全 文 ：明显减慢 [平均清除率为 4129 mL/ ( h ·kg) ]。根
据文献报道[14 ] ,当 PEG2rh G2CSF 剂量为 100μg/
kg 时 ,一周只需要 sc 1 次 ,就可以达到持续升高中
性粒细胞的临床效果 ;与每天注射 5μg/ kg 的 rh G2
CSF ,连续注射 1 周的效果相同。本实验结果也证
明了这一长效作用。
314 　与国外同类产品 Pegfilgrastim 比较 : Pegfil2
grastim ( PEG 化重组人粒细胞集落刺激因子) 是
美国 Amgen 公司的同类产品。据文献报道[15 ,16 ] ,3
例临床非小细胞肺癌病人化疗后 24 h 按 100μg/
kg 剂量单次 sc Pegfilgrastim 后的平均半衰期为
3312 h (30. 3～53. 8 h) ,平均清除率为 1410 mL/
(h ·kg) [412～1518 mL/ (h ·kg) ] ;而本实验 4 例
病人化疗后 48 h 单次 sc 同剂量 ( 100 μg/ kg)
PEG2rh G2CSF ,平均半衰期为 4517 h (34. 7～58. 2
h) ,平均清除率为 3136 mL/ ( h ·kg) [ 2196～3167
mL/ (h ·kg) ]。两者比较 ,本实验结果的半衰期更
长 ,清除率更低 ,这可能是个体差异或药物本身差异
所致 ,其所显示的更强的长效和临床意义有待进一
步研究。
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红花注射液对肝星状细胞 HSC2T6 增殖、凋亡
及凋亡相关基因表达的影响
刘 　珺 ,徐选福 ,杨文娟 ,郭传勇 3
(同济大学附属第十人民医院 消化科 ,上海 　200072)
摘 　要 :目的 　研究红花注射液对肝星状细胞 ( hepatic steuate cell , HSC) HSC2T6 增殖、凋亡及凋亡相关基因
bcl22 及 bax mRNA 表达的影响。方法 　体外培养 HSC 株 ,用不同质量浓度的红花注射液处理 HSC2T6 ,采用
·0721· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008210216　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家重点基础研究发展计划“973 计划”资助项目 (2006CB504810) ;上海市自然科学基金资助项目 (06ER14090)
作者简介 :刘　珺 (1982 —) ,女 ,山西省洪洞县人 ,博士 ,讲师 ,研究方向为中西医结合消化系统疾病诊治。
Tel : 13816951240 　E2mail : liujun19820124 @yahoo. com. cn3 通讯作者　郭传勇　E2mail : guochuanyong @sina. com
M T T 法检测细胞增殖 ;采用 5、10、20 mg/ mL 红花注射液干预细胞 24 h ,流式细胞仪检测细胞周期 ;倒置显微镜下
观察细胞凋亡形态学改变 ;并用琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA Ladder 凋亡梯度 ; Annexin V2FITC/ PI 双染色流式
细胞仪分析凋亡率 ;Real time2RT PCR 检测凋亡相关基因 bcl22、bax mRNA 的表达水平。结果 　红花注射液对
HSC 增殖有明显的抑制作用 ,且作用呈剂量和时间依赖性 ;红花注射液 (10、20 mg/ mL) 作用 24 h 流式细胞术测
出 G0 / G1期细胞所占比例增多 ,与对照组比较差异显著 ( P < 0105、0101) ;药物干预后细胞表现不同程度的凋亡 ,
琼脂糖电泳可见 DNA 出现断裂、PI/ Annexin V 双染流式细胞仪分析对照组凋亡率为 (0173 ±0133) % ,红花注射
液在 5、10、20 mg/ mL 凋亡率分别为 (2104 ±0158) %、(9146 ±1129) %、(16155 ±1127) % ,差异显著 ( P < 0101) ;
Real time2RT2PCR 结果显示红花下调抗凋亡基因 bcl22 的 mRNA 表达 ,同时上调 HSC2T6 的促凋亡基因 bax 的
mRNA 表达。结论 　红花注射液能抑制 HSC 增殖及增殖周期 ,促进活化的 HSC 凋亡 ,其机制可能是调控 bcl22/
bax mRNA 的表达。
关键词 :红花注射液 ; 肝星状细胞 ; 增殖 ; 凋亡 ; bcl22/ bax
