全 文 ：个产地冬虫夏草的遗传距离大于 011 ,即便是同样来
自于青海或四川的样品。Chen 等[12 ] 认为真菌的 ITS
序列遗传距离大于 0105 则代表不同的种。Chen
等[12 ]基于 ITS12518S2ITS2 序列获得 17 个产地冬虫
夏草的遗传距离为 0～01031 ,这尚不包括变异较大的
环青海湖地区的样品 ,但其变异程度远大于本研究的
21 个冬虫夏草居群 (图 2 ,第Ⅰ支) 。Stensrud 等[14 ] 对
GenBank 中冬虫夏草 rDNA2ITS序列的分析认为类似
于图 2 的 3 个分支均为冬虫夏草的神秘 (系统发育的)
种 ,尽管它们在序列上的差异甚至超越物种科属间的
变化。本研究所测定的冬虫夏草居群分布范围较广 ,
但其 rDNA2ITS 序列的变化并不大。而以往研究获
得的冬虫夏草该序列[12 ,13 ] 及 GenBank 中相关序列所
存在的巨大差异 ,可能并不是实验样品采集地不同所
能解释的。这些有较大变异的 rDNA2ITS 序列大多
是从天然冬虫夏草分离培养后测序获得的 ,与本研究
直接选用冬虫夏草子座不同。冬虫夏草是青藏高原
的特有种 ,在高海拔缺氧低温等极端环境下生长的冬
虫夏草与人工培养的冬虫夏草之间是否存在遗传差
异 ,人工分离培养过程中冬虫夏草是否会产生变异等
问题有待进一步研究。
致谢 :重庆市中药研究院钟国跃研究员、西藏农
牧学院卢杰老师、复旦大学生命科学学院钟扬教授、
浙江农科院计东风研究员、青海省畜牧兽医科学院
徐海峰先生、兰州大学生命科学学院金樑老师为本
研究冬虫夏草样品的收集等提供帮助。
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栀子道地药材遗传关系的 ISSR证据
雷 　栗1 ,3 ,王 　益1 ,赵阿曼1 ,朱培林2 3 ,周世良1①
(11 中国科学院植物研究所 系统与进化植物学国家重点实验室 ,北京 　100093 ; 21 江西省林业科学院 ,
江西 南昌 　330032 ; 31 中国科学院研究生院 ,北京 　100039)
摘 　要 :目的 　分析来自江西省樟树、丰城、新干等 3 个栀子 GA P 基地的样品在 DNA 水平上的差异 ,了解栀子的
遗传变异及其相互关系 ,为栀子育种提供参考。方法 　采用 ISSR 分子标记技术结合实地考察。结果 　10 个 ISSR
引物共扩增出 58 个位点 ,其中 32 个位点为多态位点 ,多态位点百分率 ( P PB) 值为 55117 %。Nei′s 遗传多样性指
数变化范围在 01005～01167 ,Shannon 信息指数 ( I)变化范围在 01008～01254。居群内变异占总变异的 75112 % ,
居群间变异占总变异的 24188 %。用 NJ 法建立聚类图大体上可以将栀子样品分为两组 :第一组由樟树的样品组
成 ,而第二组主要由新干和丰城的样品组成 ,内含樟树的个别样品。结论 　来自同一个地方的样品 ,遗传距离比较
近 ,遗传上比较相似 ,说明栀子种源基本上来自当地。ISSR 分子标记大体上可以将不同地方的栀子分开。产于樟
树的栀子遗传多样性最高 ,可能种源相对比较广。丰城和新干的样品地理距离比较远 ,但是遗传距离却比较近 ,可
·611· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008206216
基金项目 :江西省财政林业重大专项 (2006510105) :“森林中药 GAP 种植技术研究”
作者简介 :雷　栗 (1983 —) ,女 ,云南昭通人 ,中国科学院植物研究所在读硕士研究生 ,主要从事植物系统学及居群生物学研究。3 通讯作者　朱培林　Tel : (0791) 3833803 　E2mail :yczpl @126. com
能是各地之间存在相互引种现象。有少数樟树的样品在遗传上更接近丰城或新干的样品 ,除了种源交流外 ,在种
下水平平行遗传突变也可能导致这种结果。
关键词 :栀子 ; ISSR ;药材道地性 ;遗传多样性
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120116205
Genetic relationship of Ga rdenia j asminoides among plantations revealed by ISSR
L EI Li1 ,3 , WAN G Yi1 , ZHAO A2man1 , ZHU Pei2lin2 , ZHOU Shi2liang1
(11 State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany , Institute of Botany , Chinese Academy of Sciences ,
Beijing 100093 , China ; 21Jiangxi Academy of Forest ry Sciences , Nanchang 330032 , China ;
