全 文 ：中草1IsChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月·851·
异硫氰酸苯酯衍生化一HPLC法测定龟甲中胶原蛋白
骆达1，李惠芬r，李秀兰2，周静1，杜凡1，王 丽1
(1．天津医科大学药学院，天津300070}2．天津医院骨科研究所，天津300211)
摘 要：目的 采用异硫氰酸苯酯衍生化法分析龟甲中胶原蛋白。方法 龟甲中胶原蛋白经酸水解后分解为含有羟
脯氨酸的氨基酸混合物．经异硫氰酸苯酯衍生化后。以0．Imol／L醋酸钠溶液一乙腈(94：6，pH6．5)与乙腈一水(80t
20)为二元流动相，经c。。色谱柱分离．254nm处测定羟脯氨酸。通过测定样品中羟脯氨酸的量来计算样品中胶原蛋
白的量。结果 羟脯氨酸在0．02～0．20mg／mL时与峰面积呈良好的线性关系，回收率为102．0％。结论建立的
龟甲中胶原蛋白的HPLC分析方法分离效果好、准确、快速、干扰少。
关键词：龟甲；羟脯氨酸；异硫氰酸苯酯；胶原蛋白；高效液相色谱
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)06—0851—02
龟甲是乌龟的干燥腹甲，具有滋阴潜阳、益肾强
骨、养血、补心等功能。胶原蛋白是人与动物机体的
主要结构蛋白，也是一种促纤维细胞生长因子，其特
有的低抗原性、可生物降解性、生物吸收性、止血性
能及促进细胞生长等功能Ⅲ，使其越来越多地应用
于皮肤创伤‘2’33与骨折愈合‘41等I临床治疗。羟脯氨酸
是胶原蛋白的特异性氨基酸，其他蛋白中几乎没有，
且比较稳定。本实验采用柱前衍生化法定性、定量分
析了龟甲中的羟脯氨酸，并计算胶原蛋白的量[5]，获
得了满意的结果。
1仪器与材料
美国Waters515型双泵高效液相色谱仪，Mil—
lennium32色谱管理系统；wH一2微型旋涡混合仪
(上海沪西分析仪器有限公司)。
L一羟脯氨酸由Sigma公司提供，其他氨基酸由
天津天安药业股份有限公司提供，质量分数均大于
99％；异硫氰酸苯酯(Fluka)；龟甲购于天津市中药饮
片厂，经天津中医药大学第一附属医院尚英和药师鉴
定为乌龟Chinemysreevesii(Gray)背甲；乙腈、正己
烷为色谱纯，重蒸水自制，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2．1衍生化试剂的配制：取0．3mL异硫氰酸苯酯
置于25mL棕色量瓶中，乙腈定容，质量浓度为
0．1mol／L。摇匀，作为衍生化试剂，每日更换。三乙
胺一乙腈(139：861)作为干燥试剂。
2．2衍生化步骤：精密移取200弘L对照品或供试
品溶液，分置于1．5mL离心管中，依次精密吸取
100弘L干燥试剂和150肛L衍生化试剂，涡旋振荡5
min，静置1h使其充分反应，再于离心管中精密移
入200弘L正己烷，涡旋振荡5min，放置10min，吸
取下层溶液进样。
2．3色谱条件：色谱柱为PhenomenexC18(250mm×
4．6mm，5弘m)；流动相为0．1mol／L醋酸钠溶液一
乙腈(94：6，pH6．5)(A)一乙腈一水(80l 20)(B)，梯
度洗脱：0～3min，6％B，3～6min，16％B，6～7
min，70％B，7～8min，100％B，8min以后，O％B；检
测波长为254nm；柱温为40℃；体积流量
为1mL／min。
2．4供试品溶液的制备：准确称取0．5g100目龟
甲粉末，置150mI。平底烧瓶中，加入6mol／LHCl
20mL，于100℃水解6h，趁热滤过置100mL量瓶
中，残渣用重蒸水反复冲洗，冷却后加重蒸水至刻
度，准确吸取以上溶液10mL，60℃旋转蒸干，后加
入1mL重蒸水，再次旋干，如此反复3次后，用0．1
mol／LHCl转移至10mI．量瓶中，定容，摇匀。0．45
弘m滤膜滤过，作为供试品溶液。
2．5标准曲线的绘制：精密称定一定量L一羟脯氨
酸对照品置于10mL量瓶中，0．02mol／LHCI稀释
定容，配制成lmg／mL对照品储备液备用。精密吸
取羟脯氨酸对照品储备液一定量配制成0．02、
0．05、0．08、0．10、0．12、0．15、0．20mg／mL对照品
系列，各自衍生化后进样5弘L。以羟脯氨酸质量浓
度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，
得回归方程为y一2×107X+17725，r=0．9999，
线性范围0．02～O．20mg／mL。
2．6精密度试验：精密吸取供试品溶液200肛L，衍
生化后连续6次，每次进样5pL，结果羟脯氨酸峰
面积的RSD为1．07％。
收稿日期：2007—10—16
资金项目：天津市科委技术发展计划藿点项目(0236170 1)
作者简介：骆达(1982一)，男．天津市人，天津医科大学药学院硕士研究生，研究方向为药物分析。