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821270205
Effect of Safflower Injection on proliferation , apoptosis , and expression of bcl22 / bax gene
in hepatic stellate cell in vit ro
L IU J un , XU Xuan2f u , YAN G Wen2juan , GUO Chuan2yong
(Department of Gast roenterology , Tenth People′s Hospital of Tongji University , Shanghai 200072 , China)
Abstract : Objective 　To investigate t he effect s and mechanism of Safflower Injection on the prolifera2
tion , apoptosis , and expression of bcl22/ bax gene in hepatic stellate cell ( HSC) i n vi t ro. Methods 　HSC
Line HSC2T6 was incubated wit h Safflower Injection at different concert ration , cell p roliferation was
assessed by M T T colorimet ric assay. After incubated with Safflower Injection 5 , 10 , and 20 mg/ mL , flow
cytomet ry ( FCM) was used to detect t he content of DNA in HSC2T6. Morp hological change of HSC2T6
was observed under microscope and agarose gel elect rop horesis for DNA Ladder was used to detect apopto2
sis. Besides , t he early stage of apoptosis was detected wit h Annexin V2FITC/ PI double labbled assay.
And real time R T2PCR was used to detect t he expression of bcl22/ bax gene. Results 　The significant inhi2
bition of Safflower Injection on HSC proliferation was observed in a dose2 and time2dependent manner .
Observed by FCM , the cell ratio in G0 / G1 p hase wit h Safflower Injection t reat ment (10 and 20 mg/ mL )
for 24 h was increased , which showed t he significant difference compared wit h the cont rol group ( P < 0105
and 0. 01) . Microscopy showed t hat nucleolus disappeared , chromatin condensed , arranged along side the
nuclear membrane and agarose gel elect rop horesis showed DNA f ragmentation. Besides , af ter t reated wit h
Safflower Injection at different concert ration of 5 , 10 , and 20 mg/ mL for 24 h , t he apoptosis rate were
(2. 04 ±0. 58) % , (9. 46 ±1. 29) % , (16. 55 ±1. 27) % , respectively , which was significantly higher t han
that in cont rol group (0. 73 ±0. 33) % ( P < 0101) . The gene expression of bax was up2regulated and t hat
