全 文 ：抑制异质黏附 ,能够降低肝癌 7721 细胞侵袭转移
的能力 ,这可能与下调 V EGF 和 MMP22 的表达有
关 ,但其具体机制仍需进一步研究。
参考文献 :
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菱角提取物诱导 HL260 细胞凋亡的机制探讨
赵文静 ,牛凤兰 3
(吉林大学公共卫生学院 ,吉林 长春 　130021)
摘 　要 :目的 　探讨菱角提取物对人早幼粒细胞性白血病细胞株 HL260 细胞增殖和凋亡的影响及凋亡的分子机
制。方法 　采用 M T T 法检测菱角提取物对 HL260 细胞的增殖抑制作用 ;吖啶橙染色和 DNA 琼脂糖凝胶电泳检
测细胞凋亡 ;流式细胞仪检测细胞凋亡率及线粒体膜电位的变化 ;比色法测定 Caspase23、9 蛋白活性。结果 　菱角
提取物能抑制 HL260 细胞的增殖 ,其作用呈明显的时间和剂量依赖性。菱角提取物可诱导 HL260 细胞凋亡并显
示一定的剂量依赖关系。与对照组比较 ,菱角提取物可明显降低 HL260 细胞线粒体膜电位 ,上调 Caspase23、9 蛋
白活性。结论 　菱角提取物可抑制 HL260 细胞的增殖 ,其机制与降低线粒体膜电位、激活 Caspase23、9 蛋白继而
诱导 HL260 细胞凋亡有关。
关键词 :菱角 ; HL260 细胞 ; 凋亡 ; 线粒体膜电位
中图分类号 :R73317 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2009) 0320437204
　　菱角又称菱、菱实。近年来对菱角的抗肿瘤成
分进行了广泛的研究 ,主要包括多糖、挥发油、酚类
等成分 ,从菱角提取物中分离出抗肿瘤活性成分 3 ,
4 , 52三羟基苯甲酸二聚体[1 ] 。菱角提取物对人早
幼粒细胞性白血病细胞株 HL260 的抑制作用未见
报道 ,为此本实验以 HL260 细胞为研究对象 ,采用
M T T 比色法、DNA 琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术
等方法 ,通过观察菱角提取物对 HL260 细胞凋亡、
线粒体膜电位、Caspase23、9 蛋白活性影响 ,初步探
讨菱角提取物诱导 HL260 细胞凋亡的线粒体途径 ,
为进一步研究菱角在抗肿瘤方面的功效提供一定的
理论基础。
1 　材料与方法
111 　材料 : RPMI 1640 培养基购于 Gibaco 公司 ;
四甲基偶氮唑盐 (M T T) 、罗丹明 123 ( Rh123) 为
Sigma 公司产品 ;Caspase23、9 分光光度法检测试剂
盒购自南京凯基生物有限公司 ;其他化学试剂均为
国产分析纯 ;M K3 型酶标仪 (Labsystem , Helsink ,
芬兰) ; C K—18 倒置荧光显微镜 ( Olymp us , 日
本) ; Epics 流式细胞仪 (Beckman , 美国) 。新鲜菱
角采集于吉林省大安县 ,经吉林农业大学樊绍钵教
授鉴定为东北菱 T ra p a m anshurica Fler . 。
112 　药物提取 :菱角晒干 ,取 500 g 菱皮 ,以 8 倍量
水煎煮 3 h ,定性滤纸滤过 ,保存滤液 ,残渣再重复
煎煮 2 次 ,定性滤纸滤过。将 3 次所得滤液合并 ,减
压滤过 ,浓缩至 600～700 mL ,加 95 % 乙醇 ,调整
·734·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
3 收稿日期 :2008205205
基金项目 :长春市科技攻关项目 (2006319)3 通讯作者　牛凤兰 (1951 —) ,女 ,吉林省长春市人 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向为药食同用植物与健康研究。
E2mail : jluniu @yahoo. com. cn
至乙醇质量分数为 60 % ,醇沉 24 h。将醇沉液滤过
浓缩并水浴蒸干、减压干燥得菱角提取物。HPL C
法测定提取物中主要有效成分没食子酸的量为
0108 %。提取物溶解于磷酸盐缓冲液 ( PBS) 中 ,终
浓度为 10 mg/ mL ,离心上清 ,0122μm 滤膜滤过 ,
即得菱角提取物溶液 ,4 ℃冰箱保存备用。
113 　细胞培养 :人早幼粒细胞性白血病细胞株
HL260 购于中科院上海细胞生物研究所 ,用含 10 %
胎牛血清的 RPMI 1640 培养液 (另加青霉素 100
kU/ L 、链霉素 100 mg/ L) 于 37 ℃、5 % CO2 、饱和
湿度培养箱内培养 ,取对数生长期细胞进行实验。
114 　M T T 法测定菱角提取物对 HL260 细胞的影
响 :接种 HL260 细胞于 96 孔板 ,每孔 2 ×104 个细