31 Graduate School , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100039 , China)
Abstract : Objective 　To evaluate t he genetic differences and mutual relationship of Gardeni a j asmi2
noi des at DNA level among Zhangshu , Fengcheng , and Xingan GA P plantations in Jiangxi Province , so as
to p rovide reference for G1 j asmi noi des breeding1 Methods 　Genetic variations were revealed by inter2sim2
ple sequence repeat s ( ISSR) markers1 Results 　Ten ISSR primers generated 58 loci of which 32 loci were
polymorp hic1 The average percentage of polymorp hic bands ( P PB) is 55117 %1 The range of Nei′s genetic
diversity is 01005 —01167 , and t he range of Shannon information index ( Ⅰ) is 01008 —012541 The varia2
tions wit hin pop ulations account for 75112 % and among them for 24188 % of t he total1 The NJ dendro2
gram showed two basic clusters1 One consist s of t he samples f rom Zhangshu , and the ot her mainly consist s
of t he samples f rom Xingan and Fengcheng with very few samples f rom Zhangshu1 Conclusion 　Zhangshu
pop ulation has the highest genetic diversity , while Fengcheng has t he lowest genetic diversity , possibly
because of very few samples assayed1 The samples f rom t he same pop ulation are more similar t han t hose
f rom different pop ulations , indicating t hat ISSR makers have the power to t race t he origin of samples1 The
geograp hical distance between Fengcheng and Xingan is fart her but t he genetic distance between t hem is
shorter1 This is quite possibly because of inter2int roduction between t hem , and some exceptions of a few
samples f rom Zhangshu clustered wit h samples f rom Fengcheng might be because of parallel mutations
which are common below specific level1
Key words : Gardenia j asminoi de Eills ; inter2simple sequence repeats ( ISSR) ; geoherbalism genetic diversity
　　栀子 Gardeni a j asmi noi des Eills 是茜草科
( Rubiaceae)栀子属常绿灌木 ,又名山栀子、黄栀子、
黄枝子等[1 ] ,是《中国药典》2005 年版一部中规定的
栀子药材原植物[2 ] 。栀子以干燥成熟果实入药 ,其
有效成分有去羟栀子苷、栀子苷、黄酮类栀子素、山
栀苷等[1 ] 。栀子的商品药材约有 10 个品种 ,在我国
广泛种植 ,以江西、湖南两省种植面积最大 ,质量最
好[1 ] 。江西省是道地栀子的主产区 ,生产历史悠久。
江西省樟树市、丰城市、新干县等出产的栀子因皮
薄、色红、饱满、品质优良而被称为“小红栀”,畅销全
国各地 ,出口东南亚等地[3 ] 。不同产地的同种药材
由于多种因素的影响 ,药用成分的种类、质量分数存