of bcl22 was down2regulated after t reatment wit h Safflower Injection. Conclusion 　Safflower Injection
could prevent hepatic fibrosis mainly through inhibiting proliferation and promoting apoptosis of HSC. The
mechanism may involve bcl22/ bax pathway.
Key words : Safflower Injection ; hepatic stellate cell ( HSC) ; p roliferation ; apoptosis ; bcl22/ bax
　　近年来学者对红花及其复方制剂有效成分在慢
性肝病临床治疗中的作用进行了深入研究 ,已得到
广泛共识 ,并通过动物实验证实了其具有抗肝纤维
化的作用 ,但其机制尚未完全阐明。肝星状细胞
(hepatic stellate cells , HSCs) 在肝纤维化的病理
生理过程中起着关键作用 ,是肝纤维化发生的中心
环节[1 ,2 ] 。红花抗纤维化作用是否参与抑制 HSCs
活化 ,目前尚无定论 ,因此 ,本研究观察了红花注射液
对 HSC2T6 细胞增殖和凋亡的影响 ,为进一步从细胞
水平探讨红花抗肝纤维化作用的机制提供理论依据。
1 　材料与方法
111 　材料 : HSC2T6 细胞株 ,由新华医院消化病研
究所李定国教授馈赠 ,为活化的 HSC。红花注射液
(批号 070904) 为山西康宝生物制品股份有限公司
产品 ,每支 5 mL ,含生药 015 g/ mL 。DM EM 培养
基 ,胎牛血清 , Gibico 公司 ; M T T、DMSO 为北方同
正生物技术发展公司产品 ; PI/ Annexin V 双染荧光
标记凋亡检测试剂盒 ,北京宝赛生物公司。EL X800
酶标计数仪 ,Bio2Tek 公司生产 ;倒置显微镜及成像
系统 ,日本 Olymp us 生产 ;流式细胞仪 ,美国 BD2
FACS Calibur 生产 ;Light Cycler Real Time PCR
扩增仪 , Roche Diagnostics 公司 ; SYBR ExScript
·1721·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
R T2PCR Kit , TA KA RA 公司。
112 　复苏冻存细胞株 : 用含 10 % 胎牛血清的
DM EM 培养基常规培养 ,倒置显微镜下观察细胞 ,
待细胞生长状态良好 ,并且细胞数目在 1 ×109 / L
以上时 ,将细胞传代。
113 　M T T 检测 HSC2T6 数目 :将细胞生长状态良
好 ,并且细胞数目在 1 ×109 / L 以上的培养瓶中的
细胞接种在 96 孔板中 ,接种密度为 1 ×106 / mL ,每
孔 200 μL ,设正常对照组 ,在加入含红花注射液
215、5、10、20、40 mg/ mL 的 DM EM 培养液中培养
24、48、72 h 后 ,各组 HSC2T6 (每组设有 3 个复孔 ,
重复 3 次) 中加入 M T T 50μL ,继续培养 4 h 后 ,
弃上清液 ,加入 DMSO 100μL ,震荡 10 min ,上酶
标仪于 490 nm 波长处测吸光度 ( A ) 值 ,代表各孔
的细胞数。
114 　细胞周期时相检测 :将传代的 HSC2T6 接种
于 6 孔培养板中 ,接种密度为 1 ×106 / mL ,每孔 2
mL ,生长至 80 % 以上融合度时 ,先弃去培养基 ,
PBS 冲洗两次 ,014 % 胎牛血清培养基同步化处理
48 h 后 ,实验组加不同质量浓度 (5、10、20 mg/ mL)
的红花注射液 ,各组细胞在 CO2培养箱中继续培养
24 h 后取样。取样方法 :用 0125 % 胰酶消化细胞 ,
吹打使其分散成单个细胞 ,用 PBS 离心洗涤两次 ,
调节每个样品细胞数约为 2 ×106 / mL ,用微量移液
器通过 350 目尼龙网注入 70 % 冷乙醇中 ,4 ℃固
定。测定前离心倒掉乙醇 , PBS 洗一遍后用 PI 染
色 2 h ,4 ℃避光 30 min ,上机检测 ,每次设 3 个复
孔 ,重复 3 次。
115 　细胞凋亡形态学观察及 DNA 凋亡 ladder 条
带检测 :将传代的 HSC 接种于两个培养瓶中 ,接种
密度为 1 ×106 / mL ,接种 5 mL 于 50 mL 培养瓶中
