全 文 ：盾叶薯蓣四倍体的鉴定和薯蓣皂苷元的定量分析
谢彩侠1 ,史会齐1 ,高山林2 ,白　雨3 ,赵　颖3＊
(1.河南中医学院药学院 , 河南 郑州　450008;2.中国药科大学中药学院 ,江苏 南京　210038;
3.天津天士力集团研究院 , 天津　300410)
摘　要:目的　提高盾叶薯蓣药材的品质。方法　采用高效液相色谱法 , 对组织培养条件下诱导获得的盾叶薯蓣
四倍体株系试管苗薯蓣皂苷元的量和部分株系一年生田间苗薯蓣皂苷元的量进行了分析 ,并对部分株系一年生田
间苗农艺性状进行了鉴定。结果　经诱导获得的四倍体株系试管苗与对照相比薯蓣皂苷元的量有较大差异;而且
四倍体株系试管苗与一年生苗薯蓣皂苷元的量有较强的相关性 ,大部分四倍体株系表现出典型的多倍体性状。结
论　在组织培养的基础上 , 利用多倍体育种来改善盾叶薯蓣的品质是可行的。
关键词:盾叶薯蓣;同源四倍体;农艺性状;薯蓣皂苷元
中图分类号:R282.6　　　文献标识码:A　　　文章编号:0253-2670(2009)08-1314-03
　　盾叶 薯蓣 Dioscorea z ingiberensis C.H.
Wright 属薯蓣科薯蓣属根状茎 ,又名黄姜 、火头根 ,
其根茎内薯蓣皂素的量一般为 2%左右 ,是目前世
界上最好的激素类药源植物。同时具有清肺止咳 、
利湿痛淋 、通络止痛 、解毒消肿的功能 ,可治肺热咳
嗽 、湿热淋痛 、风湿腰痛 、痈肿恶疮 、跌打扭伤 、蜂螯
虫咬;其水溶性甾体皂苷成分对心肌缺血 、胸痹 、高
脂血症等有明显治疗作用。
盾叶薯蓣是我国特有资源植物 ,是世界上薯蓣
皂素量最高的种类 ,最高单株达到 16.5%,超过了
世界王牌———墨西哥小穗花薯蓣 15%的纪录。据
调查我国 10个省市都有盾叶薯蓣分布 ,其中湖北 、
湖南 、陕西 、四川分布最为集中 ,目前在陕西安康地
区 、湖北郧西地区 、湖南安化地区 、河南南阳地区都
有一定规模的种植面积。实现人工栽培后 ,虽然解
决了皂素供应问题 ,而黄姜原料依旧短缺 ,主要原因
是产量低 、皂素量变化较大 ,质量难以控制 。因此有
必要进行品种选育和提纯复壮的工作 。植物多倍体
研究已有报道[ 1] ,鉴于此 ,笔者利用组织培养技术进
行了盾叶薯蓣多倍体诱导技术的研究 ,进行盾叶薯
蓣多倍体新品种的选育 ,以期最终选育出含有效成
分量高 ,根部药材产量高的优良品种 ,从而使多倍体
所具有的根茎叶巨大型性在药材生产中得以应用。
1　材料与方法
1.1　材料来源:盾叶薯蓣原植物采自江苏省中国科
学院植物所植物园 ,经秦惠贞 、丁志遵研究员鉴定为
盾叶薯蓣。选取幼嫩的盾叶薯蓣叶片和茎段 ,肥皂
水清洗 15 min ,用流水冲洗 1 h 左右 ,在超净工作
台上 ,先在 75%酒精中浸泡 30 s ,再放入 0.1%升
汞溶液中(加 3 ～ 5 滴聚山梨酯-20)消毒 15 min ,
无菌水冲洗 5 次。接种在含 BA 0.1 mg/ L +病毒
唑 5.0 mg/L 的 MS 培养基上 ,得到无菌试管苗作
为试验材料。
1.2　多倍体的诱导:采用 3因素 4 水平的正交实
验 ,将盾叶薯蓣幼芽浸泡在秋水仙素质量浓度 (%)
为 0.2 、0.3 、0.4 、0.5;浸泡时间 T 为 12 、24 、36 、
48 h;培养基中添加秋水仙素的浓度(10-6)为 0 、
20 、40 、60 的不同处理中 ,每处理 25 棵芽 ,每瓶接 5
棵芽 。培养一个月后统计各处理芽的死亡率 ,将存
活芽转接到 MS +BA 0.05 mg/L +病毒唑 5.0
mg/L 培养基中 ,使其分化成苗 ,继代培养 ,建立株
系并编号 。
1.3　试管苗的生根和染色体的鉴定:将处理得到的
各株系接种在 1/2 MS +IAA 0.5 mg/L +病毒唑
5.0 mg/L 培养基上诱导生根 , 待根长至 0.5 ～
1.0 cm 时切取根尖 ,做染色体鉴定 ,结果见图 1 ,经
3次以上观察确认为四倍体的株系予以保留并扩大
繁殖 。
1.4　盾叶薯蓣试管苗薯蓣皂苷元的测定[ 2 ～ 5]
1.4.1　色谱条件:Ag ilent 1100 Series 高效液相色
谱仪;Micro sorb-MV100 C18(250 mm ×4.6 mm ,
5μm)色谱柱;流动相:无水甲醇;进样量 10 μL ,
体积流量 1.0 mL/min ,检测波长 203 nm ,柱温为
室温 。