在差别[4 ] ,从而导致药效的差异。因此 ,道地药材的
使用就显得十分必要。
道地药材与非道地药材药性的差异 ,归根结底是
药材遗传组成的不同 ,生长地点的气候、土壤、地形、
生物等环境因素能加大遗传因素与环境因素的相互
作用。因此 ,鉴别不同药材的遗传差异能更好地理解
药性的差别。传统上 ,药材的质量和道地性常通过形
态特征加以鉴别。随着分子生物技术在药材鉴别方
面的应用 ,DNA 分析在药材道地性鉴别方面就显现
出稳定可靠的突出优势[5 ] 。基于 PCR 技术的简单序
列重复区间 ( Inter2simple sequence repeats , ISSR) 在
众多的分子标记中具有重复性高、多态性丰富、操作
简单、成本低等优点[6 ,7 ] ,其在正品龙胆、怀地黄、石
斛、江枳壳和人参等的亲缘关系、品种鉴定、品种内的
遗传变异等方面的研究中得到成功运用[6～12 ] 。
目前对栀子的化学成分、药理作用等方面有较
多的研究[3 ,13～15 ] ,而栀子药材遗传差异的研究显得
相当薄弱 ,从而影响栀子新品种的选育。本研究采
用 ISSR 技术分析来自江西省樟树、丰城、新干等 3
个栀子 GA P 种植示范基地的样品在 DNA 水平上
的差异 ,旨在初步了解栀子的遗传变异以及这些材
料之间相互关系 ,为栀子育种提供参考。
·711·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
1 　材料与方法
111 　材料 :样品来自江西省樟树市吴城乡、丰城市
隍城镇、新干县金川镇 (表 1) 的栀子 GA P 研究与示
范基地 ,由朱培林研究员鉴定共 50 个样品。样品来
源 :樟树市吴城乡 27 个 ,样品编号 Z01～Z27 ;丰城
市隍城镇 3 个 ,样品编号 F01～F03 ;新干县金川镇
20 个 ,样品编号 X01～X20。新鲜叶片硅胶干燥后
备提取 DNA。
表 1 　3 个产地的地理及气候因子
Table 1 　Factors about geography and
climate in three habitats
产地 北　　纬 东 　　经 年均温/ ℃
降水量
/ mm
年日照
时数/ h
无霜期
/ d
丰城 27°42′～28°25′ 115°25′～116°27′ 1713 1 550 1 93517 274
樟树 115°06′～115°4′ 27°49′～28°09′ 1716 1 545 1 89817 275
新干 27°30′～27°58′ 115°14′～115°44′ 1717 　1 59418 1 62514 275
112 　基因组 DNA 的提取与 ISSR2PCR 反应 :基因
组 DNA 的提取参考 Doyle 等[16 ] 的 CTAB 法做适
当改良 ,增加去除多糖和多酚的步骤 ,并添加抗氧化
剂巯基乙醇。提取的 DNA 用 Promega 基因组
DNA 纯化试剂盒纯化 ,然后用 110 %琼脂糖凝胶电
泳检测 ,将 DNA 质量浓度调整为 5 ng/μL 。
ISSR 引物是根据哥伦比亚大学提供的序列 ,在
上海生工有限公司随即合成了 45 个引物 ,随机选取 3
个产地各一个样品进行预实验 ,从 45 个 ISSR 引物序
列中筛选出能够扩增出清晰条带、反应稳定的 10 个
引物 (表 2) ,对所有的材料进行 ISSR2PCR 反应扩增。
PCR 反应总体积 25μL ,其混合物成分为 115 mmol/ L
MgCl2 ,012 mmol/ L dN TP ,8 %DMSO ,014μmol/ L 引
物 ,10 ×PCR Buffer ,1 单位 r Taq DNA 聚合酶 ,25 ng
模板 DNA。PCR 扩增程序为 94 ℃预变性 2 min ,接
着 35 个循环的 94 ℃45 s ,46 ℃,40 s ,72 ℃2 min ,最
后 72 ℃延伸 10 min。PCR 产物用 115 %的含 015 %
EB 的进口 ( Promega) 琼脂糖胶 ,015 ×TBE 缓冲液 ,
120 V 恒压电泳 3 h。用 100 bp 的 DNA ladder
(MD109201 ,北京天为时代科技有限公司) 为相对分
子质量标记。Gel2document 2000 凝胶成像系统 (BIO2
RAD 公司)成像记录。
113 　数据统计与分析 : ISSR 通常为显性标记 ,电泳
迁移率相同的条带被认为是同源条带 ,属于同一位
点。按电泳条带有 (1) 、无 (0) 记录 ,构成数据矩阵。
用 Popgene11311 软件计算遗传多样性参数和相似性
参数[15 ] 。用 Winamova 软件[17 ] 计算出居群间的方
差组分 V ( A ) 和居群内的方差组分 V ( B ) ;
用 PAUP410[18 ] 计算出 Nei2Li[19 ] 距离 , 然后再用
表 2 　ISSR引物序列及其位点数与多态性
Table 2 　Sequences of ISSR primers used
and their loci and polymorphism