分别为对照组和实验组 ,生长至 80 % 以上融合度
时 ,先弃去培养基 , PBS 液冲洗两次 ,加入 5、10、20
mg/ mL 红花注射液 ,各组细胞在 CO2 培养箱中继
续培养 24 h ,在倒置显微镜下观察各组细胞凋亡形
态学改变 ,后用冰 PBS 刮取细胞 ,蛋白酶消化 ,酚氯
仿法提取细胞 DNA ,2 % 琼脂糖凝胶电泳 ,自动凝
胶成像系统拍照。
116 　Annexin V2FITC/ PI 双染法检测细胞凋亡
率 :取对数生长期细胞接种于 6 孔板过夜后 ,弃去
原培养液 ,加入 5、10、20 mg/ mL 的药物 ,继续培养
24 h ,PBS 洗涤细胞 1 次 ,用结合缓冲液 195μL ,加
5μL Annexin V2FITC , 混匀 , 室温避光孵育 15
min ,具体操作步骤按试剂盒说明进行 ,用流式细胞
仪检测细胞凋亡率。
117 　实时荧光定量聚合酶链反应 ( real time quan2
titative PCR) 检测 bcl22 及 bax mRNA 的表达 :相
关引物均由上海生工公司合成 , GA PD H :正向引物
为 5′2A TCACT GCCACTCA GAA GAC23′; 反向引
物为 5′2GCA TCAAA GGT GGAA GAA T23′; bcl22 :
正向引物为 5′2GCA GA GA T GTCCA GTCA G23′;
反向引物为 5′2GCCA TA TA GT TCCACAAA GG2
3′;bax : 正向引物为 5′2A T T GGA GA T GAACT G2
GACAA T23′; 反 向 引 物 为 5′2CCACAAA GA T2
GGGCACT GTC23′。用 5、10、20 mg/ mL 红花注射
液干预细胞 24 h 后 ,细胞总 RNA 的提取参照 Tr2
izol 说明书进行 ,以 oligod T 为引物将提取的总
RNA 反转录 ,采用 20 μL 反应体系 ,应用 Light
Cycler (Roche Diagnostics 公司) 制备标准曲线 ,验
证内参及目的基因扩增效率一致后 ,采用两步法对
bcl22、bax 及内参照 GA PD H 分别同时进行实时荧
光定量 PCR 扩增。反应条件 :预变性 95 ℃、10 s ,
20 ℃/ s ,1 个循环 ; PCR 反应 95 ℃、5 s ,20 ℃/ s ;
60 ℃、20 s , 20 ℃/ s ,35 个循环 (退火温度 , GA P2
D H、bcl22 均 54 ℃, bax 为 50 ℃) ;融解曲线分析
95 ℃、0 s ,20 ℃/ s ;65 ℃、15 s ,20 ℃/ s ;95 ℃、0 s ,
011 ℃/ s。扩增结果以ΔCt 值进行表示 ,目的基因
相对表达量 = 2 - ΔΔCt ,其中 ΔΔCt = 目的基因ΔCt
值 - 内参 GA PD HΔCt 值。
118 　统计学方法 :结果以 x ±s 表示 ,组间比较采
用 t 检验、单因素方差分析和多重比较等 ,由 SPSS
1310 软件进行统计分析。
2 　结果
211 　红花注射液对 HSC2T6 增殖的影响 :各质量
浓度的红花注射液对 HSC2T6 增殖均有抑制作用 ,
且有时间和剂量依赖性。见表 1。
表 1 　红花注射液对 HSC2T6 增殖的影响 ( x ±s , n = 9)
Table 1 　Effect of Safflower Injection on proliferation
of HSC2T6 cells ( x ±s , n = 9)
组别
ρ/
(mg ·mL - 1 )
A 值
24 h 48 h 72 h
对照 - 1108 ±0103 1126 ±0105 1147 ±0103
红花注射液 　　215 0187 ±0105 3 3 1100 ±0107 3 3 1108 ±0110 3 3
5 0152 ±0107 3 3 0156 ±0104 3 3 0162 ±0109 3 3
10 0155 ±0112 3 3 0145 ±0105 3 3 0147 ±0106 3 3
20 0141 ±0102 3 3 0138 ±0103 3 3 0124 ±0102 3 3
40 0162 ±0106 3 3 0138 ±0106 3 3 0126 ±0106 3 3
　　与对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
212 　红花注射液对 HSC2T6 细胞周期的影响 :从
流式细胞仪结果可以看出红花注射液在 10、20 mg/
·2721· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
