全 文 ：4种中药提取物对大鼠小肠上皮细胞 IEC-6 增殖及其葡萄糖吸收的影响
宋小珍1, 2 ,杨秀江2 ,王 恬1* ,刘凤华3*
( 11 南京农业大学动物科学技术学院,江苏 南京 210095; 21 江西农业大学动物科学技术学院, 江西 南昌 330045;
31 北京农学院 动物科技系,北京 102206)
摘 要:目的 利用大鼠小肠上皮细胞系 ( IEC-6) ,研究单味中药提取物对小肠上皮细胞增殖和葡萄糖吸收转运功
能的调控作用。方法 藿香、苍术、黄柏和石膏等 4 种中药被定向提取, MTT 细胞增殖试验筛选提取物的适宜作
用质量浓度, 测定各处理组细胞的葡萄糖吸收率和 Na+ , K +-SATP 酶活性, 同时采用荧光定量 PCR 技术分析细
胞中钠-葡萄糖共转运载体 ( SGLT1)、葡萄糖转运载体 2 ( GLUT2) 和 Na+ , K+-ATP 酶的 mRNA 表达量。结果
各中药提取物对大鼠小肠上皮细胞增殖的影响与其作用质量浓度有关。50 Lg/ mL 苍术挥发油和 10 Lg/ mL 黄柏
生物碱可提高 IEC-6 细胞葡萄糖的吸收功能,并显著上调了 SGLT1 和 Na+ , K +-AT P 酶 mRNA 表达量; 50 Lg /
mL 藿香挥发油促进了细胞的葡萄糖吸收, 但仅对 GLUT2 的基因表达有上调效应 (P < 01 05) ; 而 50 Lg/ mL 石膏
水提物对细胞葡萄糖的吸收无促进作用 ( P> 01 05)。结论 苍术挥发油、藿香挥发油和黄柏生物碱对细胞增殖和
葡萄糖吸收均有促进作用, 但其影响机制并不完全一样。
关键词: 藿香; 苍术; 黄柏; 石膏; IEC-6 细胞; 细胞增殖; 葡萄糖吸收; Na+ , K +-ATP 酶
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 08-1263-04
Effects of four Chinese herb extracts on cell proliferation in IEC-6 cells of rats
and their glucose absorption
SONG Xiao-zhen1, 2 , YANG Xiu- jiang 2 , WANG T ian1 , L IU Feng-hua3
( 11 Colleg e of Animal Science and Technolog y, Nanjing Ag ricultur al Univer sity , Nanjing 210095, China;
21 Co llege of Animal Science and Techno lo gy , Jiangx i Ag ricult ur al Univ ersity , Nanchang 330045, China;
31 Co llege o f Animal Science and T echnolog y, Beijing Univer sity o f Agr iculture, Beijing 102206, China)
Abstract: Objective To study the ef fects of Chinese herb ex tr acts on cell prolifer at ion and gluco se ab-
so rpt ion in intest inal epithelial cell line ( IEC-6 cells) of r ats. Methods T he ext racts of four Chinese
herbs, including H er ba A gastaches ( HA) , Rhiz oma A tr acty lod is ( RA) , Cor tex P hellodendri ( CP) , and
Gyp sum Fibr osum ( GF) , w er e made. T heir suitable concentr at ion on the cell pro liferation in IEC-6 cells
w as determ ined by M TT method, and g lucose absorpt ion and the act iv ity of Na
+
, K
+
-A TPase in IEC-6
cells w er e assayed. A method of r eal t ime PCR was applied to the determinat ion of SGLT1 and GLUT 2
mRNA expression in the cells. Results Chinese herb ext racts t reatment altered the cell proliferat ion in a
dose-dependent manner. M oreover, RA volat ile o il ( 50 Lg/ mL) and CP alkaloid ( 10 Lg / mL) t reatment in-
cr eased gluco se absorpt ion and the act ivity of Na
+
, K
+
-ATPase genes ( P< 01 05) . HA Vo lat ile oil ( 50 Lg/
mL) t reatment improved g lucose absor pt ion and up-regulated the gene expression o f GLUT 2. How ever,
GF w ater ex t ract ( 50 Lg / mL) t reatment did not af fect the g lucose absorption and transpor t in IEC-6 cells
( P> 01 05) . Conclusion T he three ex tracts t reatment , including RA volat ile oil, CP aklaloid, and HA
vo latile o il, could incr ease g lucose abso rpt ion and the expression of g lucose tr ansport carrier genes, but
their regulative mechanism are not totally the same.
