全 文 ：补骨脂素加长波紫外线光化学疗法诱导人白血病
细胞凋亡时对线粒体膜电位的影响
陈楠楠 ,张 　晨 ,向 　阳 ,黄世林 ,张德杰 3
(解放军第 210 医院 中医血液科 ,辽宁 大连 　116021)
摘 　要 :目的 　研究补骨脂素 ( PSO) 加长波紫外线 (UVA) 光化学疗法 ( PUVA) 诱导人白血病细胞 K562、NB4
凋亡时对线粒体膜电位的影响。方法 　细胞与不同质量浓度 PSO ,接受或不接受 UVA 照射后共同培养 ,电镜下
观察细胞超微结构改变 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化 ,采用多因素方差分析法进行统计学处
理。结果 　PUVA 处理后的 K562、NB4 细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变 ; PSO、UVA 照射及 PUVA 均
可使细胞凋亡率增加 ,线粒体膜电位下降 ,PUVA 的作用显著强于前两者 ( P < 0101) 。结论 　PUVA 可诱导人白
血病细胞发生凋亡 ,诱导凋亡的途径之一为下调线粒体膜电位水平。
关键词 : PUVA ; 白血病 ; K562 细胞 ; NB4 细胞 ; 凋亡 ; 线粒体膜电位
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0220252203
Effect of PUVA on mitochondrial membrane potential in apoptosis
of K562 and NB4 leukemia cells
CH EN Nan2nan , ZHAN G Chen , XIAN G Yang , HUAN G Shi2lin , ZHAN G De2jie
(Department of Traditional Chinese Medicine and Hematology , 210th Hospital of PLA , Dalian 116021 , China)
Abstract : Objective 　To st udy the effect s of p soralen ( PSO) and long wave ult raviolet A ( UVA)
[ PSO + UVA ( PUVA ) ] on mitochondrial membrane potential in apoptosis of K562 and NB4 leukemia
cells. Methods 　Cells were incubated wit h PSO in different concent ration irradiated wit h or wit hout UVA.
The changes of ult rast ructure of the cells were observed under the elect ron microscope. The apoptosis
rates and t he changes of mitochondrial membrane potential were detected t hrough the flow cytomet ry. The
factorial design and analysis of variane were used to analyze t he interaction among t he factors. Results 　
There were obvious ult rast ruct ure changes in apoptosis of K562 and NB4 leukemia cells af ter t reated wit h
PUVA. PSO , UVA , and PUVA all increased the apoptosis rates and decreased t he mitochondrial mem2
brane potential , and the effect s of PUVA were st ronger t han t hat of t he ot her two ( P < 0101) . Conclusion
PUVA could induce t he apoptosis of K562 and NB4 leukemia cells and one of the pat hway to induce apop2
to sis is to downregulate t he mitochondrial membrane potential .
Key words : PUVA ; leukemia ; K562 cells ; NB4 cells ; apoptosis ; mitochondrial membrane potential
　　补骨脂 Fruct us Psoraleae 属于补肾助阳类中
药 ,现代药理研究表明 ,补骨脂素 (p soralen , PSO)
是其种子中的主要成分 ,是一类杂环化合物 ,又称呋
喃香豆素 ,具有光敏性质与抗肿瘤活性。PSO 本身
具有一定的抗肿瘤活性[1 ] ,经长波紫外线 (ult ravio2
let A , UVA) 照射后 ,在化学及生物过程中发生光
致敏性 ,使原来与 DNA 间微弱的结合转变成与
DNA 双螺旋的链间共价健交联 ,阻碍 DNA 聚合酶
沿 DNA 链的连续性移动 ,使 DNA 聚合酶模板活
性丧失 ,从而抑制了 DNA 的合成[2 ] 。此外 ,PSO 可
对 RNA 的合成、细胞酶的活性以及糖、脂肪代谢产
物产生影响。研究表明补骨脂素加长波紫外线光化
学疗法 ( PUVA) 对人白血病细胞 HL260、K562、
NB4 均有一定的杀伤作用[3 ] ,且 PUVA 诱导 HL2
