全 文 ：·药材与资源·
三角叶黄连 ISSR反应体系的建立与优化
张春平 ,何 　平 3 ,王瑞波 ,高 　姗 ,张益锋 3
(西南大学生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室 ,重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室 ,重庆 　400715)
摘 　要 :目的 　针对三角叶黄连 ISSR 的反应特点 ,建立稳定可靠的 ISSR2PCR 分子标记反应体系 ,为进一步研究
三角叶黄连的种质资源遗传多样性奠定基础。方法 　通过筛选引物并设定影响三角叶黄连 ISSR2PCR 反应诸因
子的不同梯度 ,检测其不同反应体系的扩增效果 ,分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化 ,建立三角叶黄连
ISSR2PCR 稳定可靠的反应体系。结果 　建立了可用于三角叶黄连 ISSR2PCR 分析的最适宜的反应体系 :25μL
PCR 反应体系中 ,内含 10 ×PCR Buffer 215μL ,115 mmol/ L Mg2 + ,200μmol/ L dN TP ,013μmol/ L 引物 ,40 ng 模
板 ,110 U Taq DNA 聚合酶。扩增程序为 94 ℃预变性 5 min ,然后进行 35 个循环 :94 ℃变性 30 s , (据不同引物的
退火温度)复性 60 s ,72 ℃延伸 90 s ,循环结束后 72 ℃延伸 7 min ,4 ℃保存。结论 　所建立的三角叶黄连 ISSR 反
应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点 ,可以较好地应用于三角叶黄连的
种质资源遗传多样性及居群鉴别的研究。
关键词 :三角叶黄连 ; ISSR ;种质资源 ;优化
中图分类号 :R28212 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220280205
Establishment and optimization of ISSR reaction system for Coptis deltoidea
ZHAN G Chun2ping , H E Ping , WAN G Rui2bo , GAO Shan , ZHAN G Yi2feng
( Key Laboratory of Eco2environments of Three Gorges Reservoir Region , Minist ry of Education , Chongqing
Key Laboratory of Plant Ecology and Resources Research for Three Gorges Reservoir Region ,
School of Life Sciences , Southwest University , Chongqing 400715 , China)
Abstract : Objective 　In order to st udy t he genetic diversity of Coptis del toi dea germplasm , ISSR2PCR
system of C1 del toi de was established and optimized according to t he characters of it1 Methods 　The effect
of ISSR2PCR was examined by screening primers and designing the different concent ration of the factors in
t he ISSR1 The reliable system for C1 del toi de pop ulations researching was established by analyzing t he
reasons for occurrence of differential bands and optimizing t he reaction conditions1 Results 　The optimal
ISSR2PCR system in C1 del toi de was established for the first time , that is , 25μL amplification reactions
system containing 10 ×PCR Buffer 215μL , 115 mmol/ L Mg2 + , 200μmol/ L dN TP , 013μmol/ L primer ,
40 ng template , 110 U T aq DNA polymerase1 The optimal amplified procedure was as follows : af ter a p re2
denaturing of 5 min at 94 ℃, 35 cycles were performed wit h denat uring of 30 s at 94 ℃, annealing of 1 min