Key words: H er ba A gastaches ; Rhiz oma A tr acty lod is ; Cor tax P hellodendri ; Gyp sum Fibr osum ;
intestinal epithelial cell line ( IEC-6 cells) ; cell pro liferation; gluco se obsorption; Na
+
, K
+
-AT Pase
临床试验中, 各种应激因素所导致的胃肠功能 紊乱性疾病较为常见, 且最易引起机体消化吸收能
#1263#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
* 收稿日期: 2009-01-15 基金项目:国家/ 十一五0科技支撑项目 ( 2006BAD14B05) ; 国家自然科学基金资助项目 ( 30771566, 30771591) ; 北京市自然科学基金、北京市教委资助重点课题 ( KZ200310020007)作者简介:宋小珍( 1974 ) ) ,女,江西樟树人, 江西农业大学副教授,博士, 研究方向为中药提取物添加剂研究及反刍动物营养调控。
Tel: ( 0791) 3813503 E-mail: songxz1234@ 163. com
* 通讯作者 王 恬 E-mail: t ianw ang@ njau. edu. cn刘凤华 Tel: ( 010) 8079914 E-m ail : liu fenghua1209@ 126. com
力下降[ 1] 。中医脾胃主运化功能, 即包含现代医学
之胃肠消化吸收的生理过程。随着中药对胃肠功能
影响研究的深入, 也已把一些具有/ 理气、消食、化
湿0作用的中药称之为/胃肠动力中药0。先前的研
究表明,藿香、苍术等中药可促进胃肠蠕动,可保护
机体肠道功能[ 2]。本实验室前期研究已经证实, 由
藿香、黄柏、苍术和石膏按一定比例组合而成的中药
复方可显著改善猪和小鼠等热应激模型动物的生产
性能,促进小肠对营养物质的消化吸收能力[ 3, 4] , 但
对其药效机制尚未做进一步研究。
IEC-6 细胞来源于新生的正常大鼠小肠, 在组
织学和免疫学方面具有隐窝样上皮细胞的特征, 其
在一定条件下可分化为成熟的小肠上皮细胞,具有
小肠上皮细胞的营养消化吸收功能。IEC-6 细胞系
的建立对于研究小肠上皮细胞的生长、分化和代谢
等功能具有重要意义 [ 5] ,目前已被利用为中药活性
成分药效学研究的常用体外模型 [ 6]。本研究拟利用
大鼠 IEC-6 细胞系, 观察藿香、苍术、黄柏和石膏对
小肠上皮细胞增殖和吸收功能的影响, 探讨这些中
药调节肠道吸收功能的作用机制。
1 材料
11 1 细胞: 大鼠小肠上皮细胞 IEC-6 细胞株
( CRL21592) 购自中国协和医科大学细胞保藏室。
11 2 中药提取物: 石膏水提物 (含硫酸钙 92%)、
黄柏生物碱 (含小檗碱 421 0%)、霍香挥发油包合
物 (含百秋里醇 301 47% )、苍术挥发油包合物 (含
B-桉叶油醇 331 63%) ,均由本课题组制备和定量测
定,临用前分别用 DMEM 基础培养基配制成 1
mg/ mL 母液。
11 3 试剂: DMEM 培养液、超滤胎牛血清 ( dF-
BS)、胰酶-EDT A 溶液、Dulbeccos 磷酸缓冲液 ( D-
PBS)、硫酸庆大霉素和胰岛素购自 Gibco 公司
( Gaithersbury, MD) , 二甲基亚枫 ( DM SO) 购自
Amresco 公司。MTT 干粉:购自 Amresco 公司;猪
长效胰岛素购自中国农业大学动物医院; 葡萄糖测
定试剂盒和 Na+ , K +-ATP 酶活性试剂盒均购于南
京建成生物工程研究所。
11 4 仪器设备: LRH ) 250A 型生化培养箱 (广东
省医疗器械厂) ; 台式离心机 (上海安亭科学仪器
厂) ; Bio fuge PrimerR 台式冷冻高速离心机 (德国