*通讯作者李惠芬Tel(022)23529243E—mail：lihuifen@tijmu．edu．cn
万方数据
·852· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第6期2008年6月
2．7重现性试验：取批号20061001样品，平行制备
6份供试品溶液，衍生化后进样5弘L，测定，计算羟
脯氨酸质量分数，结果其RSD为1．12％。
2．8稳定性试验：取供试品溶液200肛L，衍生化后
在室温放置0、2、4、6、8、12h后分别测定，计算得羟
脯氨酸峰面积RSD为1．08％，表明龟甲羟脯氨酸
供试品溶液在12h内稳定性良好。
2．9回收率试验：吸取9份各100肛L供试品溶液，
再各自加入0．08、0．10、0．12mg／mL羟脯氨酸对照
品溶液100扯L，制备供试品溶液，进行测定，计算，
结果平均回收率为102．0％，RSD为2．47％。
2．10其他氨基酸干扰试验：考察了13种常见氨基
酸(门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨
酸、苏氨酸、颉氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙
氨酸、赖氨酸)对羟脯氨酸测定的影响。结果表明其
他氨基酸与羟脯氨酸均成很好的分离，不影响羟脯
氨酸的定性、定量分析，色谱图见图I。
r一——r————r—r———]
0 10 20 30 40
t／min
1一羟脯氨酸
1-hydroxyproline
圈l 龟甲样品(A)和无羟脯氨酸混合氨基酸(B)的
HPLC色谱围
Fig．1HPLCChromatogramofC． eevesii(A)
andmixedaminoacidsreferencesub-
stanceswithouthydroxyproline(B)
2．11龟甲中羟脯氨酸的测定：取4批龟甲样品，每
批分别处理3份，经衍生化后进样测定，并计算龟甲
中羟脯氨酸的质量分数。由于羟脯氨酸在胶原蛋白
中的质量分数为10％‘引，因此可以通过计算得龟甲
中胶原蛋白的量。测定结果见表1，色谱图见图2。
裹l 龟甲中羟脯氨酸的测定结果(n=4)
Table1 Determinationofhydroxypro¨necontent
inC．reevesii(万一4)
3讨论
由于胶原蛋白不溶于冷水，但溶于热水，故有研
究用龟甲水煎液灌胃后的大鼠含药血清，观察其对
骨髓间质于细胞体外增值的影响，结果表明龟甲水
／
0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14
t／rain
1一羟脯氨酸
l—hydroxyproline
圈2羟脯氨酸对照品(A)和龟甲样品(B)的HPLC色谱图
Fig．2HPLCChromatogramofhydroxyproIine
referencesubstance(A)andC．reevesii(B)
煎液的含药血清可促进骨髓间质干细胞的增殖而有
利于细胞DNA的合成[6]，局部种植骨髓问质于细
胞不仅利于皮肤的再生与愈合，对于难治的慢性皮
肤创伤也有很好的疗效，另外骨髓间质干细胞也能
加快骨形成的速度[7]。由此可推断，龟甲中胶原蛋白
是促进皮肤与骨修复愈合的主要药效成分，这与胶原
蛋白可以修复愈合皮肤和骨的l临床疗效是一致的。
胶原蛋白特异氨基酸羟脯氨酸的衍生化方法很
多，一般分为柱前衍生和柱后衍生两类，柱后衍生化
设备一次性投入大，不便于普通实验室应用；柱前衍
生化相对简单，主要包括异硫氰酸苯酯、6一氨基喹啉
一N一(羟基琥珀酰亚胺基)氨基甲酸酯(AQC)、邻苯
二甲醛和丹酰氯4种方法。AQC法要求pH值和洗
脱温度控制必须准确；邻苯二甲醛法只能与伯氨反
应，二级氨不能被同时检测，另外邻苯二甲醛法衍生
化后的邻苯二甲醛一氨基酸稳定性很差；丹酰氯法所
生成的衍生物在紫外光下不稳定，易分解；故本实验
采用异硫氰酸苯酯法衍生化。该法适于普通实验室
分析胶原蛋白，且简单、快速、适用于龟甲胶原蛋白
的分析。
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万方数据
异硫氰酸苯酯衍生化-HPLC法测定龟甲中胶原蛋白
作者： 骆达， 李惠芬， 李秀兰， 周静， 杜凡， 王丽
作者单位： 骆达,李惠芬,周静,杜凡,王丽(天津医科大学药学院,天津,300070)， 李秀兰(天津医院骨科
研究所,天津,300211)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(6)
被引用次数： 4次

参考文献(7条)
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