due to denat uring temperat ure of different p rimer , extension of 115 min at 72 ℃, a final extension step of
7 min at 72 ℃and kept at 4 ℃1 Conclusion 　The ISSR2PCR systems established for st udying of C1 del2
toi de show t he characters of clear marker site , stable reaction system , reliable abundant polymorp hisms ,
and bet ter repeatability1 It is suitable for t he study on genetic diversity of germplasm resource and identifi2
cation of C1 del toi de pop ulation1
Key words : Coptis del toi dea C1 Y1 Cheng et Hsiao ; ISSR ; germplasm resource ; optimization
　　三角叶黄连 Coptis del toi dea C1 Y1 Cheng et
Hsiao 为毛茛科黄连属多年生草本植物 ,主要分布
在四川西部的峨眉、洪雅与雅安地区海拔1 600～
2 200 m 的山地林下[ 1 ] 。三角叶黄连根茎入药 ,干
·082· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008203208
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30070080)
作者简介 :张春平 (1982 —) ,男 ,山东潍坊人 ,硕士 ,主要从事植物资源学与植物分子生物学方面的研究。
E2mail :chunpingzhang520 @1631com3 通讯作者　何　平　Tel : (023) 68254122 　E2mail :heping196373 @1261com
品称为“黄连”或“雅连”,内含小檗碱、黄连碱等多种
生物碱 ,具有清热、解毒、泻火、燥湿和良好的抗菌作
用[2 ] 。目前 ,三角叶黄连主要是以人工栽培的方式
生产 ,种内遗传多样性较低。野生三角叶黄连居群
数量及个体数濒危稀少 ,野生资源相当匮乏。为了
从野生三角叶黄连中筛选出性状优良的品种 ,研究
野生三角叶黄连的遗传多样性极有必要。目前 ,对
其药理、药化方面的研究相对较多[3～5 ] ,但是对其种
质资源的遗传多样性研究 ,特别是运用像 ISSR 等
分子手段的研究未见报道。
ISSR (inter2simple sequence repeat ) 是一种由
Zietkiewiez等于 1994 年创建[6 ] ,建立在 PCR 反应
基础上的 DNA 分子标记。近年来 , ISSR2PCR 已成
功用于植物遗传多样性分析、DNA 指纹图谱绘制、
分子生态学研究等领域[7～11 ] 。该技术无需预知受
试材料基因组序列 ,成本低、操作简单、灵敏性高且
重复性好等优点 ,被认为是非常理想的分子标记。
研究三角叶黄连居群的遗传多样性时 ,发现改变
ISSR2PCR 反应的各因子会直接影响到实验结果的
稳定性。为此 ,必须对三角叶黄连 ISSR2PCR 的反
应体系进行优化 ,分析非特异性条带产生的原因 ,以
建立适合三角叶黄连 ISSR2PCR 反应的可靠体系 ,
为深入开展三角叶黄连种质资源的遗传多样性研究
奠定基础。本研究旨在建立重复性好、结果明显而
稳定的 ISSR 反应体系和扩增程序 ,为进一步对三
角叶黄连的鉴定和种质资源遗传多样性研究提供有
效便利的方法 ,为挖掘潜在的药物资源和开发新药
提供良好基础。
1 　材料与方法
111 　植物材料 :采自三角叶黄连的主产区四川洪雅
和雅安地区。选取当年生嫩叶 ,低温条件下带回实
验室洗净、晾干 ,冻于 —80 ℃的超低温冰箱中备用。
112 　仪器与试剂 :扩增仪 (Bio2Rad 公司) ,核酸蛋
白分析仪 (Bio2Rad 公司) ,电泳仪 (Bio2Rad 公司) ,
凝胶成像系统 (Bio2Rad 公司) ,引物 (上海生工) ,
dN TP ( Promega 公司) , T aq DNA 聚合酶 ( Promega
公司) ,Mg2 + (上海生工) ,Buffer (上海生工) ,DNA
Marker ( TakaRa) , PV P ( Sigma) ,β2巯基乙醇 ( Sig2
ma) ,CTAB (Sigma) ,其余为国产分析纯试剂。
113 　基因组 DNA 提取及检测 :取新鲜的三角叶黄
连叶片 1 g ,采用改良后的 CTAB 法提取三角叶黄
连的基因组 DNA。用 Bio2Rad 核酸蛋白分析仪测
定所提 DNA 浓度及纯度 ,同时用 115 %的琼脂糖凝
胶电泳法检测 DNA 是否降解。
114 　扩增的优化实验设计 :优化实验中选用筛选好
的 U840 为扩增引物 ,对影响三角叶黄连 ISSR2PCR
反应的主要因素进行梯度实验。在进行梯度实验之