Heraeus公司产品) ;超净工作台 (哈东联公司) ; CO2
细胞培养箱 ( Thermo 公司) ; HZQ ) C 型恒温振荡器
(哈尔滨东明仪器厂) ; 倒置显微镜 (日本 Olympus) ;
细胞计数器 (北京科昊泽生物制品有限公司)。
2 方法
21 1 中药提取物有效质量浓度的筛选: 试验分 20
个处理组, 每种中药提取物设 4 个质量浓度梯度
( 200、100、50、10 Lg/ mL) 和对照组各 1 个。每组
设 3次重复, 每重复 10个孔。IEC-6 细胞消化后,
调整细胞浓度为 1 @ 105 / mL, 向 96 孔细胞培养板
中加入 100 LL 细胞悬液, 中药组分别加入 25 LL
不同质量浓度中药提取物工作液, 对照组补加 25
LL DMEM 完全培养液。37 e 、5% CO 2培养箱中
培养 68 h 后, 每孔加入 10 LL 5 mg/ mL 的 MT T
液,继续培养 4 h 后加入 100 LL DMSO 液混匀, 于
570 nm 处检测吸光度 ( A ) 值。
21 2 IEC-6 细胞葡萄糖吸收与 Na+ , K +-A TP 酶
活性的测定:试验分 5个处理组, 分别为对照组、50
Lg/ mL 藿香组、50 Lg/ mL 苍术组、10 Lg / mL 黄柏
组、50 Lg/ mL 石膏组, 每组设 4个复孔, 共 20 个
孔。每孔中加 1 mL 细胞培养液 (其中对照组为
950 LL 细胞悬液+ 50 LL DMEM 完全培养液、藿香
组为 950 LL 细胞悬液+ 50 LL 1 mg / mL 藿香挥发
油、苍术组为 950 LL 细胞悬液+ 50 LL 1 mg / mL
苍术挥发油、黄柏组为 990 LL 细胞悬液+ 10 LL 1
mg/ mL 黄柏生物碱+ 40 LL DMEM 完全培养液、
石膏组为 950 LL 细胞悬液+ 50 LL 1 mg / mL 石膏
水提物)。37 e 、5% CO2培养箱中培养 72 h 后, 吸
取细胞上清液, 用葡萄糖测定试剂盒检测细胞上清
中葡萄糖的量, 计算葡萄糖吸收率。同时用 Na+ ,
K
+
-AT P 酶活性试剂盒测定细胞上清的 Na+ , K+-
ATP 酶活性。
葡萄糖吸收率= ( 1 mL 培养液中葡萄糖的质量分数-
上清中葡萄糖质量分数) / 1 mL 培养液中葡萄糖质量分数
21 3 钠-葡萄糖共转运载体 1 ( SGLT 1)、葡萄糖转
运载体 2 ( GLU T2) 及 Na+ , K +-ATP 酶 mRNA
的相对定量: 将上述吸去上清液的细胞培养板用
PBS 清洗两次后, 每孔加入 T rizo l 裂解液 01 25
mL,采用 T rizol ( Invit rog en, life techno log ies) 一
步提取法提取总 RNA, 用核酸蛋白仪 ( Eppendor f
Biopho tometer) 测定总 RNA 浓度, 1% 琼脂糖凝
胶电泳鉴定总 RNA 质量。而后用随机引物将各样
品的总 RNA 反转录成 cDN A。21 0 Lg 总 RNA 被
加到 25 LL 反应体系中 (包括 01 5 Lg Oligo-dT 18 5
LL dNTPs, 1 LL RNasin inhibitor, 1 LL M-MLV
tr anscriptase, 5 LL M-MLV RT 反应缓冲液和
proper Rnase- free w ater) ,按照 2步反应法 ( 70 e ,
5 m in 1个循环; 42 e , 2 h 1个循环) 得到的 cDNA
#1264# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
保存于 - 20 e 。
根据 GenBank 相应的 cDNA 序列 ( BC-
081827, BC078875, NM 012504, AF541940) , 进行
BLA ST 分析后,用 prem ier 5. 0 软件设计目的基因
