全 文 ：较 :取水提液 300 L 浓缩至 50 L 时 ,加等体积 85 %
乙醇沉淀 ,取上清液回收乙醇 ,得水提醇沉浸膏 72
L ,利用高效液相分别测定了超滤前后滤液和水提
沉浸膏中二苯乙烯苷 ,将超滤前后药液和水提醇沉
液浓缩干燥干膏 ,称定质量 ,计算固形物去除率和二
苯乙烯苷转移率 ,结果见表 4。
表 4 　超滤前后有效成分的比较
Table 4 　Comparison on active components
before and after microf iltration
样品 体积/ L 性状
固形物
总量/ kg
固形物去
除率/ %
二苯乙烯
苷总量/ g
二苯乙烯苷
转移率/ %
原药液　　 300 浑浊 41 80 3175
滤过液　　 303 澄清 21 44 5519 2198 791 47
醇沉后浸膏 72 浑浊 21 78 4211 2141 641 30
3 　讨论
　　比较了 3 种孔径氧化铝膜的分离性能 ,孔径为
50 nm 陶瓷膜对制首乌水提液具有较好的分离效
果 ,渗透通量大 ,有效成分转移率比较高。本体系合
适的滤过操作参数为操作压差 018～112 MPa ,滤过
温度 50～60 ℃,膜面流速 310 m/ s
　　微滤过程中 ,药液浓缩到一定程度时 ,一次加入
原药液 10 %的去离子水 ,当微滤液收率达到原药液
的 100 %左右时 ,有效成分保留率达 82 % ,即可结束
微滤。采用强酸、强碱交替清洗的方法 ,膜通量的恢
复率可达到 90 %以上。
　　实验结果表明陶瓷膜超滤与水提醇沉相比 ,除
杂率较相近 ,但二苯乙烯苷的量明显高于水提醇沉
工艺。陶瓷膜超滤精制制何首乌水提液工艺是可行
的 ,其优点为杂质去除比较彻底 ,料液处理简单 ,产
品质量得到保证 ,膜清洗方便 ,并可反复再生。
参考文献 :
[ 1 ] 　黄仲淘1 无机膜技术及其应用[ M ]1 北京 :中国石化出版社 ,
19991
循环高速逆流色谱从曼地亚红豆杉枝叶提取物中分离
紫杉醇和三尖杉宁碱
苏 　静 ,谈 　锋 3 ,谢 　峻 ,冯 　巍 ,陈 　斌
(西南大学生命科学学院 , 三峡库区生态环境教育部重点实验室 , 重庆市三峡库区
植物生态与资源重点实验室 , 重庆 　400715)
摘 　要 :目的 　研究曼地亚红豆杉枝叶提取物中分离紫杉醇及其类似物三尖杉宁碱的方法 ,提高紫杉醇的回收率
及质量分数。方法 　曼地亚红豆杉枝叶提取物先经 Al2 O3 柱纯化后 ,再以正己烷2醋酸乙酯2甲醇2乙醇2水 (5 ∶7 ∶
5 ∶1 ∶615)为溶剂系统 ,利用循环高速逆流色谱分离紫杉醇和三尖杉宁碱。结果 　经循环高速逆流色谱循环一次
后 ,三尖杉宁碱与紫杉醇即达到基线分离 ,紫杉醇质量分数达 9812 %以上 ,回收率 8310 %。结论 　循环 HSCCC 法
为分离紫杉醇和三尖杉宁碱提供了一条简便、快速的方法 ,使制备高质量分数、高回收率的紫杉醇成为可能。
关键词 :曼地亚红豆杉枝叶 ;紫杉醇 ;三尖杉宁碱 ;循环高速逆流色谱
中图分类号 :R28412 ;2R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021569204
Separation of paclitaxel and cephalomanine from extracts in Ta xus media branches and leaves
by recycl ing high2speed counter2current chromatography
SU Jing , TAN Feng , XIE J un , FEN G Wei , CH EN Bin
( Key Laboratory of Eco2environments in Three Gorges Reservoir Region , Minist ry of Education , Key Laboratory
of Plant Ecology and Resources in Three Gorges Reservoir Region , School of Life Science ,
Southwest China University , Chongqing 400715 , China)