前 ,先根据经验确定一个基本反应体系 (25μL PCR
反应体系中 ,内含 10 ×PCR Buffer 215 μL , 210
mmol/ L Mg2 + ,200μmol/ L dN TP ,012μmol/ L 引
物 ,20 ng 模板 ,110 U DNA 聚合酶) ,再通过固定其
他变量改变一个变量的方法进行实验。具体的梯度
设计分别为 : T aq DNA 聚合酶与 Mg2 + 二因素梯度
实验 ,dN TP、模板、引物单因素梯度实验和引物退
火温度梯度单因素实验。在酶与 Mg2 + 二因素梯度
实验中 , T aq DNA 聚合酶和 Mg2 + 分别设置了 4 个
浓度梯度 ,二因素交叉共 16 个处理。引物的退火温
度梯度则是在其 Tm 值附近设置 8 个梯度进行筛
选。结果见表 1。
表 1 　ISSR2PCR反应体系的试验设计
Table 1 　Design of experiment for ISSR2PCR
reactions system
反应成分 反应浓度梯度
Mg2 + / (mmol ·L - 1 ) 110、11 5、21 0、21 5
T aq DNA 聚合酶/ U 015、11 0、11 5、21 0
dN TPs/ (mmol ·L - 1 ) 20、50、100、200、250、300、350、400
引物/ (μmol ·L - 1 ) 011、01 2、01 3、01 4、015、01 6、01 7、018
模板 DNA/ ng 10、20、40、80、100、120、160、200
低温退火温度/ ℃ 5210、531 5、541 5、5515、561 5、571 0、5715、581 0
115 　ISSR2PCR 反应产物的检测 :反应产物在含有
goldview 的 115 %的琼脂糖凝胶中电泳分离 ,电压 5
V/ cm。用 DL 2000 的 DNA marker ( 100～2 000
bp)作为标记 ,电泳结束后在 Gel Doc 2000 凝胶成
像系统下观察并拍照。
2 　结果与分析
211 　基因组 DNA 提取 :结果见图 1。随意提取 8
个个体的基因组 DNA 经电泳后显示出清晰整齐的
条带 ,这表明 DNA 并未发生降解。在 Bio2Rad 核
酸蛋白分析仪上测其质量浓度 ,将其稀释至 40 ng/
μL ,供 ISSR2PCR 试验所用。
图 1 　基因组 DNA的提取结果
Fig11 　Extraction of genomic DNA
212 　反应体系中各组分对扩增的影响
21211 　T aq DNA 聚合酶与 Mg2 + 对 ISSR 扩增的
影响 :本研究采用 T aq DNA 聚合酶与 Mg2 + 的二因
·182·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
素交叉试验 ,设置了 16 个处理 ,结果见图 2。当
Mg2 + 浓度为 110 mmol/ L 时 , T aq DNA 聚合酶从
015～210 U 均无扩增产物生成 ,并有拖尾现象产
生。当 Mg2 + 浓度达到 115 mmol/ L 时 ,开始出现条
带 ,并且当酶的量达到 110～115 U 时 ,条带清晰 ,
但是当酶量为 110 U 时 ,产生的条带明亮且背景清
晰 ,效果优于酶量为 115 U 时的 ,本着高效节省的
原则 ,110 U 可定为最适用量。当 Mg2 + 浓度为 210
mmol/ L 时 ,所扩增的产物形成拖尾现象 ,模糊不
清。当 Mg2 + 浓度为 215 mmol/ L 时 ,同样出现拖尾
现象 ,并且在此 Mg2 + 浓度下 ,高酶量不产生任何条
带。因此 ,泳道 6 的组合 ,即当 Mg2 + 为 11 5 mmol/
L , T aq DNA 聚合酶为 110 U 时 ,整体效果最好。
1～42Mg2 + 浓度为 110 mmol/ L ,聚合酶浓度分别为 01 5、11 0、11 5、
21 0 U 　5～82Mg2 + 浓度为 11 5 mmol/ L ,聚合酶浓度分别为 01 5、
11 0、11 5、21 0 U 　9～122Mg2 + 浓度为 21 0 mmol/ L ,聚合酶浓度分
别为 015、110、115、21 0 U 　13～162Mg2 + 浓度为 21 5 mmol/ L ,聚
合酶浓度分别为 015、110、115、210 U
1 —42Mg2 + concent ration : 11 0 mmol/ L , polymerase concent ra2
tion : 01 5 , 11 0 , 115 , and 21 0 U , respectively 　5 —82Mg2 + con2
cent ration : 115 mmol/ L , polymerase concent ration : 015 , 11 0 ,
11 5 , and 210 U , respectively 　9 —122Mg2 + concent ration : 21 0
mmol/ L , polymerase concent ration : 015 , 11 0 , 115 , and 21 0
U , respectively
13 —162Mg2 + concent ration : 215 mmol/ L , polymerase concent ra2