SGLT 1, GLUT 2, N a+ , K +-AT Pase 和内参照B-ac-
t in 的引物, 由北京奥科合成。SGLT 1 引物: 上游
5c-T T GCCTACGGAA CT GGAAG-3c, 下游 5c- TT-
GGT GAGGAGGGAGATGAC-3c, 产物长度 136
bp; GLU T2 引物: 上游 5c-CCAGCA CAT ACGA-
CACCAGA-3c, 下 游 5c-AAGAGGGCT CCAGT-
CAACG-3c, 产物长度 203 bp; Na+ , K +-AT P 酶引
物:上游 5c-CA CAAGAACCCAAACGCAT C-3c,下
游 5c-AAGACCCA CGAAGCAGAGG-3c,产物长度
288 bp; B- act in 引物: 上游 5c-A GAAGAGCT AT-
GAGCT CCT GA CG-3c, 下 游 5c-CACAAGAAC-
CCAAA CGCATC-3c, 产物长度 236 bp。在荧光定
量 PCR 仪 ( M x3000p, St ratagene) 上进行 PCR扩
增,同时扩增看家基因 B-actin 校正加样误差。
21 4 统计分析:所有数据用 x ? s 表示, 采用 SPSS
111 0 统计软件进行数据处理和差异显著性分析
(单因子方差分析 one w ay A NOVA, LSD)。实时
荧光 PCR 结果采用 Stratag enecs M x3000P 荧光分
析系统得出。
3 结果与分析
31 1 大鼠 IEC-6 细胞增殖的变化:与对照组比较,
50、200 Lg / mL 石膏组显著促进细胞增殖 ( P <
01 05) , 10、100 Lg/ mL 石膏组差异不显著 ( P>
01 05) ; 50、100 Lg/ mL 苍术组的细胞增殖显著升高
( P < 01 05 ) , 10、200 Lg/ mL 苍术组差异不显著
( P> 01 05) ; 10 Lg / mL 黄柏组显著促进细胞增殖
( P< 01 05) , 100、200 Lg/ mL 黄柏组显著抑制细胞
增殖;藿香在低质量浓度 ( 10、50 Lg/ mL) 时显著促
进细胞增殖, 而高质量浓度 ( 100、200 Lg/ mL) 时差
异不显著。结果见图 1。
31 2 大鼠 IEC-6 细胞葡萄糖吸收及 Na+ , K +-
AT P 酶活性的变化: 由表 1可知,与对照组相比,添
加藿香挥发油、苍术挥发油和黄柏生物碱后显著提
高了大鼠 IEC-6 细胞对葡萄糖的吸收率 ( P <
01 05) , 石膏水提物组的葡萄糖吸收率显著下降
( P< 01 05)。在对 Na+ , K +-A TP 酶活性影响上
看,苍术挥发油和黄柏生物碱组的 Na+ , K +-ATP
酶活性均显著高于对照组 ( P< 01 05) ;藿香挥发油、
石膏水提物与对照组差异不显著 ( P> 01 05)。
31 3 IEC-6 细胞 SGLT1、GLU T2、Na+ , K +-ATP
与对照组比较: * P < 01 05
* P < 01 05 v s cont rol group
图 1 中药提取物对 IEC-6 细胞增殖的影响 ( x? s, n= 10)
Fig. 1 Effect of Chinese herb extracts on cell proliferation
in IEC-6 cells ( x? s, n= 10)
表 1 中药提取物对 IEC-6 细胞葡萄糖吸收及 Na+ ,
K+-ATP 酶活性的影响 (x ? s, n= 4)
Table 1 Effect of Chinese herb extracts on glucose
absorption and Na+ , K+-ATPase activity
in IEC-6 cells (x ? s, n= 4)
组别 Q/
(Lg # mL - 1)
葡萄糖吸收率/
%
N a+ , K+-ATP 酶活性/
(Lmol# mL- 1 )