Abstract : Objective 　To st udy t he met hod for separating paclitaxel f rom t he ext ract s in T ax us medi a
branches and leaves and cep halomanine , and to increase recovery rate and content of paclitaxel1 Methods
·9651·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2009201227　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家“863”课题资助项目 (2002AA212191)
作者简介 :苏　静 (1985 —) ,女 ,山东济南人 ,在读硕士研究生 ,研究方向为药用植物生物技术与生化工程。
Tel : (023) 68367091 　E2mail : sujing07 @swu1 edu1cn3 通讯作者　谈　锋　Tel : (023) 68252698 　E2mail :tanfeng @swu1edu1cn
The ext ract in T1 medi a branches and leaves was p urified by Al2 O3 firstly1 Then the recycling high2speed
counter2current chromatograp hy ( HSCCC) was used to separate paclitaxel and cep halomanine f rom the
crude sample wit h a solvent system composed of n2hexane2et hyl acetate2met hanol2alcohol2water (5 ∶7 ∶
5 ∶1 ∶615)1 Results 　Paclitaxel and cep halomanine were completely separated by recycling HSCCC prepa2
ration wit h one recycle1 The content of paclitaxel was over 9812 % and the recovery rate was 8013 %1
Conclusion 　The recycling HSCCC provides a convenient and rapid way to separate paclitaxel and cep halo2
manine which could make it possible to p repare paclitaxel with high content and recovery rate1
Key words : branches and leaves of T ax us medi a cv1 Hicksii ; paclitaxel ; cep halomanine ; recycling
high2speed counter2current chromatograp hy
　　紫杉醇是从红豆杉属植物中分离出来的一种具
有独特抗癌机制的天然产物 ,1992 年被美国食品与
药物管理局 ( FDA) 批准作为抗晚期癌症的新药上
市 ,目前已成为当前世界上最热门、最畅销、最紧缺、
最昂贵的广谱抗癌药物[1 ] 。但是紫杉醇在植物体中
量极低而且与多种类似物共存 , 其中三尖杉宁碱与
紫杉醇的区别仅在于 C213 位侧连的不同 (图 1) ,只
有结构上的细微差别使得它们的分离十分困难 ,而
实际应用中对紫杉醇的质量分数要求又很高 ,从而
使紫杉醇及其类似物的分离成为纯化紫杉醇的关
键。高速逆流色谱 ( HSCCC) 是近十几年来发展起
来的新型高效液2液分配技术 ,具有回收率高、制备
量大、操作简便等优点。国内外已有将其应用于紫
杉醇的分离纯化的报道[2 ,3 ] ,取得了一定的成果 ,但
均未能将三尖杉宁碱与紫杉醇完全分开。近年来 ,