tion : 01 5 , 110 , 115 , and 210 U , respectively
图 2 　Taq DNA聚合酶与 Mg2 + 对 ISSR扩增的影响
Fig12 　Effect of Taq DNA polymerase and Mg2 +
concentration on ISSR amplif ication
2121 2 　dN TP 浓度对 ISSR 扩增的影响 : dN TP 是
PCR 扩增的原料 ,为了寻求最佳浓度 ,本实验设置
了从 20～400 mmol/ L 共 8 个浓度梯度 ,结果见图
3。在 8 个浓度梯度中 ,当浓度在 20～200 mmol/ L
时 ,随着 dN TP 浓度的增加 ,条带数量增加 ,并且在
200 mmol/ L 时产生的多样性条带数量多且清晰。
当 dN TP 的浓度达到 250 mmol/ L 时 ,仅产生少量
条带。当在 400 mmol/ L 时并无任何条带产生 ,这
表示无 PCR 产物生成 ,因此 ,200 mmol/ L 的 dN TP
为最佳浓度。
1～82显示 dN TP 浓度 :20、50、100、200、250、
300、350、400 mmol/ L
1 —82concent ration of dN TPs : 20 , 50 , 100 ,
200 , 250 , 300 , 350 , and 400 mmol/ L
图 3 　dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
Fig13 　Effect of dNTP concentration
on ISSR amplif ication
21213 　引物浓度对 ISSR 扩增的影响 :本实验中采
用筛选出的 U840 作为扩增引物 ,共设置了 8 个浓
度梯度 , 结果见图 4。当引物浓度在 012 ～ 015
μmol/ L 时有扩增产生 ,并且引物浓度在 013μmol/
L 时 ,条带最清晰且数目最多 ,这表明生成的扩增产
物最多。当引物浓度在 016～018μmol/ L 时 ,得到
的条带模糊不清。这表明非特异性扩增显著增强。
相对而言 ,013μmol/ L 时扩增明显且效果较好 ,可
以被确定为反应的理想浓度。
1～82显示引物浓度 :01 1、012、013、014、015、
016、01 7、01 8μmol/ L
1 —82concent ration of primer : 01 1 , 012 , 013 ,
014 , 015 , 01 6 , 017 , and 018μmol/ L
图 4 　引物浓度对 ISSR扩增的影响
Fig14 　Effect of primer concentration
on ISSR amplif ication
21214 　模板浓度对 ISSR 扩增的影响 :本实验中 ,
模板设置 8 个浓度梯度进行扩增 ,结果见图 5。当
模板的质量在 40、80 ng 时 ,扩增产物没有太大的影
响 ,只是在质量大于 80 ng 时 ,出现轻微的拖尾现
·282· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
象 ,条带模糊不清。但是 ,反应体系中如果模板过
少 ,分子碰撞的机率降低 ,过多反而又会产生非特异
性产物。所以 ,本着高效、节省的原则 ,选择 40 ng
作为最佳的模板质量。
1～82显示模板浓度 :10、20、40、80、100、120、160、200 ng
1 —82concent ration of template : 10 , 20 , 40 , 80 , 100 ,
120 , 160 , and 200 ng
图 5 　模板浓度对 ISSR扩增的影响
Fig15 　Effect of template concentration
on ISSR amplif ication
213 　退火温度对扩增的影响 :从图 6 中可以看出 ,
第 1～4 泳道中虽然出现了条带 ,但是亮度太弱 ,多
样性条带不多。只有在第 5 泳道时 ,出现背景清晰、
亮度适宜、且界限分明的多样性条带。高的退火温
度会使产生的条带减少 ,并且背景模糊。因此 ,第 5
个温度梯度时 ,即 5615 ℃可以确定为最佳退火
温度。
214 　三角叶黄连反应体系的建立 :通过对上述各反
应条件的分析 ,建立了适合三角叶黄连扩增的反应
1～82显示通火浓度 :521 0、531 5、541 5、5515、
5615、5710、5715、5810 ℃
1 —82annealing temperature gradient : 521 0 , 5315 ,
541 5 , 551 5 , 561 5 , 5710 , 5715 , and 581 0 ℃
图 6 　退火温度对扩增的影响
Fig16 　Effect of annealing temperature
gradient on ISSR amplif ication
体系和扩增程序。反应体系为 :25μL PCR 反应体
系中 ,内含 10 ×PCR Buffer 215μL , 115 mmol/ L
Mg2 + , 200μmol/ L dN TP ,013μmol/ L 引物 ,40 ng