60、K562 细胞发生凋亡与调控 Fas 及 FasL 基因表
达有关[ 4 ] ,但其确切作用机制尚不清楚 ,本实验进一
步探讨 PUVA 法对人白血病细胞 K562、NB4 细胞
凋亡的作用及部分作用机制 ,为 PUVA 的临床应
用提供理论依据。
1 　材料与方法
111 　细胞株 :人红白血病细胞 K562 由大连医科大
学惠赠 ;人急性髓细胞白血病 ( FAB2M3) NB4 细胞
·252· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008206217
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30472257)
作者简介 :陈楠楠 (1976 —) ,女 ,主治医师 ,医学博士。Tel : 13387856109 　E2mail : chnngax @163. com
由上海血液学研究所陈竺院士惠赠。
112 　药品及主要试剂 : PSO (质量分数 9815 % ,质
量浓度为 10 mg/ 2 mL) 由大连理工大学及本院共
同由补骨脂中提取和制备。RPMI 1640 培养液、胎
牛血清为 Gibco 产品。小牛血清系杭州四季青生
物材料工程公司产品。J C21 为 Molecular Probe 公
司产品。
113 　仪器和设备 :流式细胞仪购自美国贝克曼库尔
特公司 , GL Y—10 型光量子血液平衡治疗仪由徐州
华卫医疗设备公司研制。
114 　细胞培养 : K562、NB4 细胞分别常规培养于含
10 % 小牛血清及 10 % 胎牛血清的 RPMI 1640 培
养基 (含硫酸庆大霉素 01025 U/ mL) 中 ,于 37 ℃、
5 % CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养。
115 　透射电镜下观察细胞超微结构特点[4 ] :收集浓
度为 510 ×105 / mL 细胞 ,经 PUVA ( PSO 80μg/
mL ,UVA 5 min) 处理 24 h 的 K562、NB4 细胞 10
mL ,用 PBS 清洗两次 ,转入 210 mL 离心管 ,离心
(2 000 r/ min) 3 min ,弃上清 ,缓缓加入 215 % 戊二
醛 2 mL ,4 ℃冰箱静置 2 h 以上。磷酸缓冲液冲
洗 ,锇酸固定 ,水洗、脱水 ,浸透、包埋 ,制定超薄切
片 ,透射电镜下观察。
116 　流式细胞术测定 PUVA 作用 24 h 后细胞的
凋亡情况 :取浓度为 41 0 ×105 / mL ,处于对数生长
期的 K562、NB4 细胞 5 mL ,分别加入 PSO 0、5、
10、20、40μL ,使其在反应体系中的终质量浓度分别
为 0、10、20、40、80μg/ mL ,放入石英比色皿中 ,在
GL Y—10 型光量子血液平衡治疗仪 (λ= 360 nm)
上以 1 J / m2辐射量边照射边震荡 ,照射时间分别为
0、5 min。处理后各实验组细胞继续培养 24 h 后 ,
收集 510 ×105 细胞 ,用 PBS 洗两次 ,弃上清 ,加入
100μL 碘化丙啶 ( PI) 染液 ,避光反应 30 min ,加入
PBS 400μL ,上机检测 ,并用 Multicycle 软件分析
得出相应的细胞凋亡百分率。
117 　流式细胞术测定 PUVA 作用 24 h 后细胞线
粒体膜电位的变化 :分组及处理方法同 116 项。收
集 1 ×106 个细胞 ,重悬于 1 mL PBS 中 ,加入 200
μmol/ L J C —1 10μL ,37 ℃、5 % CO2 孵育 15～30
min ,2 mL PBS 洗 1 次 ,室温下离心 (1 000 r/ min)
3 min ,弃上清 ,加 500μL PBS ,轻摇试管使细胞重
悬 ,上机检测 ,用 50 mmol/ L CCCP 1μL ,37 ℃孵
育 5 min ,进行荧光标准补偿。
118 　统计学处理 :所有实验结果均来自至少 3 组平
行或 3 次重复实验。计量资料以 x ±s 表示 ,采用多
因素方差分析 ;统计计算均用 SPSS 1115 统计软件
进行。
2 　结果
211 　透射电镜下观察 PUVA 后细胞超微结构改
变 : PUVA 作用 24 h 后 K562、NB4 细胞均出现体
积缩小 ,胞浆浓缩 ,胞核体积减小 ,裂解成一个或数
个致密体 ,可见核小体破裂 ,核染色质聚集或边集 ,
部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体
状 ,整个细胞可裂解成大小不一的凋亡小体 ,
见图 1。
图 1 　PUVA 作用后 K562 和 NB4 细胞超微结构的改变
Fig. 1 　Ultrastructure change of K562 and NB4 leukemia cells after treated with PUVA
212 　PUVA 诱导细胞凋亡的作用 :应用流式细胞
仪检测 PUVA 作用 24 h 后 K562、NB4 细胞凋亡
率 ,见表 1。PSO 各剂量照射 0 min 即可引起 NB4
细胞凋亡 , 照射 5 min , 细胞凋亡率明显增加 ;
PUVA 作用 24 h 对 K562 细胞亦有诱导凋亡作用。
213 　PUVA 对 K562、NB4 细胞线粒体膜电位的影 响 :应用流式细胞仪检测 PUVA 作用 24 h 细胞线粒体膜电位相对荧光强度的变化 ,见表 2。结果表明 PUVA 作用 24 h 后 K562 及 NB4 细胞线粒体膜电位明显下降。3 　讨论　　PSO 具有抗肿瘤、抗白血病的作用 ,同时又具
·352·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