多维逆流色谱在类似物的分离方面取得了显著效
果[ 4 ] ,但由于需要两台以上的逆流色谱仪 ,价格较
高 ,未能被广泛应用。循环高速逆流色谱则是简单
的利用一台高速逆流色谱仪通过循环阀将待分离部
分多次泵入主机中进行循环分离 ,提高分离效果的
方法。此法简便、快速 ,国外已有将其应用于类似物
分离的报道[5 ] 。本实验对循环 HSCCC 法分离类似
物进行了探索 ,并利用这种方法成功的分离了紫杉
醇及其类似物三尖杉宁碱。
1 　仪器与材料
　　TB E —300A 型高速逆流色谱仪 (上海同田生
化) ,L C —20AD 型岛津高效液相色谱仪 (日本岛津
公司) 。
　　曼地亚红豆杉枝叶浸膏由本实验室提供 ,含紫
杉醇 1182 %、三尖杉宁 0122 %。紫杉醇对照品 (上
海同田生化 ,质量分数 ≥99 %) ,三尖杉宁碱对照品
(上海融禾医药科技发展有限公司 ,质量分数 ≥
98 %) ,中性氧化铝 (100～200 目 ,广西平果贵成科
技公司) ,高效液相色谱试剂为色谱纯 ,其他试剂均
图 1 　紫杉醇( A)和三尖杉宁碱( B)的结构
Fig11 　Structures of paclitaxel ( A) and cephalomanine ( B)
为分析纯。
2 　方法与结果
211 　紫杉醇和三尖杉宁碱的 H PL C 检测方法
21111 　色谱条件 : Phenomenex L una C18 色谱柱
(150 mm ×416 mm , 5μm) ;流动相 :甲醇2水 (63 ∶
37) ;体积流量 :1 mL/ min ;检测波长 :228 nm ;进样
量 :20μL 。
21112 　标准曲线的制作 :分别称取紫杉醇和三尖杉
宁碱对照品适量 ,甲醇溶解 ,得 1 mg/ mL 母液。依
次稀释成含紫杉醇和三尖杉宁碱各 20、40、60、80、
100μg/ mL 对照品溶液 ,按上述色谱条件检测。以
质量浓度为横坐标 ,峰面积为纵坐标进行线性回归 ,
得回归方程。紫杉醇 : Y = 38 471 X - 20 969 , R2 =
01999 9 ;三尖杉宁碱 : Y = 37 423 X - 5 823 , R2 =
01999 9。
·0751· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
21113 　供试品溶液的制备 :待测样品浓缩干后甲醇
定容 ,过 0122μm 微孔滤膜 ,即得。
21114 　测定 :在完全相同的条件下 ,准确进样与对
照品溶液相同体积的供试品溶液 ,根据待测组分的
信号 ,用回归方程计算样品中紫杉醇和三尖杉宁碱
的质量浓度。
212 　循环 HSCCC 分离纯化粗样品
21211 　粗样品的制备 :将曼地亚红豆杉枝叶浸膏
500 mg 上中性氧化铝柱 (30 cm ×2 cm) ,先用氯仿
和氯仿2甲醇 (9815 ∶115) 各洗一个柱床 (60 mL ) 除
杂 ,再用氯仿2甲醇 (96 ∶4) 洗脱 115 个柱床[ 6 ] ,洗脱
液浓缩烘干得粗样品 ,其中含紫杉醇达到 7197 % ,
回收率为 9411 %。循环 HSCCC 分离三尖杉宁碱和
紫杉醇。
21212 　溶剂系统的选择 : Chiou 等[2 ] 采用正己烷2
醋酸乙酯2甲醇2乙醇2水 (5 ∶7 ∶5 ∶1 ∶615)体系 ,利
用常规 HSCCC法分离紫杉醇和三尖杉宁碱 ,取得了
一定效果 ,但未将两者完全分开。本实验采用同样溶
剂体系 ,利用循环 HSCCC 分离紫杉醇和三尖杉宁
碱。溶剂体系上相作为固定相 ,下相作为流动相。
21213 　上样溶液的制备 :将粗样品 250 mg 用 10
mL 流动相溶解作为上样溶液。
21214 　操作步骤 :以 9 mL/ min 的流速向主机中泵
入固定相 ,待固定相充满管道后 ,打开主机调整转速
为 800 r/ min ,主机正转。当达到设定转速时 ,以 2
mL/ min 的流速泵入流动相。当流动相从主机出口
流出时进样 ,进样量 10 mL ,检测波长 254 nm ,主机
温度控制在 25 ℃。开始出峰时 ,弃前面的杂质峰 ,
待三尖杉宁碱与紫杉醇出峰时 (时间在 110 min
时) ,将 HSCCC 出口的管道与输液泵的流动相入口
