见大孔树脂同时起到了一定的
脱色作用。为防止色素对凝胶柱的污染,大孔树脂水
洗脱液进一步用活性炭脱色,用溶液体积0.1%的
活性炭脱色3次,溶液即透明无色。
低聚糖是由2~10个分子的单糖经脱水而成的
聚合物,其常用的分离方法有活性炭柱色谱分离、凝
胶过滤法。文献报道[4]采用活性炭柱分离地黄中的
低聚糖,但是经本实验表明活性炭柱色谱分离生地
黄低聚糖,由于活性炭对糖的吸附力强,洗脱溶媒用
量非常大,且无法将三、四糖与单双糖有效分离。本
实验采用凝胶过滤法分离生地黄低聚糖,
SephadexGl5分离范围为100~1500,生地黄中低
聚糖已知的有水苏糖、棉子糖、甘露三糖、毛蕊四糖、
毛蕊糖[6’7],相对分子质量均在1000以下,因此选
用SephadexGl5进行分离。曾改用0.1mol/LNaCl
作为洗脱剂,结果与用水洗脱的效果一样,因此选择
用水洗脱。
文献报道[4]采用水提取,阴阳离子交换树脂,以
及活性炭柱色谱分离纯化制备地黄糖低聚糖,最大
收率约为17%,本方法的低聚糖收率为26%,较之
提高了约53%。
参考文献:
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动态罐组式逆流提取虎杖中大黄素的工艺研究
戚毅,蔡铭,谢志鹏,瞿海斌+,程翼宇
(浙江大学中药科学与工程学系,浙江杭州310027)
摘要:目的研究虎杖中大黄素的动态罐组式逆流提取工艺。方法采用正交试验设计.考察了乙醇体积分数、
溶剂用量、单提时间和提取温度对大黄素收率的影响,并比较了该工艺与热回流、渗漉、索氏提取工艺的优劣。结果
动态罐组式逆流提取虎杖中大黄素的最佳工艺参数为:乙醇体积分数70%,乙醇用量10倍量,单提时间35min,提
取温度65℃;该工艺与其他提取工艺相比不仅能保证较高的提取效率,降低提取温度,而且大大节省提取溶剂,降
低后续蒸发浓缩的能耗。结论相比传统中药提取工艺,虎杖动态罐组式逆流提取工艺具有多方面的优势,值得在
中药工业生产中推广应用。
关键词:虎杖,大黄素;动态罐组式逆流提取
中图分类号:R286.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2008)08—1171—03
虎杖是蓼科植物虎杖Polygonumcuspidatum
Sieb.etZucc.的干燥根茎及根,具有祛风利湿,散
瘀定痛等功效。虎杖中的大黄素是其主要药效成分。
目前,虎杖药材的提取工艺主要采用热回流法和渗
漉法,每千克药材的溶剂用量为100L左右,提取时
间达到数十小时,存在溶剂用量大、时间长、温度高
和提取效率低、生产能耗高等缺点。动态罐组式逆流
提取技术(multi—stagecountercurrentextraction)
是一种将动态提取和逆流提取技术相结合的中药提
取新技术,该技术充分利用溶剂与药材之间的有效
成分浓度梯度,逐级将药材中有效成分扩散至起始
浓度相对较低的溶剂中,使有效成分最大限度地溶
出,具有提取温度低、提取效率高、溶剂用量少、后续
浓缩能耗低等优点[1]。目前动态罐组式逆流提取技
术在中药生产中的应用趋于广泛[2~5]。本研究采用
正交试验设计,对虎杖药材中大黄素的动态罐组式
逆流提取工艺参数进行优化。以大黄素收率为优化
目标,考察乙醇体积分数、溶剂用量、阶段提取时间
和提取温度等关键因素对优化目标的影响,获得最
佳工艺参数。并将动态罐组式逆流提取工艺与热回
流提取、渗漉提取和索氏提取工艺进行比较,充分显
现动态罐组式逆流提取工艺在节省溶剂、提高提取
率、提高生产效率等方面的优势。
1仪器与材料
高效液相色谱仪,DAD检测器,SencoW2011恒
温水浴锅(上海申生科技有限公司),ScoutSC6010型
电子天平(梅特勒一托利多常州衡器有限公司)。
虎杖药材由湖南株洲千金药业公司提供,甲醇
为色谱纯,磷酸、氯仿、硫酸钠均为分析纯,乙醇为
95%药用级。
2方法与结果
2.1 因素水平的确定:目前工业生产中虎杖提取一
般采用53%乙醇,因此取53%乙醇作为乙醇体积分
数的中间水平。正交试验的因素和水平安排见表1。
表1因素水平
Table1 Factorsandlevels
2.2动态罐组式逆流提取工艺的正交试验设计:准
确称取虎杖药材9份,各10g,由5个250mL锥形
瓶按动态罐组式逆流提取工艺进行提取。当某一阶
段提取结束时,一部分有效成分从药材转移到溶剂。
收稿日期:2007-11-12
基金项目:浙江省重大科技计划(021103549)
作者简介:戚毅(1981一),男,浙江慈溪人,硕士,主要从事中药制药工程研究。E—mail:qiyi355@zju.edu.cn
*通讯作者瞿海斌Tel:(0671)88208428E—mail:quhb@zju.edu.cn
万方数据
生地黄中低聚糖的提取和纯化研究
作者: 唐岚, 刘力, 徐德生
作者单位: 唐岚(浙江工业大学药学院,浙江杭州,310014), 刘力,徐德生(上海中医药大学附属曙光医
院,上海,200021)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2008,39(8)
被引用次数: 3次

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of Rehmannia glutinosa f.hueichingensis 1971(07)

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1. 陈劼.CHEN Jie 洋根中低聚糖的提取[期刊论文]-安徽农业科学2007,35(27)
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理化性质研究[期刊论文]-食品与发酵工业2008,34(12)
4. 徐鹏.徐德平.Xu Peng.Xu Deping 枸杞低聚糖的分离与结构鉴定[期刊论文]-食品与发酵工业2009,35(6)
5. 汪建明.赵征.王勇志 低聚糖的分离与鉴定[期刊论文]-食品研究与开发2000,21(3)
6. 刘影.杨菁.黄雷.许燕.岳春丽.韦忠民.LIU Ying.YANG Jing.HUANG Lei.XU Yan.YUE Chun-li.WEI Zhong-min
正交实验法优选地黄中梓醇的提取工艺[期刊论文]-时珍国医国药2009,20(1)
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8. 刘海洋.李冀.雷勇 地黄中梓醇的含量测定及其提取分离工艺研究[期刊论文]-中医药信息2010,27(1)

引证文献(3条)
1.马运明.郭建华.田成旺.张铁军 HPLC法测定鲜地黄中梓醇和桃叶珊瑚苷[期刊论文]-中草药 2011(7)
2.董权锋.于荣敏 寡糖研究新进展[期刊论文]-食品与药品 2009(3)
3.董权锋.于荣敏 寡糖研究新进展[期刊论文]-食品与药品 2009(4)


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