序号 引物名称 序列 位点数目 多态位点 多态位点百分率/ %
1 ISSR215 GGA2( GTG) 4 　5 　1 20
2 ISSR218 (AC) 72T 6 4 661 67
3 ISSR219 GC2(AC) 7 9 3 331 33
4 ISSR224 ( GT) 72CC 10 8 80
5 ISSR241 (CA) 72A G 5 2 40
6 ISSR243 (CA) 7 72GT 5 5 100
7 ISSR244 (CT) 82AC 2 2 100
8 ISSR245 (CT) 82GC 5 3 60
9 ISSR2S ( GA G) 42R 3 C 5 1 20
10 ISSR2T ( GT G) 42R 3 C 6 3 50
平均 51 8 31 2 57
　　R 3 为 A 或 G
R 3 is A or G
MEGA310[20 ]进行 Neighbou2Joining(NJ)的聚类分析。
2 　结果
211 　栀子的遗传多样性 :10 个 ISSR 引物对所有的
样品均扩增出清晰的条带 (图 1) ,共扩增出 58 个位
点 ,平均每个引物扩增出 518 个位点 ,DNA 片段的
大小在 300～1 800 bp 。其中 ,32 个位点为多态位
点 ,多态位点百分率 ( P PB)值为 55117 % ,每个引物
平均获得 312 个多态条带 (表 2) 。其中樟树市吴城
乡的样品共有 58 个位点 ,多态性位点有 31 个 ,多态
位点百分率为 53145 % ;丰城的样品共有 58 个位
点 ,只有 1 个多态性位点 , 多态位点百分率为
1172 % ;新干的样品总位点数 58 个 ,其中 8 个多态
性位点 ,多态位点百分率为 13179 %。Nei′s 多样性
指数 (Nei′s genetic diversity) 变化范围在 01005～
01167 ,平均值为 01068 ; shannon 信息指数 ( Shan2
non′s Information index ) 变化范围在 01008 ～
01254 ,平均值为 01105 (表 3) 。
图 1 　部分来自樟树( Z01～Z21) 、丰城样品( F01、F02)的
ISSR218 电泳图
Fig. 1 　ISSR218 Electrophoregram among
samples from Zhangshu ( Z01 —Z21)
and Fengcheng ( F01 —F02)
·811· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
表 3 　3 个道地产区的栀子遗传多样性参数
Table 3 　Genetic diversity of G1 j asminoides
from three habitats
产地 位点总数
多态性
位点数
多态位点
比率/ %
Nei′s 多样
性指数
Shannon′s
信息指数
樟树 58 31 531 45 01 167 01 254
丰城 58 1 11 72 01 005 01 009
新干 58 8 131 79 01 032 01 053
总体 58 32 551 17 01 147 01 233
　　合计的各项指标是把樟树、丰城、新干 3 地的样本合在一起当作一个居群
来计算的
Each index is calculated by putting samples f rom Zhangshu , Fengcheng ,
and Xingan together as one population
212 　不同产地栀子材料的相互关系 :从 50 个样品
的 NJ 聚类图 (图 2) 中可以看出 ,来自樟树、丰城和
新干的栀子样品大体上可以分为两组。第一组由樟
树的样品组成 ,而第二组主要由新干的样品和丰城
的样品组成 ,内含樟树的个别样品。
　　●新干的样品　■丰城的样品　◆樟树的样品
　　●Xingan 　■Fengcheng 　◆Zhangshu
图 2 　栀子样品之间相互关系的 NJ 聚类图
Fig. 2 　NJ Dendrogram among samples of G1 j asminoides
3 　讨论
311 　栀子的遗传多样性 :从多态性位点百分率、
Nei′s 多样性指数、Shannon 信息指数可以看出 ,大
于总体水平的只有樟树的样品 ,说明该地的栀子遗
传多样性最高 ,遗传变异比其他两地更为丰富。樟
树的样品 ,在 58 个位点中 ,多态性位点有 31 个 ,多
态位点百分率为 53145 % , Nei′s 多样性指数为
01167 ,Shannon 信息指数为 01254 ,在 3 个产地中
均居于最高水平。这可能与种植的栀子种源丰富有
关。相对而言 ,3 个栀子 GA P 种植点 ,以樟树种植
面积最大 ,一方面取样范围因此也大 ;另一方面 ,据
了解其种植苗木来源系从永丰县专业育苗户调入 ,
种源可能更复杂 ,因而多样性较大 ;丰城与新干种植
点面积均较小 ,取样范围比樟树更窄 ,同时此两地种
植用苗均源于当地育苗 ,由于所育苗数量较少 ,种源
