全 文 ：表 2 正交试验设计与结果
Table 2 Design and results of orthogonal test
试验
号 A B C D
乌药醚内酯
提取率/ %
浸膏得
率/%
综合评
分/ %
1 1 1 1 1 411 44 71 02 651 16
2 1 2 2 2 571 44 71 95 841 29
3 1 3 3 3 371 34 61 31 581 67
4 2 1 2 3 641 14 91 63 961 67
5 2 2 3 1 651 13 101 32 1001 00
6 2 3 1 2 581 37 91 31 891 83
7 3 1 3 2 611 90 71 86 881 44
8 3 2 1 3 621 59 81 83 921 41
9 3 3 2 1 611 53 81 12 881 95
K 1 2081 11 2501 27 2471 40 2541 11
K 2 2861 50 2761 69 2691 90 2621 55
K 3 2691 79 2371 44 2471 10 2471 74
R 261 13 131 08 71 60 41 94
表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 值 显著性
A 1 1361 38 2 5681 19 301 89 P < 01 05
B 2671 07 2 1331 54 71 26
C 1141 05 2 571 03 31 10
D(误差) 361 78 2 181 39
F 0105( 2, 2) = 191 00
3 讨论
乌药醚内酯测定方法探索时, 进行了确定流动
相的试验,发现甲醇与水组合基线波动大于乙腈与
水的组合,随着乙腈比例的增加,乌药醚内酯的出峰
时间逐渐提前,但与其他成分分离度不理想 , 最后
确定以乙腈-水( 57 B 43)为流动相可使出峰时间与
分离度达到比较理想的状况。
在提取工艺的试验中曾比较过回流提取法与超
声提取法,发现超声提取法得到的浸膏量较少, 不利
于进一步试验, 于是选用回流提取。本实验按最佳
提取工艺放大试验后得到的药材中平均乌药醚内酯
总提取量为 1181 23 mg / 100 g, 与梁汉明等[ 3] 报道
的 CO 2 超临界提取工艺中最大总萃取量 1281 35
mg/ 100 g 相差不大,但本实验的浸膏得率远大于其
萃取的油状物得率,这估计与提取溶剂有很大关系。
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共振瑞利散射法测定粉防己中粉防己碱
孙 艳,王 驰*
(重庆医科大学药学院, 重庆 400016)
摘 要:目的 研究刚果红和粉防己碱的结合反应, 建立测定粉防己碱的新方法。方法 pH 41 0 BR缓冲液中, 刚
果红与粉防己碱通过分子间作用力形成离子缔合物, 使Kex= Kem= 380 nm 波长的共振瑞利散射信号加强。结果
该方法在 01 06~ 01 1 mg / mL 呈线性关系, 检测限为 01 3 Lg / mL。对 6 批粉防己中粉防己碱测定的结果与高效液
相色谱法基本一致。平均回收率为 981 9% , RSD 为 11 71% ( n= 6)。结论 此方法灵敏度高, 稳定性好, 可用于防
己中粉防己碱的测定。
关键词:粉防己; 粉防己碱;共振瑞利散射
中图分类号: R2861 02 文献标识码: B 文章编号: 0253-2670( 2009) 07-1081-03
粉防己碱又名汉防己甲素, 是千金藤属防己科
植物粉防己 Stephania tet r and ra S1 Moor e根中主
要生物活性成分,化学结构属双苄基异喹啉化合物,
有抗心肌、肾缺血、抗高血压、抗肝纤维化、抗肿瘤多
药耐药性、抗缺氧性肺动脉高压等多种药理作用, 特
别是作为一种天然的肿瘤细胞多药耐药逆转剂在肿
瘤防治方面有其良好的应用前景。目前分析粉防己
碱的方法主要是高效液相色谱法[ 1] , 薄层扫描法[ 2]
和紫外分光光度法 [ 3] ,但这些方法操作烦琐,且灵敏
度较低。弹性光散射是指辐射光波长与入射光波长
#1081#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
* 收稿日期: 2008- 09-28 作者简介:孙 艳( 1980 ) ) ,女,陕西丹凤人,重庆医科大学药学院硕士研究生, 2003年毕业于重庆医科大学药学专业, 2003 ) 2005年工作于丽珠集团苏州新宝制药厂技术部,研究课题:靶向 LH-RH 多肽复合物的制备及效果评价。