对照 - 671 59? 11 81 01 582 ? 01 036
藿香 50 711 45? 21 67* 01 555 ? 01 028
苍术 50 731 90? 21 25* 01 679 ? 01 045*
黄柏 10 701 55? 11 86* 01 646 ? 01 086*
石膏 50 581 64? 11 56* 01 565 ? 01 103
与对照组比较: * P< 0105
* P< 01 05 v s cont r ol group
酶 mRNA 表达量的变化:由图 2 可知, 藿香组细胞
的 GLT U2 mRNA 表达量显著高于对照组 ( P <
01 05) ) ,但 SGLT1、Na+ , K+-AT P 酶 mRNA 表达
量无显著变化 ( P> 01 05) ; 苍术组细胞的 SGLT 1
mRNA 相对表达量是对照组的 11 50 倍 ( P <
01 05) , GLTU2、Na+ , K +-AT P 酶 mRNA 相对表
达量分别是对照组的 21 30、11 82 倍 ( P< 01 01) ; 黄
柏组细胞 SGLT 1、Na+ , K +-ATP 酶 mRNA 相对
表达量比对照组显著上升 ( P < 01 01) , GLTU 2
mRNA 与对照组无差异 ( P> 01 05) ;石膏组细胞的
SGLT1、GLT U2、Na+ , K +-ATP 酶 mRNA 相对表
达量与对照组均无显著差异 ( P> 01 05)。
4 讨论
本研究结果显示,藿香、苍术、石膏和黄柏提取
物在一定质量浓度范围内对大鼠 IEC-6 细胞增殖
均具有显著促进作用。这表明藿香挥发油等中药提
取物均可促进大鼠小肠上皮细胞的增殖, 但其促增
殖能力与提取物添加剂量有关。
IEC-6细胞分化后具有小肠上皮细胞的营养消
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与对照组比较: * P < 01 05 * * P < 0101
* P < 01 05 * * P < 01 01 v s cont rol group
图 2 中药提取物对 IEC-6 细胞 SGLT1、GLUT2 和 Na+ , K+-ATP 酶 mRNA 表达的影响 ( x? s, n= 4)
Fig. 2 Effect of Chinese herb extracts on mRNA expression of SGLT1, GLUT2,
and Na+ , K+-ATPase in IEC-6 cells ( x? s, n= 4)
化吸收功能, 因而被国外学者广泛运用于小肠黏膜
修复的细胞、分子和基因机制的研究[ 8] 。本研究测
定了各中药提取物对细胞葡萄糖吸收转运相关载体
基因表达水平的影响。结果显示, SGLT 1、GLU T2
和 Na+ , K +-AT P 酶的基因在大鼠 IEC-6 细胞上均
有表达,这也进一步证实了大鼠 IEC-6 细胞在培养
过程中发生了分化, 具有成熟上皮细胞的营养吸收
转运功能。
本研究结果显示, 不同中药提取物对小肠上皮
细胞葡萄糖吸收的影响并不完全一致, 共中藿香挥
发油、苍术挥发油、黄柏生物碱均可促进葡萄糖吸
收,但石膏水提物对葡萄糖吸收无影响。葡萄糖被
吸收进入小肠细胞主要是依靠定位于刷状缘、与
AT P 酶相偶联的主动转运体系;而胞内葡萄糖则是
通过细胞基底膜的易化转运载体扩散进入血液或组
织间液, 这是一个不需能的被动转运过程[ 9]。
SGLT 1 和 GLUT 2 分别是肠道负责主动转运及异
化扩散的两大主要载体。研究表明, 机体对葡萄糖
的吸收能力与小肠黏膜上这两种转运蛋白的表达量
密切相关, 也在一定程度上依赖着 Na+ , K +-ATP
酶的活性 [ 9]。SGLT1、Na+ , K +-ATP 酶和 GLU T2
的活力决定了小肠转运葡萄糖的效率。其 mRNA
表达量则体现着它们转录水平的变化 [ 10]。本实验
中苍术挥发油与黄柏生物碱可提高 Na+ , K +-ATP