模板 ,110 U T aq DNA 聚合酶。扩增程序为 94 ℃
预变性 5 min ,然后进行 35 个循环 :94 ℃变性 30 s ,
(据不同引物退火温度) 复性 60 s ,72 ℃延伸 90 s ,
循环结束后 72 ℃延伸 7 min ,4 ℃保存。
215 　优化体系对三角叶黄连的扩增效果 :利用此优
化体系 ,对来自不同地区的 24 个三角叶黄连样本进
行了扩增 ,得到了背景清晰、多态性稳定丰富的
DNA 扩增片段 (图 7) ,可用于三角叶黄连的居群鉴
别及遗传结构分析研究。
图 7 　引物 U840 对 24 样本的扩增结果
Fig17 　Result of ISSR amplif ication generated with Primer U840 for 24 samples
3 　讨论
Mg2 + 浓度是影响 ISSR2PCR 结果的一个重要
因素 ,Mg2 + 是 T aq DNA 聚合酶的依赖性因素 ,其
浓度的大小可直接影响酶活性的发挥。因此 ,选择
合适的 Mg2 + 浓度对 PCR 的结果至关重要。另外 ,
Mg2 + 还能与反应液中的 dN TP、模板 DNA 及引物
结合 ,影响引物与模板的结合效率、模板与产物的解
链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成。在
一般的 PCR 反应中 ,0115～2110 mmol/ L 是较合适
的 Mg2 + 浓度范围 ,本实验的结果也证实了这一点。
在影响扩增的众多因子中 , T aq DNA 聚合酶是
一个很重要的因素 ,酶的浓度直接决定扩增的成功
·382·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
与否 ,没有酶的催化 ,反应无法进行。因此 ,寻找合
适浓度的 T aq DNA 聚合酶是实验的重要任务。但
是 ,酶的活性又与 Mg2 + 相关联 ,合适的 Mg2 + 浓度
又是决定酶活性的重要因素。所以 ,笔者采用了酶
与 Mg2 + 的二因子交叉试验 ,通过不同的搭配 ,找出
最适的浓度组合。值得注意的是 ,不同厂家 ,甚至同
一厂家不同批次的酶 ,其活力都存在着差异。为了
减少实验误差 ,应该尽量使用同一厂家生产的同一
批次的酶。
dN TP 是扩增的主要原料 , 其浓度过高时 ,
dN TP 分子中的磷酸基团会定量地与 Mg2 + 结合 ,使
游离的 Mg2 + 浓度降低 ,与酶竞争 Mg2 + ,使得酶的
活性降低 ,扩增产物大大减少。并且还会导致 PCR
错配 ,出现非特异性扩增 ,影响结果。浓度过低 ,又
会影响扩增的产量。因此 ,合适的 dN TP 浓度也是
十分关键的。本实验通过梯度设置 ,得到了合适的
dN TP 浓度。ISSR 对模板的浓度要求并不高 ,只要
是在一定的范围内 ,多样性条带不会有变化 ,但是产
量则有不同。一般而言 ,模板的浓度越高 ,产量
越高[ 12 ] 。
由于 ISSR2PCR 所用的每条引物碱基组成和数
量是不同的 ,因此 ,每条引物都有适合自己的退火温
度。退火温度有时候并不严格等于其 Tm 值 ,而是
在 Tm 值附近波动。在 PCR 反应中 ,过低的温度在
保证模板与引物结合的同时 ,也使得模板与引物之
间未完全配对的位点得到扩增 ,产生了所谓的错误
扩增。因此 ,在允许的温度范围内 ,较高的温度会提
高反应的特异性 ,减少非特异性产物的生成。在本
实验中 ,每条引物都要单独摸索退火温度 ,其基本的
原则是逐步递缩法[13 ] ,即首先设置较宽的温度梯
度 ,找到大体合适的温度范围之后 ,再把此范围的温
度细分 ,直至找到合适的温度为止。
因为分子标记实验受很多因素的影响 ,因此要
尽量严格地控制各反应因素 ,减少不必要的误差出
现。并且实验要重复多次 ,取稳定的条件作为最终
反应条件 ,从而得到最佳实验结果。
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邵清松1 ,2 ,郭巧生1 3 ,谢作成1 3
(11 南京农业大学中药材研究所 ,江苏 南京 　210095 ; 21 浙江林学院 ,浙江 杭州 　311300)
摘　要 :目的 　对影响药用菊花 ISSR2PCR 扩增效果的一些因素进行优化 ,为进一步研究其遗传多样性奠定基础。
方法 　基于方差分析方法 ,利用正交试验从 Taq酶、Mg2 + 、dN TP 和引物等 4 因素 3 水平对药用菊花反应体系进行
优化。结果 　药用菊花 ISSR2PCR 的最佳反应体系 :在 20μL 的反应体系中 , Taq酶 1100 U ,Mg2 + 2100 mmol/ L ,
·482· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008204212
基金项目 :国家科技攻关计划项目 (2004BA721A20) ;国家“十一五”科技支撑计划项目 (2006BAI06A12211)
作者简介 :邵清松 (1980 —) ,男 ,浙江温州人 ,博士研究生 ,主要从事药用植物遗传多样性及中药资源开发与利用方面的研究。3 通讯作者　郭巧生　Tel : (025) 84396591 　E2mail :gqs @njau1edu1cn