T el : ( 023) 68485578 E- mail : yanz iyanz i710@1261 com
相同的一类光散射[ 4] 。当散射微粒的尺度远远小于
入射光波长时被称为瑞利散射, 如果这种瑞利散射
位于吸收带附近,则有可能引起散射强度的急剧增
加,此种现象被称为瑞利共振散射或共振光散射
( r esonance light scat tering, RLS )。Pasternack
等[ 5]提出了 RLS 技术用于核酸的测定。近年来, 运
用该技术对核酸[ 6, 7]、蛋白质[ 8, 9] 及无机离子 [ 10]等生
物大分子进行测定已有许多报道。本实验研究了刚
果红与粉防己碱的结合反应, 发现刚果红与粉防己
碱在 pH 41 0的 BR缓冲液中缔合,缔合物的光散射
信号明显增强。实验确定了该反应体系的最佳条
件,并建立了粉防己中粉防己碱测定的新方法。此
方法反应快速、灵敏,操作简单,结果准确。
1 仪器与试药
RF ) 5301荧光分光光度计(日本岛津) ; pHS )
3C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂) ; 美国 Agilent
1100 高效液相色谱仪, gilent 1100 U V 检测器及色
谱数据处理系统。
粉防己碱(自提,经熔点、T LC、HPLC 法鉴定,
质量分数为 98% ) ;粉防己碱对照品, 重庆市药品检
验所馈赠(批号: 0711-200005) ; 粉防己药材购至重
庆储奇门中药材市场。实验所用试剂均为分析纯,
水为二次蒸馏水。
2 方法与结果
21 1 刚果红溶液的配制: 取刚果红适量, 加水配制
为 11 0 @ 10- 4 mol/ L 水溶液,作为染料 CR溶液。
21 2 BR缓冲溶液的配制: 用 01 04 mo l/ L H 3 PO 4、
H 3BO 3、CH 3 COOH 与 01 2 mo l/ L NaOH 溶液按一
定比例混合, 配成 pH 41 0~ 51 0 的缓冲溶液, 并用
酸度计校正其 pH 值。
21 3 实验方法:于10 mL 比色管中依次加入 11 0 mL
BR缓冲溶液,适量粉防己碱对照品溶液和 11 0 mL
CR溶液, 用水稀释至刻度并摇匀,放置 15 min,于荧
光分光光度计以 Kex= Kem= 380 nm 上进行同步扫
描,狭缝宽度为 3 nm。记录共振瑞利散射光谱,再分
别于最大 RLS 波长处测定体系的散射光强度 I 和试
剂空白溶液的散射光强度 I 0 ,计算 $I= I- I 0。
21 4 体系共振散射光谱的比较:Kex= Kem 条件下,
粉防己碱-BR体系的RLS光谱见图 1。可以看出粉
防己碱、CR本身的 RLS 强度都很弱。
粉防己碱带正电荷, 可以和带负电荷的 BR 通
过静电引力形成离子缔合物, 分子截面和折光指数
发生变化, 使体系的 RLS 强度显著增强, 其最大
RLS波长均位于 380 nm 附近, 并且散射强度 ( $I )
波长/ nm
图 1 粉防己碱、CR及其体系的 RLS光谱
Fig. 1 RLS Spectra of tetrandrine, CR,
and tetrandrine-CR
随药物浓度增大而增强, 0、01 2、01 4、01 6 mg/ mL 粉
防己碱与 1 @ 10- 4 mol/ L BR的 RLS 光谱见图 2。
可见方法有高灵敏度, 因此可用于粉防己碱的测定。
波长/ nm
图 2 不同质量浓度粉防己碱与 CR 组成体系的 RLS
光谱
Fig. 2 RLS Spectra of tetrandrine with different
concentration and tetrandrine-CR
21 5 适宜反应条件
21 51 1 酸度的选择: 当溶液 pH 值在 41 0~ 51 0 ,
1 @ 10- 4 mo l/ L BR缓冲液的 $I 基本不变, 而粉防
己碱- CR缔合物在 pH 41 0~ 51 0, $I 最大且基本不
变。本实验选 pH 41 0的 BR缓冲液控制反应酸度。
实验表明:其用量大于 11 0 mL 时, 缔合物的 $I 基
本不变。因此实验选择缓冲溶液用量为 11 0 mL。
21 51 2 配体的选择:分别考察了甲基橙、曙红 Y、刚
果红与粉防己碱结合反应的 RLS光谱,结果只有刚
果红-粉防己碱体系的 RLS 强度明显增强。本实验