胞 (100μL) 。37 ℃、5 % CO2条件下培养 24 h 后 ,
实验组依次加 6125、1215、25、50、100、200μg/ mL
的菱角提取物 ,继续培养 24、48、72 h 后 ,终止培养 ,
对照组只加培养液 ,每个剂量组设 4 个复孔。实验
结束前 4 h ,每孔加入 20μL M T T 溶液 (5 g/ L ) ,
继续孵育 4 h ,终止培养 ,小心吸弃上清液 ,每孔加
入 150μL DMSO ,震荡 10 min ,选择 570 nm 波长 ,
在自动酶联检测仪上测定吸光度 ( A) 值 ,实验重复
3 次 ,并计算其生长抑制率 (CI) 。
CI = (对照组 A 值 - 实验组 A 值) / 对照组 A 值 ×100 %
115 　吖啶橙 (AO) 染色观察 HL260 细胞核 :收集
0、25、50、100μg/ mL 菱角提取物处理 48 h 的各组
细胞 ,PBS 液洗涤 2 遍 ,制成活细胞悬液 ,浓度为
1 ×107 / mL ,取 95μL 细胞悬液 ,加入 5μL 吖啶橙
(011 mg/ mL) 储存液混匀 ,于荧光显微镜下观察 ,
摄片。
116 　HL26 细胞 DNA 提取及琼脂糖凝胶电泳 :收
集 0、25、50、100μg/ mL 菱角提取物处理 48 h 的各
组细胞 ,参考文献的方法[2 ]提取 DNA。取 DNA 样
品在含溴化乙淀 (015 g/ mL) 的 1 % 琼脂糖凝胶恒
压 (40 V) 电泳 1 h。电泳结束后 ,凝胶成像系统观
察 DNA 带型并摄片。
117 　流式细胞术测定 HL260 细胞凋亡率 :收集 0、
25、50、100μg/ mL 菱角提取物处理 48 h 的各组细
胞 , PBS 洗涤 2 次 , 加入预冷的 70 % 乙醇 , 于
- 20 ℃固定 24 h ,离心洗涤后加入 200μL PI 染
液 ,50μL RNA 酶 ,4 ℃避光放置 20 min ,1 500 r/
min 离心 5 min。调整细胞浓度为 1 ×105 ～1 ×
106 / mL ,上流式细胞仪分析 ,激发光源为氩离子激
光 ,激发波长为 488 nm。
118 　HL260 细胞线粒体跨膜电位ΔΨm 的测定[3 ] :
收集 0、25、50、100μg/ mL 菱角提取物处理 48 h 的
各组细胞 1 ×106 个 , PBS 洗涤 2 遍 ,然后与 1010
mg/ mL 的 Rh123 , 37 ℃下共同孵育 30 min ,用
PBS 洗去未结合的染色剂后置流式细胞仪进行
Rh123 荧光强度测定。用其表示线粒体膜电位的
大小。
119 　Caspase23、9 蛋白活性的测定 :收集 0、25、50、
100μg/ mL 菱角提取物处理 48 h 的各组细胞 5 ×
106个 ,严格按照说明书裂解细胞并测定细胞裂解上
清液蛋白浓度 ,调整蛋白浓度为 3 g/ L ,每孔加入 50
μL 含 150μg 蛋白的细胞裂解上清液 ,同时取 50
μL 裂解液作空白对照 ;每孔已配置 2 ×反应缓冲液
(每 50μL 2 ×反应缓冲液加入 015μL D T T) ,最后
加入 5 μL Caspase23、9 的底物 , 37 ℃避光孵育
4 h ,酶标仪 405 nm 测 A 值。
1110 　统计学分析 :实验结果应用统计分析软件
SPSS 1310 处理 ,所有实验结果采用 x ±s 表示 ,组
间比较要用单因素方差分析。
2 　结果
211 　菱角提取物对 HL260 细胞生长的影响 :对照
组 HL260 细胞生长活跃 ,经 6125、1215、25、50、
100、200μg/ mL 的菱角提取物处理 24、48、72 h 后 ,
HL260 细胞生长均不同程度的减慢 ,并呈时间、浓
度依赖性。与对照组比较 ,不同质量浓度菱角提取
物作用 48 h 后 HL260 细胞的生长抑制率在
13192 %～82104 % ,不同浓度、不同时间 HL260 细胞
生长抑制率有显著性差异 ( P < 0105) ,结果见表 1。
表 1 　菱角提取物对 HL260 细胞增殖的影响
( x ±s , n = 4)
Table 1 　Effect of T. manshurica extracts on proliferation
of HL260 cells ( x ±s , n = 4)
菱角提取物/
(μg ·mL - 1)
增殖抑制率/ %
24 h 48 h 72 h
　61 25 413 ±018 918 ±11 3 3 1314 ±212
121 5 916 ±114 2115 ±21 4 3 3 2819 ±311 3 3
251 0 1415 ±117 3217 ±21 8 3 3 4918 ±511 3 3 △
501 0 2017 ±214 4613 ±51 7 3 3 6112 ±617 3 3 △△
1001 0 3418 ±315 5918 ±41 2 3 3 7013 ±712 3 3 △