管道连接 ,依次将含三尖杉宁碱和紫杉醇的流动相
重新泵入主机 ,待两者的峰出完后 (时间在 170 min
时) ,断开 HSCCC 出口管道与输液泵流动相入口管
道 ,后者插入流动相中。当三尖杉宁碱再次出峰时
(时间在 260 min 时) ,4 mL 收集一管 , H PL C 法检
测每管中紫杉醇和三尖杉宁碱的质量浓度 ,至此即
完成一次循环。见图 2。
　　如果循环一次分离结果不好 ,可采用多次循环
的方法 ,直到待分离物达到基线分离 ,断开连接进行
收集。上述管路变化可以通过一个二位六通低压阀
方便地实现切换。由于上样粗样品中杂质较多 ,循
环后紫杉醇再次出峰时 (时间 310 min 时) 与保留时
间较长的杂质峰峰 A 出现重叠 ,影响了紫杉醇的质
量分数。这种情况可以先将粗样品进行常规 HSC2
图 2 　循环 HSCCC分离纯化粗样品的色谱图
Fig12 　Chromatogram of crude sample by recycling HSCCC
CC制备 ,收集含三尖杉宁碱和紫杉醇的峰 ( 时间
110～170 min) ,浓缩后得两者的混合物 ,再将两者
的混合物进行循环 HSCCC 制备。
213 　循环 HSCCC 分离三尖杉宁碱和紫杉醇的混
合物 :为避免循环后紫杉醇与峰 A 重叠 ,先将粗样
品 250 mg 进行常规 HSCCC 制备 ,收集含三尖杉宁
碱和紫杉醇的峰 ,浓缩烘干 ,得三尖杉宁碱和紫杉醇
的混合物。然后将其用流动相溶解作为上样溶液 ,进
行循环 HSCCC 分离纯化。三尖杉宁碱开始出峰时
(110 min)连接循环 ,峰出完时 (180 min) 断开连接。
循环后三尖杉宁碱再次出峰时 (240 min) ,每 4 mL 收
集一管 ,直接上 HPLC检测每管中三尖杉宁碱和紫杉
醇的质量浓度。循环 HSCCC色谱图见图 3。
图 3 　循环 HSCCC分离紫杉醇和三尖杉宁碱混合物的
色谱图
Fig13 　Chromatogram of mixture of paclitaxel
and cephalomanine by recycling HSCCC
　　可以看出循环一次后三尖杉宁碱和紫杉醇峰的
分离度明显增加 ;其中峰 B 和峰 C 是邻近紫杉醇和
三尖杉宁碱的杂质峰 ,循环后杂质峰 B、C 分别与三
尖杉宁碱和紫杉醇的分离度也增加了 ,进一步纯化
了紫杉醇 ,也得到了三尖杉宁碱的纯品。
214 　循环 HSCCC 分离结果及验证 :采用正己烷2
醋酸乙酯2 甲醇2乙醇2水 (5 ∶7 ∶5 ∶1 ∶615) 体系 ,
利用常规 HSCCC 和循环 HSCCC 分离紫杉醇和三
尖杉宁碱 ,出峰时 4 mL 收集一管 ,所收各管直接上
H PL C 检测 ,见图 4。常规 HSCCC 制备的各管中
·1751·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
紫杉醇和三尖杉宁碱并未达到完全的基线分离。循
环 HSCCC 制备的各管中三尖杉宁碱和紫杉醇达到
基线分离。
图 4 　常规 HSCCC( A)和循环一次后 HSCCC( B)制
备的各管中紫杉醇和三尖杉宁碱
Fig14 　Paclitaxel and cephalomanine content in each
tube prepared by routine HSCCC ( A)
and once recycling HSCCC ( B)
　　利用 H PL C 检测了循环 HSCCC 制备的各管
中三尖杉宁碱和紫杉醇的质量分数 ,按面积归一法
计算 ,见图 5。可见 43～53 管的紫杉醇质量分数在
9812 %以上 ,比 HSCCC 制备前提高了 12 倍以上 ,
回收率达到 8310 %。32～35 管的三尖杉宁碱质量
分数在 9810 %以上 ,回收率为 4316 %。
3 　讨论
　　循环 HSCCC 能有效地分离化学类似物 ,理论
上只要循环的次数足够多 ,十分相似的物质都可以
分开 , 但将质量分数较低的样品直接进行循环
HSCCC时 ,循环后目的产物再次出峰时可能与前
t/ min
图 5 　紫杉醇对照品( A)及循环 HSCCC制备的
紫杉醇样品( B)的 HPLC图谱
