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见血封喉内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究
戴文君1 ,张秀环1 ,黄贵修2 ,戴好富1 ,梅文莉1 3
(11 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 ,海南 海口 　571101 ; 21 中国热带农业科学院
环境与植物保护研究所 ,海南 儋州 　571737)
摘 　要 :目的 　分离和鉴定见血封喉 A ntiaris tox icaria 根韧皮部中的内生真菌 ,并检测其抑菌活性。方法 　以金
黄色葡萄球菌 S ta phy lococcus aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 methicillin2resistant S taphy lococcus aureus
(MRSA)和白色念珠菌 Candi da albicans 作为指示菌 ,采用杯碟法对内生真菌发酵上清液进行抑菌试验。结果
从见血封喉根的韧皮部中分离出 6 株内生真菌 ,经形态鉴定分属于聚端孢霉属 ( T richotheci um L K1 ex Fr1 ) 、枝顶
孢霉属 ( A cremoni um L K1 ex Fr1 )和丝核菌属 ( R hizoctonia DC1 ex Fr1 ) 。其中内生真菌 J6 的发酵上清液对 MR2
SA 有抑菌活性 ,抑菌圈直径为 18 mm。结论 　首次对见血封喉内生真菌进行了研究 ,内生真菌 J6 对 MRSA 有明
显的抑菌活性 ,其抑菌活性成分值得进一步研究。
关键词 :见血封喉 ;内生真菌 ;抑菌活性
中图分类号 :R28212 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620955203
Isolation , identif ication , and antimicrobial activity of endophytic f ungi
from Antia ris toxica ria
DA I Wen2jun1 , ZHAN G Xiu2huan1 , HUAN G Gui2xiu2 , DA I Hao2f u1 , M EI Wen2li1
(11 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology , Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences ,
Haikou 571101 , China ; 21 Environment and Plant Protection Institute , Chinese Academy
of Tropical Agricultural Sciences , Danzhou 571737 , China)
Abstract : Objective 　To isolate and identify endop hytic f ungi f rom t he p hloem in t he root of A nti aris
tox icari a and detect t he antimicrobial activity of t hese st rains1 Methods 　S t a p hy lococcus aureus , methicil2
lin2resistant S t a p hy lococcus aureus (MRSA) , and Can di da albicans were selected as indicators1 The anti2
microbial activities of t he fermentation filt rate of endop hytic f ungi were tested by cylinder plate met hod1
Results 　Six endop hytic f ungi were isolated f rom t he p hloem in t he root of A1 tox icari a. These st rains
were morp hologically identified to genus of T richot heci um L K. ex Fr. , A cremoni um L K1 ex Fr1 and R hi2
z octoni a DC1 ex Fr1 The fermentation filt rate of endop hytic f ungus J 6 showed the antimicrobial activity a2
gainst MRSA1 The diameter of inhibition zone was 18 mm1 Conclusion 　It′s the first report about t he en2