mL 时 , G0 / G1期细胞所占比例增多 ,与对照组比较 ,
差异显著 ( P < 0105) ;而 S + G2 / M 期细胞减少 ,与
对照组比较差异显著 ( P < 0101) ;以阻止细胞于
G0 / G1期 ,说明红花注射液能抑制细胞 DNA 的合
成。见表 2。
表 2 　红花注射液对 HSC2T6 细胞周期分布的影响
( x ±s , n = 9)
Table 2 　Effect of Safflower Injection on cell cycle
distribution of HSC2T6 cells ( x ±s , n = 9)
组别
ρ/
(mg ·mL - 1)
细胞周期/ %
G0/ G1 S + G2/ M
对照 　- 551 41 ±2154 441 36 ±2154
红花注射液 　5 571 45 ±4106 401 25 ±3171
10 601 24 ±3194 3 371 23 ±5133 3 3
20 631 01 ±2105 3 3 361 51 ±2117 3 3
　　与对照组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01
　　3 P < 0105 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
213 　倒置显微镜观察凋亡细胞形态学改变及细胞
DNA 凋亡 ladder 条带 :对照组细胞生长较好 ,形态
饱满 ,较少见到皱缩变圆 ,折光率增强的细胞。20
mg/ mL 红花注射液与细胞培养 24 h 后 ,细胞常规
光镜下观察 ,可见散在凋亡细胞 ,表现为细胞皱缩变
圆、细胞膜出泡、出现凋亡小体 ,核质比增大 ,核变
形、皱缩 ,核染色质浓聚或呈月牙形边聚 ,5、10 mg/
mL 红花注射液组细胞也出现了不同程度的形态学
改变。此外 ,和对照组相比 ,红花注射液作用 24 h
后 , HSC2T6 细胞的基因组 DNA 出现了明显的凋
亡梯度改变 (图 1) ,说明在红花注射液作用下 ,部分
HSC2T6 细胞发生了凋亡。
M2100 bp DNA Ladder 　A2对照组
B～D2红花注射液 5、10、20 mg ·mL - 1组
M2100 bp DNA Ladder 　A2cont rol groups
B —D2Safflower Injection 5 , 10 , and 20 mg ·mL - 1 groups
图 1 　红花注射液作用后 HSC2T6 细胞的 DNA ladder
Fig. 1 　DNA Ladder of HSC2T6 cells treated
with Safflower Injection
214 　红花注射液对细胞凋亡率的影响 : 5、10、20
mg/ mL 红花注射液作用于体外培养的活化的
HSC2T6 后 ,经 Annexin V 和 PI 双染上流式细胞
仪检测 ,结果表明药物作用后早期凋亡的细胞增多 ,
说明红花注射液有促进活化的 HSC2T6 早期凋亡
的作用 ,对照组凋亡率为 (0173 ±0133) % ,红花注
射液 5、10、20 mg/ mL 组凋亡率分别为 (2104 ±
0158) %、(9146 ±1129) %、(16155 ±1127) % ,给药
组与对照组比较 ,差异显著 ( n = 9 , P < 0101) ,表明
红花注射液可诱导 HSC2T6 凋亡 ,且随药物质量浓
度增加 ,凋亡率升高。
215 　红花注射液干预 HSC2T6 细胞后 bcl22 和
bax mRNA 表达水平差异 :结果表明 ,经红花注射
液 5、10、20 mg/ mL 干预后 , HSC2T6 细胞中 bcl22
mRNA 表达显著降低 ( P < 0105、0101) ; bax mR2
NA 表达明显升高 ( P < 0105、0101) ,见图 2。
与对照组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 01 013 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
图 2 　红花注射液对 HSC2T6 细胞 bcl22 ( A)和 bax ( B)
mRNA 表达的影响 ( x ±s , n = 9)
Fig. 2 　Effect of Safflower Injection on mRNA
expression of bcl22 ( A) and bax ( B)
of HSC2T6 cells ( x ±s , n = 9)
3 　讨论