2001 0 4516 ±218 6415 ±51 8 3 7514 ±617 3 3
　　与细胞培养 24 h 比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01
　　与细胞培养 48 h 比较 : △P < 01 05 　△△P < 01 01
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cell cuture for 24 h
　　△P < 01 05 　△△P < 01 01 vs cell cuture for 48 h
212 　菱角提取物对 HL260 细胞形态的影响 : HL2
60 细胞经吖啶橙染色后 ,荧光显微镜下可见 ,对照
组细胞核呈均染绿色荧光 ,表现为正常细胞的染色
·834· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
特征。菱角提取物 25μg/ mL 作用 48 h 细胞染色
增强 ,荧光更为明亮 ,呈均匀一致的圆状或固缩状结
构。50、100μg/ mL 菱角提取物作用 48 h 后 ,细胞
核固缩为新月状、念珠状 ,表现为晚期凋亡细胞核的
形状和特征 (图 1) 。
213 　HL260 细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳分析 :对照
组和菱角提取物在靠近加样孔处均有一亮带 ,是未
裂解的 DNA 条带 ,菱角提取物 50、100μg/ mL 作
用 48 h 可见典型的 DNA 梯形条带 ,显示凋亡细胞
的典型特征 (图 2) 。
A2对照　B～D225、50、100μg ·mL - 1菱角提取物处理 48 h
A2cont rol group 　B —D2t reated wit h 25 , 50 , and 100μg ·mL - 1 T. manshurica ext ract s for 48 h
图 1 　吖啶橙染色检测 HL260 细胞凋亡
Fig. 1 　Observation by acridine orange fluorescent staining for apoptosis of HL260 cells
图 2 　菱角提取物作用后 HL260 出现 DNA 片段变化
Fig. 2 　DNA Ladder changes of HL260 cells treated
with T. manshurica extracts
214 　流式细胞术检测 HL260 细胞凋亡 :经流式细
胞仪分析 ,不同浓度的菱角提取物作用 48 h 后 ,细
胞 G1期峰前均出现了代表细胞凋亡的亚二倍体峰 ,
在一定浓度范围内随着菱角提取物浓度升高 , HL2
60 细胞凋亡率升高 ,其中 100μg/ mL 菱角提取物
作用 48 h 凋亡率达到 (27156 ±4187) % (表 2) 。
215 　菱角提取物对 HL260 细胞线粒体膜电位的影 表 2 　菱角提取物作用 48 h 后对 HL260 细胞凋亡率的影响 ( x ±s , n = 3)Table 2 　Effect of T. manshurica extracts on apoptosisof HL260 cells after 48 h treatment ( x±s , n = 3)组　别 剂量/ (μg ·mL - 1) 凋亡率/ %对照 　　　- 01 32 ±0118菱角提取物 　　　25 71 54 ±0198 350 161 25 ±3113 3 3100 271 56 ±4187 3 3　　与对照组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group响 :流式细胞仪检测结果见图 3。与对照组比较 ,不同浓度菱角提取物作用 48 h 后线粒体膜电位降低 ,峰值明显左移 ,并呈一定的量效关系。对照组和25、50、100μg/ mL 药物组弱荧光强度细胞比率分别为 (9103 ±0187) %、(54168 ±5138) %、(72135 ±8139) %、(85125 ±1016) % ,药物处理组与对照组比较有显著性差异 ( P < 0105) 。
A2对照　B～D225、50、100μg ·mL - 1菱角提取物处理 48 h
A2cont rol group 　B —D2t reated wit h 25 , 50 , and 100μg ·mL - 1 T. manshurica ext ract s for 48 h
图 3 　流式细胞仪检测 HL260 细胞线粒体膜电位
Fig. 3 　Flow cytometry analysis of mitochondrial membrane potential in HL260 cells
216 　菱角提取物对 Caspase23、9 蛋白活性的影响 :