表 1 　PUVA 作用 24 后 K562、NB4 细胞的凋亡率
( x ±s , n = 3)
Table 1 　Apoptosis rates of K562 and NB4 leukemia
cells after treated with PUVA for 24 h
( x ±s , n = 3)
PSO 终质量浓度
/ (μg·mL - 1 )
K562 细胞凋亡率/ %
0 min 5 min
NB4 细胞凋亡率/ %
0 min 5 min
　0 1118 ±0124 6151 ±0120 3 3 △△ 4197 ±0161 25143 ±0190 3 3 △△
10 1141 ±0111 3 3 7199 ±0134 3 3 △△ 6163 ±0131 3 3 26157 ±0142 3 3 △△
20 1147 ±0105 3 3 9123 ±0139 3 3 △△ 10187 ±0180 3 3 30167 ±2111 3 3 △△
40 1152 ±0112 3 3 11194 ±0150 3 3 △△ 11183 ±0151 3 3 34190 ±0130 3 3 △△
80 2173 ±0104 3 3 17184 ±0157 3 3 △△ 15113 ±0132 3 3 24163 ±0138 3 3 △△
　　与其相应的对照组 (0 min , 0μg/ mL) 比较 : 3 3 P < 01 01
　　与相应的 0 min 组比较 : △△P < 01 01 (下表同)
　　3 3 P < 0101 vs corresponding cont rol group (0 min , 0μg/ mL) ;
△△P < 01 01 vs corresponding 0 min group , following tables are same
表 2 　PUVA 作用 24 h 后 K562、NB4 细胞线粒体膜
电位的变化 ( x ±s , n = 3)
Table 2 　Changes of mitochondrial membrane potential
of K562 and leukemia NB4 cells after treated
with PUVA for 24 h ( x ±s , n = 3)
PSO 终质量浓度
/ (μg·mL - 1 )
K562 细胞线粒体膜电位
0 min 5 min
NB4 细胞线粒体膜电位
0 min 5 min
　0 377193 ±5146 262100 ±3151 3 3 △△583133 ±2115 237110 ±8151 3 3 △△
10 310190 ±5173 3 3 232137 ±2173 3 3 △△436190 ±3118 3 3 210143 ±6140 3 3 △△
20 193143 ±9181 3 3 132183 ±1134 3 3 △△376180 ±5191 3 3 206183 ±5139 3 3 △△
40 144100 ±3170 3 3 119183 ±2156 3 3 △△333140 ±7101 3 3 200173 ±8178 3 3 △△
80 122123 ±8194 3 3 117150 ±0198 3 3 △△323153 ±6198 3 3 182127 ±8159 3 3 △△
有光敏活性[5～7 ] ,波长范围在 320～360 nm 的紫外
光照射 ,可激发 PSO 的动力效应 ,从而增强其抗肿
瘤及抗白血病的作用。电镜和流式细胞仪检测结果
显示 ,PUVA 可诱导 K562、NB4 白血病细胞发生凋
亡。与对照组 (0 min 0μg/ mL) 相比 ,单纯 PSO 和
UVA ,以及 PUVA 均可增加细胞凋亡率 ,但多因素
方差分析结果显示 PUVA 的作用要显著强于前两
者 ,也再次证明了 PSO 的光敏效应。
线粒体是细胞内 A TP 的主要生产中心 ,线粒
体膜 电 位 ( mitochondrial membrane potential ,
ΔΨm) 是由于线粒体内膜两侧质子及其他离子不
平衡而形成的 ,是保持线粒体功能所必需的。在线
粒体内、外膜交界处存在一种蛋白性孔道 ,即膜渗透
性转换通道 (permeability t ransition pore , P TP) ,
多种刺激如氧化应激、超负荷、再灌注损伤等均可造
成 P TP 开放[8 ] ,引起线粒体膜电位的下降 ,呼吸链
断裂 ,诱导细胞凋亡和死亡。本实验结果显示 ,经
PSO、UVA 和 PUVA 处理的 K562、NB4 细胞线粒
体膜电位均有下降 ,且统计分析结果显示 PUVA
对细胞线粒体膜电位的影响最强 ,提示 PUVA 在
诱导 K562、NB4 细胞凋亡的过程中可能影响了
P TP 的开放 ,下调了细胞线粒体膜电位水平。
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《中草药》杂志售过刊信息
　　《中草药》杂志编辑部尚存部分过刊合订本 ,包括 :197421975 年、1976 年、1979 年、1988 - 1993 年 (80 元/ 年) ,1996、
1997 年 (110 元/ 年) 、1998 年 (120 元/ 年) 、1999 年 (135 元/ 年) 、2000 年 (180 元/ 年) 、2001 - 2003 年 (200 元/ 年) 、2004
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元) 、1997 年增刊 (45 元) 、1998 年增刊 (55 元) 、1999 年增刊 (70 元) 、2000 年增刊 (70 元) 、2001 年增刊 (70 元) 、2002 年
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