　　已有研究证实 , HSC 是肝纤维化时细胞外基质
过多产生和沉积的主要来源细胞 ,它的活化增殖是
肝纤维化形成的关键。因此 ,抑制 HSC 的增殖是
抗肝纤维化的重要策略之一 ,阻断 HSC 的活化增
殖、促进其凋亡可有效抑制肝纤维化的形成[3 ,4 ] 。
本实验研究了红花注射液对 HSC 活化增殖和
增殖周期的影响。结果显示 ,药物各剂量组吸光值
均低于对照组 ,其差异有显著性 ,提示红花注射液能
明显抑制 HSC 的增殖 ,且抑制程度与药物剂量呈
依赖关系 ,但它抑制细胞增殖的哪一个环节尚不清
楚。因此 ,进一步进行了细胞周期的检测 ,结果显
·3721·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
示 ,药物作用后 G0 / G1 期 HSC2T6 不能向 M 期过
度 ,造成 G0 / G1期细胞堆积。
诱导 HSC 的凋亡也是减少 HSC 数目的途径
之一。本实验研究了红花注射液对活化的 HSC2T6
细胞凋亡的影响。研究发现药物干预后细胞出现
DNA 断裂 ,细胞膜出泡、内陷等细胞凋亡的典型特
征。PI/ Annexin V 双染色流式细胞仪测定结果表
明红花注射液能诱导 HSC 凋亡 ,且作用呈剂量依
赖性。Gong 等[ 5 ,6 ]实验表明 , HSC 与 MFB 对 Fas
诱导凋亡的不同表达是由于二者 bcl 基因家族的表
达不同 ,静止的 HSC 强烈表达抗凋亡基因 bcl22 和
bcl2xL ,而活化的 HSC 的 bcl22 和 bcl2xL 表达明显
下降 ,且促凋亡基因 bax 的表达增加。(bcl22 + bcl2
xL) / bax 值下降 , 从而引起 Fas 诱导的凋亡发
生[ 7～9 ] 。本实验结果发现红花注射液使 bcl22/ bax
值明显下降 ,说明其可通过下调抗凋亡基因 bcl22
和上调促凋亡基因 bax 的表达来促进活化的 HSC2
T6 的凋亡。
本实验结果对进一步研究红花用于肝纤维化治
疗提供了基础实验依据。
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姜黄素抗血吸虫病肝纤维化及其机制的实验研究
谌 　辉1 ,张景辉2 ,刘文琪3 3
(11 华中科技大学同济医学院附属协和医院 传染科 ,湖北 武汉 　430022 ; 21 华中科技大学同济医学院附属协和医院
外科实验室 ,湖北 武汉 　430022 ; 31 华中科技大学同济医学院 寄生虫学研究室 ,湖北 武汉 　430030)
摘 　要 :目的 　探讨姜黄素抗血吸虫病肝纤维化的作用及可能机制。方法 　小鼠随机分为 4 组 :对照组、感染模型
组、吡喹酮治疗组和姜黄素治疗组 ,除对照组外 ,各组建立血吸虫病肝纤维化小鼠动物模型 ,用实时荧光定量 PCR
反应观察小鼠肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ( PPARγ) mRNA 的表达。应用 H E 染色 ,免疫组化法及多
媒体病理图文定量分析 ,观察各组小鼠肝脏的病理改变及转化生长因子β1 ( T GF2β1 ) ,α2平滑肌肌动蛋白 (α2SMA)
和 Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的变化。结果 　姜黄素可显著减轻肝脏纤维组织增生。感染模型组及吡喹酮治疗组 PPARγ
mRNA 表达较对照组及姜黄素治疗组显著减弱 ( P < 0105) ;姜黄素治疗组 T GF2β1 ,α2SMA 及 Ⅰ、Ⅲ型胶原水平均
明显低于吡喹酮治疗组和感染模型组 ( P < 0105) 。结论 　姜黄素有明显的抗日本血吸虫病肝纤维化作用 ,其抗纤
维化机制与其激活 PPARγ的表达、抑制肝星状细胞 ( HSC) 表达α2SMA 及分泌 T GF2β1 ,并减少 Ⅰ、Ⅲ型胶原的
合成有密切关系。
关键词 :姜黄素 ; 肝纤维化 ; 血吸虫病 ; 过氧化物酶体增殖物激活受体γ( PPARγ)
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821274204
·4721· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008210227　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :谌　辉 (1972 —) ,女 ,湖北省武汉市人 ,主治医师 ,博士 ,主要研究方向为慢性肝病及肝纤维化。
Tel : (027) 85726132 　E2mail : chenhui0515 @yahoo. com. cn