酶的活性,上调 SGLT 1、GLU T2 和 N a+ , K +-ATP
酶基因表达量; 但藿香挥发油对提供细胞能量的
Na+ , K +-AT P 酶的活性及其 mRNA 表达量并无
明显影响。这些结果提示, 藿香、苍术和黄柏 3种提
取物对小肠葡萄糖吸收的影响机制是不一样的, 藿
香挥发油的作用可能是发生在葡萄糖由胞内过基底
膜的易化转运过程, 即影响其膜面转运载体, 而不影
响其腔面转运载体。而苍术和黄柏提取物则可能影
响了小肠对葡萄糖的主动转运过程。
参考文献:
[ 1] 曹曙光, 夏宣平, 王文星, 等1 心理应激对小鼠小肠运动及
血浆、小肠组织中生长抑素和P 物质的影响 [ J]1 世界华人消
化杂志, 2005, 13( 8) : 967-9701
[ 2] 李永渝, 魏 玉, 李莉娟, 等1 藿香、大黄等 CCB中药影响
胃肠运动功能的机制探讨 [ J]1 中国中西医结合外科杂志,
1997, 3( 3) : 187-1901
[ 3] 王自力, 于同泉, 朱晓宇, 等1 中药添加剂对热应激下猪肠
道组织 IL-2, IL-10和黏液 IgA 含量影响 [ J]1 中国兽医杂
志, 2007, 43( 9) : 83-851
[ 4] 宋小珍, 鲁 琳, 刘凤华, 等1 高温应激对仔猪小肠上皮脂
质过氧化的动态影响 [ J]1 动物营养学报, 2008, 20( 1) : 75-
791
[ 5] 张子理, 陈蔚文1 小肠隐窝细胞株 ( IEC-6) :中药生物活性成
分筛选的药理模型 [ J]1 中药药理与临床, 2006, 22( 3、4) :
180-1821
[ 6] Yula S, Ferruz za S, Ranaldi G, et al . Intes tin al cel l cultu re
m od els: Applicat ions in toxicology and pharm acology [ J]1
Ce ll Biol T ox icol , 2001, 17: 301-3171
[ 7] Kaek o M, Noriko M , T eru o K1 In flu ence of fat ty alcohol and
other fatty acid der ivat ives on fatty acid uptake into rat intes-
t inal epithelial cel ls [ J]1 L ip ids, 2001, 36( 1) : 21-261
[ 8] M eng Q, Choudry H A, Souba W W, et al . Regu lat ion of a-
min o acid arginine t ransport b y lipopolysaccharide and nit ric
oxid e in intest inal epith elial IE C-6 cells [ J]1 J Gastr oint est
Su rg , 2005, 9( 9) : 1276-12851
[ 9] Breves G J, S chroder K B1 Transport of nu trients and elec-
t rolytes acros s th e intes tin al w al l in pigs [ J ]1 L iv estoc k S ci ,
2007, ( 109) : 4-131
[ 10] T hw aites D T , Anderson C M H1 H +-coupled n ut rient , m-i
cron ut rient an d drug t ransporters in the mammalian small in-
test ine [ J]1 Ex p Phy siol , 2007, 92( 4) : 603-6191
#1266# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月