·1314· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 8 期 2009年 8月
＊ 收稿日期:2008-12-28　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作者简介:谢彩侠(1977—),女 ,河南内乡人 ,讲师 ,博士 ,长期从事中药质量控制研究的教学 、科学工作 ,已发表论文 15篇 ,获奖 2项。
Tel:13673651577　E-mail:nanyang.x cx@163.com
1.4.2　线性关系考察:精密称取薯蓣皂苷元对照品
(由中国药品生物制品检定所提供 , 质量分数 >
98.8%)2 mg ,用无水乙醇配成质量浓度为 1.0
mg/mL 的对照品溶液 。精密吸取对照品溶液 1 、2 、
4 、6 、8 、10μL ,按上述 HPLC 色谱条件测定峰面积 ,
以峰面积积分值为纵坐标 ,进样量为横坐标进行回
归处理 ,得回归方程为 Y =-3.524 1+64.87 X ,
r=0.997 8 ,线性范围 1.0 ～ 10.0μg 。
1.4.3　样品制备及定量测定:盾叶薯蓣试管苗在
1/2 M S+IAA 0.2 mg/ L+NAA 0.2 mg/ L 培养基
上诱导生根 ,待苗长至 30 ～ 35 d ,洗净根上的培养
基 ,将根剪掉 ,在 60 ℃下烘干 ,粉碎 ,过 60目筛 ,精
密称取盾叶薯蓣粉末 1.5 ～ 2.0 g ,置于三角瓶中 ,
加 2.0 mol/ L 的硫酸 50 mL ,在 100 ℃水解 4 h ,
放冷滤过 ,药渣用蒸馏水洗至中性 , 60 ℃干燥后 ,
用石油醚(60 ～ 90 ℃)50 mL 索氏提取 5 h ,提取液
回收至干 ,用无水乙醇溶解 ,滤过置 5 mL 量瓶中 ,
用无水乙醇定容 ,得供试品溶液。以上述色谱条件
作 HPLC 分析 ,样品中薯蓣皂苷元与其他成分达到
良好分离(图 1),以外标 1点法计算各样品中薯蓣
皂苷元的量。
1-薯蓣皂苷元
1-diosgenin
图 1　薯蓣皂苷元对照品(A)和盾叶薯蓣样品(B)的
RP-HPLC图谱
Fig.1　RP-HPLC Chromatogram of diosgenin reference sub-
stance(A)and sample of D.zingiberensis(B)
1.5　盾叶薯蓣试管苗的移栽试验:于 4月份将盾叶
薯蓣试管苗接种在生根培养基上 ,30 d 后开瓶在室
温下炼苗 2 ～ 3 d。取出小植株 ,洗去根上的培养
基 ,傍晚时将苗栽入以珍珠岩-煤渣 (1∶3)为基质
的苗床中 ,每日喷雾 2 h ,在苗床中生长约 40 d 后移
栽至田间 。
1.6　盾叶薯蓣部分四倍体植株薯蓣皂苷元定量测
定和农艺性状的初步鉴定
1.6.1　材料:由于盾叶薯蓣试管苗移栽成活率较
低 ,导致一年生四倍体株系材料有限 ,因此仅对 6个
株系的薯蓣皂苷元量和农艺性状进行了分析与
鉴定 。
1.6.2　薯蓣皂苷元的测定:精密称取盾叶薯蓣粉末
0.2 ～ 0.3 g ,其他样品处理和测定方法同 1.4。
1.6.3　农艺性状的鉴定:每个株系选 10株 ,在植株
的相同部位测定叶长 、叶宽及茎粗 。叶长 、叶宽均用
直尺测量 ,茎粗用螺旋测微器测定 。
2　实验结果
2.1　盾叶薯蓣同源四倍体株系的染色体鉴定和快
速繁殖:前期实验[ 6] 表明 , 0.2% 秋水仙碱浸泡
36 h ,转接在添加 40×10-6秋水仙碱的 MS +BA
0.1 mg/L +病毒唑 5 mg/L +PP333 0.5 mg/L 的培
养基上是诱导盾叶薯蓣多倍体的最佳方法 ,其死亡
率为 62.0%,诱导率为 15%。经过3次重复根尖染
色体的鉴定 ,最后获得了 32 个同源四倍体株系 。
进一步对诱导获得的四倍体株系进行了根尖染色体
鉴定和确认 。由图 2 可以看出 ,盾叶薯蓣二倍体植
株根尖染色体数目为 2n=2 x=20 条 ,与文献报道
相符;四倍体植株根尖染色体数目为 2n =4x =40
条 ,染色体数目增加了 1倍 ,为同源四倍体。同时在
试管苗扩繁期间根据生长情况 ,淘汰掉长势差 ,生长
率低的四倍体株系 ,最终确定了 19 个盾叶薯蓣同
源四倍体株系进行田间的选育工作 。
图 2　盾叶薯蓣的染色体
Fig.2　Chromosome of D.zingibiernsis
2.2　盾叶薯蓣试管苗同源四倍体薯蓣皂苷元量的