Fig15 　HPLC Chromatograms of paclitaxel
reference substance ( A) and sample
prepared by recycling HSCCC ( B)
面保留时间较长的峰重叠。多维逆流色谱由于采用
两台以上的逆流色谱仪 ,可以将目的产物泵入另一台
主机进行分离 ,能有效避免与杂质峰重叠 ;在只有一
台仪器时 ,则可先将粗样品进行一次常规 HSCCC 制
备 ,收集目标产物后再进行循环 HSCCC。
　　常规 HSCCC 纯化紫杉醇时 ,由于紫杉醇与前
面的三尖杉宁碱及后面的杂质峰都不能达到基线分
离 ,只能得到少量高质量分数的紫杉醇 ,回收率低 ;
循环后 ,紫杉醇与三尖杉宁碱及杂质峰很好的分开 ,
提高了回收率及质量分数 ,使制备高回收率、高质量
分数的紫杉醇成为可能。
参考文献 :
[1 ] 　王卫斌1 紫杉醇的研究进展[J ]1林业调查规划 ,2007 ,32 (4) :
402441
[ 2 ] 　Chiou F Y , Kan P , Chu I M , et al1 Separation of Taxol and
cephalomannine by counter current chromatography [J ]1 J L iq
Chromator Relat Technol , 1997 , 20 (1) : 572611
[ 3 ] 　祝顺琴 ,刘万宏 ,谈　锋1 高速逆流色谱法纯化曼地亚红豆杉
枝叶提取物中紫杉醇[J ]1中草药 ,2007 ,38 (10) :1491214921
[ 4 ] 　Yang F Q , Quan J , Zhang , T Y , et al1 Multidimensional
counter2current chromatographic system and it s application
[J ]1 J Chromatogr A , 1998 , 803 : 29823011
[ 5 ] 　Han Q B , Song J Z , Qiao C F , et al1 Preparative separation of
gambogic acid and it s C22 epimer using recycling high2speed
counter2current chromatography [J ]1 J Chromatogr A , 2006 ,
1127 : 29823011
[ 6 ] 　张志强 ,苏志国1 氧化铝层析从云南红豆杉植物中转化提取紫
杉醇 [J ]1天然产物研究与开发 ,2000 ,12 (3) :1251
欢迎订阅 2010 年《药学学报》
《药学学报》(CN :1122163/ R ,ISSN :051324870)是由中国药学会主办、中国医学科学院药物研究所承办、国内外公开发行
的药学综合性学术期刊。辟有栏目 :述评和综述、研究论文、研究简报、学术动态。本刊自 1953 年创刊以来 ,一直报道药学领
域原始性、创新性科研成果 ,旨在促进国内外学术交流。刊登论文内容包括药理学、合成药物化学、天然药物化学、药物分析
学、药剂学、生药学等。
《药学学报》为我国自然科学核心期刊 ,据中国科学引文数据库的数据统计 ,在中国科技核心期刊排行表中 ,《药学学报》
名列前茅 ,在药学类期刊中居首位 ;本刊已被世界主要检索系统收录 ,为我国药学界高水平的学术刊物 ,在国际上享有一定知
名度。
本刊为 112 页 ,月刊 ,大 16 开本。每期定价 30 元 ,全年定价 360 元。国内邮发代码 :22233 ,国外代码 :M105。欢迎广大作
者踊跃投稿 ,欢迎广大读者订阅。可采用的订阅方式如下 :
通过当地邮局 ;通过 E2mail (yxxb @imm. ac. cn)或从网上 (www. yxxb. com. cn)下载订阅单 ,填好后寄至编辑部 ;通过本刊
编辑部 ,联系人 :李淑芬、张晓晔 　电话 :86210263165208 　传真 :86210263026192
编辑部地址 :北京市先农坛街 1 号《药学学报》编辑部 　邮编 :100050
·2751· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月