选用刚果红作为配体, 发现刚果红浓度较小时, 不能
与粉防己碱充分结合, $I 值较小, 当浓度为 11 0 @
10
- 4
mol/ L 时, $I 值达到最大且稳定, 因此实验选
择其浓度为 11 0 @ 10- 4 mol/ L。
21 51 3 试剂的加入顺序: 结果表明,加入顺序为缓
冲溶液、粉防己碱溶液、刚果红溶液时, 体系的 $I
最大且稳定。
21 51 4 反应温度及稳定性:试剂空白的 RLS 强度
不随时间的变化而变化,而 CR与粉防己碱结合物
的 RLS 强度在 15 min 之后达到最大,在室温下能
#1082# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
稳定 12 h,然后缓慢下降。在 40 e 水浴中温育 5 h
后发现强度下降, 温育 12 h 后出现蓝色沉淀, 强度
进一步下降。因此实验反应时间为 30 m in。
21 51 5 共存物质的影响: 在粉防己碱质量浓度为
100 Lg/ mL 时,研究多种常见金属离子对反应的干
扰作用,结果见表 1。结果表明多种常见金属离子
对测定的干扰很小。
表 1 共存物质对测定结果的影响
Table 1 Effects of coexist substances on results
共存物质 质量浓度/ ( mg # L- 1) RLS强度变化/ %
Cl- 1 11 50 31 9
SO4 2- 01 90 51 0
M g( Ò ) 01 90 - 21 0
Cu ( Ò ) 01 90 21 3
Zn( Ò ) 01 90 - 21 3
K( Ñ ) 11 50 61 9
NH 4
+ 01 45 21 4
21 6 标准曲线的绘制: 在选择的最佳试验条件下,
以不同质量浓度的粉防己碱按实验方法操作, 并以
$I 对粉防己碱的质量浓度作图, 绘制标准曲线, 结
果粉防己碱在 01 06~ 01 1 mg/ mL 时散射光强度与
质量浓度呈线性关系, 其回归方程为 I = 01 173 9
C- 01 028 2, r= 01 999 7。
21 7 方法的灵敏度: 实验中采用 RLS 法检出限为
01 3 Lg/ mL。可见 RLS 法具有较高的灵敏度。
21 8 精密度试验: 取 01 1 mg/ mL 的粉防己碱对照
品溶液,连续测定 5次峰面积值,计算,结果 RSD为
11 67%。
21 9 重现性试验:取粉碎后混合均匀的粉防己样品
5份,制备供试品溶液, 依法测定,计算粉防己碱的
质量分数,结果 RSD为 21 07%。
21 10 稳定性试验: 取同一供试品溶液, 室温放置,
在 0、2、4、6、8 h 后进样测定, 计算粉防己碱的峰面
积,结果 RSD为 41 57%。
21 11 测定结果:取防己药材约11 0 g, 精密称定, 制
备供试品溶液, 测定, 6 批防己药材中粉防己碱进
测定结果见表 2。可见 RLS 法的测定结果与高效
液相色谱法 [ 1] 基本一致, 因此可以用此方法对粉防
己碱进行测定。
3 讨论
实验中发现, 影响实验结果的因素较多, 其中
pH 值是一个关键因素。在 pH 41 00时,粉防己碱
能被充分质子化形成大阳离子, 与染料CR结合后
表 2 粉防己中粉防己碱的测定结果
Table 2 Determination of tetrandrine
批号 粉防己碱/ %
H PLC法 RLS 法
1 11 12 11 11
2 11 23 11 20
3 11 15 11 17
4 11 25 11 19
5 11 22 11 18
6 11 19 11 22
使 RLS 信号增强且稳定。另外,加入顺序对散射强
度也有明显的影响。原因可能是, 与其他加入顺序
相比,粉防己碱能被更充分的质子化形成大阳离子。
CR与粉防己碱缔合物的 RLS 强度在 15 m in 之后
达到最大, 在室温下能稳定 12 h, 然后缓慢下降。
在 40 e 水浴中温育 5 h后发现强度下降,温育 12 h
后出现蓝色沉淀,强度进一步下降。说明温度对反
应也有明显的影响, 本实验适宜在室温条件下反应
30 m in进行测定。
由于共振瑞利散射是瑞利散射位于或接近于散
射分子吸收带时所产生的一种特殊的散射,其散射
强度比单纯的瑞利散射提高了几个数量级,并且不
再遵循 I W1/K4 的瑞利定律,因此它是一种共振瑞
利散射,这是散射增强的一个重要原因。
参考文献:
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