dop hytic f ungi f rom A1 tox icari a1 Endop hytic f ungus J 6 exhibit s st rong antimicrobial activity against MR2
SA , it s active component s are of wort h to f urt her st udy1
Key words : A nti aris tox icari a ( Pers1 ) Lesch1 ; endop hytic f ungi ; antimicrobial activity
　　植物内生真菌是指生长于植物的根、茎、叶等组
织和器官内的一类真菌 ,是植物微生态系统中的重
要组成成分 ,在进化过程中与植物宿主建立了和谐
的共生关系 ,其次生代谢产物十分丰富 ,是新化合
·559·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008209218　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :973 计划前期研究专项 (2007CB116306) ;海南省自然科学基金资助项目 (30608) ;海南省自然科学基金指导性项目 (80671)
作者简介 :戴文君 (1984 —) ,女 ,湖北武汉人 ,硕士研究生 ,现主要从事微生物学研究。　
Tel : (0898) 66968572 　E2mail :daishu19842003 @yahoo. com. cn3 通讯作者　梅文莉　Tel : (0898) 66988061 　E2mail :meiwenli @yahoo1com1cn
物、新药源的潜在资源[ 1 ] 。St robel 等[2 ] 认为 ,那些
生长于独特生态环境的植物、有着民族药用历史的
植物、树龄较长或者当地特有的植物往往具有特殊
的内生真菌 ,这些内生真菌的次生代谢产物往往很
特别 ,可用于新药开发。近年来 ,我国药用植物内生
真菌及其活性成分的研究成为了药物开发的热
点[3 ,4 ] 。见血封喉 A nti aris tox icari a ( Pers1 ) Le2
sch1 为桑科见血封喉属植物 ,别名箭毒木、剪刀树、
加布 ,在我国已被列为三级濒危珍稀植物。见血封
喉属植物有 4 个种 3 个变种 ,主要分布于东南亚。
我国仅产 1 种 ,即见血封喉 ,分布于海南、广东、广西
等地。其鲜树汁乳白色 ,有剧毒 ,入药用于催吐、泄
泻、强心 ,还可用作麻醉剂 ;种子也有毒 ,入药解热止
泻 ,用于治疗痢疾[5 ,6 ] 。目前 ,对见血封喉内生真菌
的研究国内外尚未见报道。本课题组对见血封喉内
生真菌进行了分离鉴定及其抑菌活性研究 ,旨在为
进一步研究抑菌活性菌株的活性成分奠定基础。
1 　材料
111 　供试材料 :内生真菌分离自见血封喉健康地上
部分的板状根韧皮部。植物材料于 2007 年 3 月采
自中国热带农业科学院热带植物园 ,由中国热带农
业科学院热带作物品种资源研究所王祝年研究员鉴
定 ,植物标本和菌株保存在中国热带农业科学院热
带生物技术研究所。
112 　培养基 : PDA (马铃薯葡萄糖琼脂培养基) :马
铃薯 200 g ,葡萄糖 20 g ,琼脂 20 g ,定容至 1 L ,p H
值自然 ,121 ℃灭菌 20 min ,第一次分离时在培养基
中加链霉素 (50 U/ mL)抑制细菌生长。
马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB) :马铃薯 200 g ,葡
萄糖 20 g ,定容至 1 L ,p H 值自然 ,121 ℃灭菌 20 min。
NA 培养基 (牛肉膏蛋白胨琼脂) :牛肉膏 3 g ,
蛋白胨 10 g ,NaCl 5 g ,定容至 1 L ,p H714～716 ,
121 ℃灭菌 30 min ;
YPD 培养基 (酵母粉胨葡萄糖琼脂) :葡萄糖 20
g ,胰蛋白胨 20 g ,酵母粉 10 g ,定容至 1 L ,p H 710 ,
121 ℃灭菌 30 min。
113 　指示菌 :耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ( met hi2
cillin2resistant S t a p hy lococcus aureus , MRSA )
A TCC 9551 由英国 Heriot Watt 大学 Grant J Bur2
gess 博士提供 ; 金黄色葡萄球菌 S t a p hy lococcus
aureus A TCC 51650 和白色念珠菌 Candi d a albi2
cans A TCC 10231 均购于海南省药品检验所。
114 　仪器 : SW —40 洁净工作台 (上海博迅实业有
限公司医疗设备厂) ; HV E —50 灭菌锅 (今日仪器
股份有限公司) ;ZD —8802D 摇床 (太仓市华利达实