分析:对诱导获得的 19个四倍体株系试管苗的薯蓣
皂苷元量进行了初步分析 ,结果见表 1 。部分株系
测定图谱见图 3。结果显示 , 19 个盾叶薯蓣四倍体
株系中 ,有 10个株系的薯蓣皂苷元量高于二倍体 ,
平均比二倍体株系高出 30.8%。其中 10-1 、12-4 、
y9 、3-1 、y24 、11-10 ,分别比二倍体株系高出 75%、
50%、50%、33%、25%、25%。
·1315·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷第 8 期 2009年 8月
表 1　盾叶薯蓣四倍体株系薯蓣皂苷元
Table 1　Content of diosgenin in autotetraploid
lines of D.zingibiernsis
株系 薯蓣皂苷元/ % 株系 薯蓣皂苷元/ %
C12 0.09 Y15 0.09
13-6 0.05 12-2 0.07
10-1 0.21 Y24 0.15
13-3 0.14 G11 0.08
Y23 0.13 Y3 0.07
3-5 0.09 G2 0.14
3-13 0.12 12-4 0.18
16-8 0.06 10-10 0.13
11-10 0.15 3-1 0.16
Y9 0.18 二倍体 0.12
2.3　盾叶薯蓣部分四倍体植株薯蓣皂苷元定量测
定和农艺性状的初步鉴定
2.3.1　薯蓣皂苷元测定:对田间 6个多倍体株系试
管苗的薯蓣皂苷元量进行了分析 ,结果见表 2。
　　结果表明 ,试管苗阶段薯蓣皂苷元量高的株系
在生长 1 年后 , 薯蓣皂苷元量也相应较高 , r =
0.992 2 ,因此试管苗阶段测定薯蓣皂苷元量可以对
优良株进行初步选育 。
2.3.2　农艺性状初步鉴定:在试验田进行了栽培 ,
定期对田间各株系生长情况 ,农艺性状进行观察记
载 ,作为性状鉴定和品系选育的依据。由表 3可知 ,
大部分四倍体株系在叶长 、叶宽或茎粗的某些或全
图 3　10-1 株系薯蓣皂苷(A), 13-16株系薯蓣皂苷(B)和二倍体株系薯蓣皂苷(C)HPLC 色谱分析图
Fig.3　HPLC Analysis of diosgenin of 10-1 lines(A), diosgenin of 13-16 lines(B), and diosgenin of diploid lines(C)
表 2　试管苗与一年生苗薯蓣皂苷元
Table 2　Content of diosgenin in plantlet and that
in one year growth plant
株系 试管苗薯蓣皂苷元/ % 一年生苗薯蓣皂苷元/ %
10-1 0.21 1.52
G11 0.08 0.95
Y3 0.07 0.89
Y24 0.15 1.29
12-4 0.18 1.43
13-16 0.05 0.75
CK 0.12 1.19
表 3　四倍体株系一年生苗农艺性状
Table 3　Agronomy character of one year
growth aototetrploid plants
株系 叶长/ cm 叶宽/ cm 茎粗/ cm
10-1 3.5±0.2 2.4±0.1 0.12±0.01
G11 4.0±0.5 3.0±0.1 0.21±0.03
Y3 3.2±0.1 2.7±0.1 0.18±0.02
Y24 3.0±0.1 2.8±0.2 0.14±0.01
12-4 2.8±0.1 2.6±0.1 0.22±0.03
13-16 2.5±0.1 2.0±0.2 0.19±0.01
二倍体 2.7±0.1 2.4±0.1 0.15±0.02
部性状均优于二倍体。这充分表现了多倍体某些器
官巨型性这一特征 。
3　讨论
　　盾叶薯蓣部分四倍体株系一年生苗的农艺性状
和薯蓣皂苷元量的测定结果表明:大部分四倍体株
系的农艺性状均优于二倍体株系 ,而且四倍体株系
试管苗与一年生苗薯蓣皂苷元量有较强的相关性;
说明试管苗阶段 ,通过测定薯蓣皂苷元量对株系进
行前期筛选是可行的 。
实验为盾叶薯蓣同源四倍体育种研究的一部
分 ,还将继续进行盾叶薯蓣同源四倍体优良品种的
选育 ,经过 2 ～ 3年盾叶薯蓣质量和化学指标的评价
和考察 ,最终培育出高产优质的盾叶薯蓣新品种。
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