在菱角提取物作用下 , Caspase23、9 活性比对照组 (01152 ±01015) 和 (01122 ±01017) 增加 ,25、50、100μg/ mL 菱角提取物作用 48 h , A405 值分别为
·934·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
01213 ±01025、01411 ±01054、01289 ±01032 和
01183 ±01015、01281 ±01021、01245 ±01018 ,药物处
理组与对照组比较差异显著 ( P < 0105) ,其中 50μg/
mL 菱角提取物引起 Caspase23、9 的活化程度最高。
3 　讨论
　　菱角是我国南北均有分布的药用植物 ,在民间
广泛用于治疗肝腹水、肝癌等 ,是对肿瘤有治疗和辅
助治疗作用的药物。前期研究表明菱角提取物含有
3 ,4 ,52三羟基苯甲酸在内的多种活性物质 ,对肿瘤
细胞具有较强的抑制作用。本实验表明菱角提取物
能抑制 HL260 细胞增殖 ,并呈量效和时效关系。通
过对 HL260 细胞的形态学观察 ,发现细胞在不同浓
度的菱角提取物作用下表现出一系列凋亡形态特征
变化 ,如细胞核固缩、边缘化、凋亡小体形成等 ,结合
DNA 电泳呈现的典型梯状条带 ,表明菱角提取物
能诱导 HL260 细胞凋亡。通过流式细胞仪定量显
示细胞凋亡率。通过流式细胞仪定量显示细胞凋亡
率 ,菱角提取物在 25、50、100μg/ mL 质量浓度下诱
导 HL260 细胞凋亡呈浓度依赖性 ,凋亡率分别为
(7154 ±0198) %、( 16125 ±3113) % 和 ( 27156 ±
4187) %。
细胞凋亡是由基因调控的细胞主动死亡过程 ,
线粒体依赖性细胞凋亡通路是抗肿瘤药的诱导细胞
凋亡的核心通路[4 ] 。在凋亡诱导信号的作用下 ,线
粒体膜通透性转运通道 ( mitochondrial membrane
permeability t ransition pore , MMP T) 开放 ,或者
线粒体肿胀 ,导致线粒体膜电位下降 ,释放的细胞色
素 C 与凋亡蛋白酶激活因子21 (apoptotic p rotease
activating factor21 , Apaf21) 和 Caspase29 形成复合
体 ,激活 Caspase 级联反应 ,导致细胞凋亡[5 ] 。
Hengart her 等[6 ] 研究认为线粒体膜电位的丧
失是诱导细胞凋亡的重要途径。本研究结果表明 :
菱角提取物作用 HL260 细胞 48 h 后 ,弱荧光细胞
明显增多 ,呈剂量依赖性。100μg/ mL 菱角提取物
作用 48 h 弱荧光细胞比率达到了 ( 85125 ±
1016) % ,提示线粒体功能已经严重受损。Caspase2
9 是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶 ,处于 Caspase
“瀑布式”激活的顶端 ;Caspase23 是细胞凋亡的主要
执行者 ,通过特异性地裂解一套底物而导致细胞凋
亡。实验结果表明 ,不同浓度菱角提取物作用 48
h ,Csapases29、3 蛋白活性显著增加。
综上所述 ,菱角提取物可诱导 HL260 细胞凋
亡 ,其在诱导细胞凋亡过程中细胞线粒体膜电位下
降 ,并激活 Caspase29、3。这些结果表明菱角提取物
可能通过线粒体信号传导通路诱导 HL260 细胞凋
亡。但是 ,由于细胞凋亡是一个多系统参与、多阶段
的复杂生化反应 ,菱角提取物诱导肿瘤细胞凋亡的
机制有待于进一步深入研究。
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藿香正气提取物对腹泻型肠易激综合征大鼠免疫功能的调节作用
李 　丹 ,吕 　妍 ,唐 　方 3
(天津医科大学总医院 中医科 ,天津 　300052)
摘　要 :目的 　研究藿香正气提取物调节腹泻型肠易激综合征 ( IBS) 大鼠免疫功能机制。方法 　30 只 Wistar 大
鼠随机分成 3 组 :对照组、模型组和藿香正气提取物组 ,对照组未作任何处理 ,余两组采用番泻叶水煎剂 ig 给药联
合肢体束缚应激的方法制备 IBS 模型。模型组大鼠给予高压灭菌蒸馏水 ,藿香正气提取物组 ig 给予藿香正气提
取物 ,连续 6 d。通过放免法和酶联免疫吸附法测定各组大鼠 P 物质 ( SP) 、白细胞介素21β( IL21β) 、IL22 的水平。
结果 　模型组大鼠胸腺、脾脏指数、IL22 水平下降 , IL21β、SP 水平显著升高 ,与对照组相比具有统计学差异 ( P <
·044· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
3 收稿日期 :2008211220
作者简介 :李　丹 ,硕士。E2mail : ech012 22 @163. com