验设备有限公司) ; H HB 11360 —S 普通培养箱 (上
海跃进医疗器械厂) 。
2 　方法
211 　内生真菌的分离与纯化[7 ] :将刚采集的新鲜见
血封喉的板状根韧皮部用自来水洗净泥土及灰尘 ,
沥干水分。再将材料放进经过紫外线消毒的超净工
作台内 ,切割成 110 cm ×210 cm 小段 ,按常规无菌
操作进行表面消费处理 :75 %乙醇浸泡 3 min →无
菌水冲洗 3 遍 →011 %升汞浸泡 8 min →无菌水冲
洗 3 遍。
将上述处理过的材料经滤纸吸干水分后 ,在无
菌条件下切成 015 cm ×015 cm 的小块 ,放置于新鲜
的 PDA 平板培养基上 ,每个平板放置 4 块 ,28 ℃恒
温培养 3～7 d。待切口边缘长出真菌菌丝 ,及时转
接至新鲜 PDA 培养基上培养 ,采用菌丝顶端纯化
法逐步纯化。同时 ,以消毒后不做切割的材料作为
空白对照 ,同样条件下观察是否有菌长出 ,结果对照
材料周围无任何菌长出 ,证明表面消费彻底。
212 　内生真菌的鉴定 :采用真菌学插片培养方法 ,
对分离获得的见血封喉内生真菌进行显微形态特征
(菌丝、孢子形态等)的观察、分类鉴定。分类检索参
照文献报道[8 ] 。
213 　内生真菌的发酵上清液制备 :将分离得到的菌
株 ,切取黄豆粒大小的菌丝块 ,接种于 PDB 培养基
中。1 L 三角瓶装 400 mL 培养液 ,室温 ,164 r/ min
振荡培养 7 d ,同时以纯培养基作空白对照。无菌条
件下取发酵液 15 mL 于离心管中 ,12 000 r/ min 离
心 30 min 后取上清液 ,用 012μm 微孔滤膜滤过除
菌 , - 20 ℃保存备用。
214 　抑菌活性测定 :采用杯碟法测定样品抑菌活
性。金黄色葡萄球菌和 MRSA 采用 NA 培养基 ,白
色念珠菌采用 YPD 培养基。将金黄色葡萄球菌、
MRSA 和白色念珠菌分别制成一定浓度的菌悬液
(1 ×105～1 ×107 cf u/ mL) ,用棉签将其均匀涂布在
供试无菌培养皿中 ,制成含菌平板 ,然后在每个平板
放入 3 个牛津杯 ,分别取样品 200μL 加入其内 ,同
时以发酵纯培养基作阴性对照。金黄色葡萄球菌和
MRSA 在 37 ℃下恒温培养 ,白色念珠菌在 28 ℃下
恒温培养。24 h 后观察结果 ,测量并记录抑菌圈直
径。每个样品做 3 个重复 ,以抑菌圈直径的平均值
为试验结果。
3 　结果与分析
311 　内生真菌的分离结果 :本实验共分离获得 6 株
·659· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
内生真菌 (J 1～J 6) ,经显微形态观察 ,初步鉴定分别
为聚端孢霉属、枝顶孢霉属和丝核菌属 (表 1) ,其显
微形态特征见图 1。
表 1 　见血封喉根韧皮部内生真菌的种群组成
Table 1 　Distribution of endophytic fungi isolated
from phloem in root of A1 toxica ria
纲 目 科 属 菌株数目 编号
半知菌类 从梗孢目 从梗孢科 聚端孢霉属 3 J3 ,J4 ,J6
枝顶孢霉属 2 J1 ,J2
无孢菌群 丝核菌属 1 J5
图 1 　见血封喉内生真菌显微形态特征
Fig11 　Microscopical morphological characters
of endophytic fungi from A1 toxica ria
312 　内生真菌的抑菌活性 :采用杯碟法对所分离到
的见血封喉内生真菌的发酵上清液进行了 3 种人体
病原菌的抑菌活性试验 ,结果表明内生真菌 J 6 的发
酵上清液对 MRSA 有明显的抑制作用 ,抑菌圈直径
为 18 mm (图 2) 。
4 　讨论
本实验首次从见血封喉的板状根韧皮部中分离
获得 6 株内生真菌 ,经初步鉴定 ,分别为聚端孢霉
属、枝顶孢霉属和丝核菌属 ,此次分离获得的内生真
菌种类和数量均较少。已有报道指出内生真菌之间
存在占位效应 ,一种优势种进入植物内部 ,建立共生
关系 ,往往影响其他菌的进入[9 ] 。本实验在分离见
血封喉内生真菌时 ,曾发现消毒完全的组织块周围
有大量的酵母菌长出 ,由此推测 ,酵母菌大量存在于
图 2 　J6 对 MRSA的抑制作用
Fig12 　Inhibition of J6 on MRSA
宿主体内 ,可能是见血封喉内生真菌种类较少的原
因之一。由于本试验主要针对丝状真菌 ,则未对其
进行分离。
抑菌活性试验结果表明内生真菌 J 6 的发酵上
清液对 MRSA 有明显的抑制作用。J 6 为聚端孢霉
属真菌 ,有报道[10 ]显示该属中有的种作为菌寄生真
菌 ,能有效地抑制病原菌的扩展和危害 ,甚至杀死病
原菌。目前 ,本课题组正在对内生真菌 J 6 的抑菌活
性成分进行研究。
致谢 :本研究在内生真菌的分类鉴定方面得到
了中国医学科学院药用植物研究所邢晓科副研究员
的大力支持和帮助 !
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