范围也可能更小 ,故多样性较小。来自丰城的样品
遗传多样性最低 ,在 58 个位点中 ,多态性位点只有
1 个 ,多态位点百分率为 1172 % ,Nei′s 多样性指数
为 01005 ,Shannon 信息指数为 01009 ,一方面可能
是因为取样地丰城县隍城镇位于湖区 ,地势平坦 ,小
气候单一 ;另一方面可能是由于取样不够 ,所以来自
丰城的样品的遗传多样性还有待进一步的研究。
312 　用 ISSR 分子标记鉴定栀子的道地性 :不同产
地的栀子质量差别较大。赵祥军等[ 21 ] 研究了湖南
长沙、广西南充等 9 个不同产地的栀子 ,其栀子苷质
量分数不同 ,也即栀子的质量不同。所以 ,鉴别栀子
的道地性很有必要。要鉴定药材的道地性可凭形态
学性状或经验 ,辅之以分子生物学手段。这样能更
准确鉴定其道地性 ,消除品种混杂等问题。
目前 ,已经有人对中草药的道地性作了 ISSR
鉴定。罗群等[22 ]用 8 条 ISSR 引物建立了 10 个川
乌居群的 DNA 指纹图谱 ,准确、高效地鉴别了 10
个川乌居群 ;周延清等[23 ] 用一个 ISSR 引物建立了
10 个怀地黄样品的 DNA 指纹图谱并且能将其彼此
区分出来。但用分子标记的手段来鉴定栀子道地性
的研究目前尚未见有报道。本研究对来自不同产地
的栀子进行了 ISSR 分析 ,揭示了不同产地栀子的
遗传关系。从聚类图可以看出 ,来自樟树、丰城和新
干的栀子样品聚为两组。大体上 ,樟树的样品聚为
一支 ,而新干和丰城的样品又聚为另一支 ,来自丰城
的所有样品再聚在一个小支上 ,表明了来自同一个
地方的样品 ,遗传距离也比较近 ,遗传上比较相似。
因此 , ISSR分子标记可以将不同地方的栀子大致分
开。然而 ,聚类结果也有一些例外的地方。丰城的
样品虽然聚为一个小支 ,但是却在新干样品的大支
内 ,表明虽然丰城和新干地理距离比较远 ,但是样品
之间的遗传距离却非常近。这有两种可能 ,一种是
两地通过引种等交流种源 ,因此种源一样 ;另一种可
·911·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
能是两地的生境相似 ,均为平原湖区 ,气候单一 ,自
然选择导致适应相同自然环境的基因型保存下来 ,
从而使两地样品具有很高的遗传相似性。另外有少
数樟树的样品 ( Z24～Z27) 和丰城的样品聚在一个
大支上 ,说明物种内部不同居群的遗传分化并不很
大 ,不可能像具有很长生殖隔离历史的物种之间那
样毫不含糊地区分每一个个体 ,这也是分子标记分
析常用居群的基因频率而非个体作为分析单元的原
因。这类问题可通过增加位点数目得到解决。
可见 ,基于栀子的 ISSR 遗传多态性的聚类分
析结果与栀子产区的地理分布比较吻合 ,这为从分
子生物学角度研究栀子的道地性提供了新的启示。
可以说药材的道地性不仅仅是一个地理上的概念 ,
同时也具有丰富的遗传特质。而作为现代分子生物
学的重要手段 , ISSR 分子标记技术对揭示道地药材
与非道地药材之间的地理2生态2遗传的差异是一种
有效的手段。
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粗茎秦艽药材 HPLC指纹图谱研究
王妍妍1 ,赵志礼1 3 ,吴靳荣1 ,王峥涛2①
(11 上海中医药大学 生药学教研室 ,上海 　201203 ; 21 上海中医药大学中药研究所 ,上海 　201203)
摘 　要 :目的 　建立粗茎秦艽药材的 HPLC 指纹图谱 ,为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法 　以龙
胆苦苷为内参照物 ,分析 13 批粗茎秦艽药材的 HPLC 色谱行为 ,并进行相似度计算 ,色谱条件 :Ultimate XB2C18柱
(250 mm ×416 mm , 5μm) ,乙腈20105 %磷酸水梯度洗脱 ,体积流量 110 mL/ min ,柱温 25 ℃,检测波长 240 nm。
结果 　标定了 10 个共有峰 ,建立了 HPLC 指纹图谱 ,该图谱相关系数均在 0198～110。结论 　该方法准确可靠 ,重
现性好 ,可为控制粗茎秦艽药材内在质量提供科学依据。
关键词 :粗茎秦艽 ;指纹图谱 ;高效液相色谱法
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120120204
·021· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008206229
基金项目 :上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金资助项目 (2006A214)
作者简介 :王妍妍 (1983 —) ,女 ,硕士 ,研究方向为中药质量评价。　E2mail :wyyan830406 @126. com3 通讯作者　赵志礼　Tel : (021) 51322202 　E2mail :zhilzhao @sohu. com