全 文 ：铁皮石斛药材HPLC 指纹图谱研究
殷放宙, 陆兔林3 , 蔡宝昌Ξ , 郁红礼, 王巧晗, 李　林
(南京中医药大学, 江苏 南京　210046)
摘　要: 目的　建立铁皮石斛药材的R P2H PL C 指纹图谱。方法　采用梯度洗脱的方法, 以K rom asil○R KR 10025C18
(250 mm ×416 mm , 5 Λm ) 为分析用色谱柱, 以乙腈2014% 磷酸溶液为流动相建立了铁皮石斛药材的指纹图谱, 并
进行了相似度的计算。结果　该方法可使铁皮石斛中各成分得到较好的分离, 并根据检测结果确定了15 个共有指
纹峰。结论　该指纹图谱检测方法简便、重现性好, 可作为铁皮石斛药材质量控制的重要方法。
关键词: 铁皮石斛; 指纹图谱; 高效液相; 相似度
中图分类号: R 28217　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0433- 03
F ingerpr in t of dry stem in D end robium cand idum by HPLC
Y IN Fang2zhou, LU T u2lin, CA I Bao2chang, YU Hong2li, W AN G Q iao2han, L I L in
(N an jing U niversity of T radit ional Ch inese M edicine, N an jing 210046, Ch ina)
Abstract: Objective　To estab lish the fingerp rin t fo r the dry stem in D end robium cand id um by R P2
H PL C1 M ethods　K rom asil○R KR 10025 C 18 co lum n (250 mm ×416 mm , 5 Λm ) w as u sed w ith a m ix tu re of
aceton it rile2014% pho spho ru s acid as mob ile phase in a gradien t mode and the data w ere analyzed w ith ″
Compu ter A ided Sim ilarity Evaluat ion″softw are1 Results　T he chem ical con st ituen ts of D 1 cand id um
w ere op t im ally separa ted, among w h ich 15 fingerp rin t peak s in common w ere confirm ed1 Conclusion
T h is m ethod is simp le, accu ra te w ith good rep roducib ility, and can be u sed specif ica lly fo r the quality con2
t ro l of D 1 cand id um 1
Key words: D end robium cand id um W all1 ex L indl1; f ingerp rin t; H PL C; sim ilarity
　　铁皮石斛是兰科植物铁皮石斛 D end robium
cand id um W all1ex L indl1 的干燥茎, 为临床常用中
药。具有益胃生津、滋阴清热之功效。用于阴伤津亏,
口干烦渴, 食少干呕, 病后虚热, 目暗不明等症。《中
国药典》2005 年版对铁皮石斛药材的质量控制仍停
留在简单的性状鉴别[1 ] , 这远远不能实现对铁皮石
斛药材进行全面的质量控制, 鉴于高效液相指纹图
谱在药材质量控制上的优势, 本实验参照《中药注射
剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行)》的相关要求, 利
用梯度洗脱法建立了铁皮石斛药材的液相色谱指纹
图谱, 为铁皮石斛药材整体质量控制提供了借鉴。
1　仪器、试药与药材
　　A gilen t 1100 液相色谱仪 (美国惠普公司) , 电子
天平 (M ett ler To ledo A G285) , 乙腈 (T edia 公司, 色
谱纯) , 甲醇、磷酸 (上海化学试剂有限公司, 分析纯)。
10 批铁皮石斛药材采集于云南思茅石膏井镇, 经南
京中医药大学药学院陆兔林教授鉴定为兰科植物铁
皮石斛D 1 cand id um W all1ex L indl1 的干燥茎。
2　方法及结果
211　指纹图谱色谱条件及药材提取方法的确定
21111　色谱条件[2 ]: 色谱柱为 K rom asil○R KR 1002
5C18 (250 mm ×416 mm , 5 Λm ) ; 流动相为乙腈 (A ) 2
014%磷酸溶液 (B ) 进行线性梯度洗脱, 0～ 5 m in
3%A～ 10%A , 5～ 12 m in 10%A～ 15%A , 12～ 25
m in 15%A～ 22%A , 25～ 40 m in 22%A～ 35%A ,
40～ 50 m in 35%A～ 55%A , 50～ 60 m in 55%A～
60%A ; 体积流量: 110 mL öm in; 检测波长 270 nm ;
柱温30 ℃; 运行时间为60 m in。
21112　供试品溶液的制备: 取铁皮石斛药材, 50 ℃
干燥4 h, 粉碎, 过60 目筛。取药材粉末1 g, 精密称定,
置于索氏提取器中, 加甲醇50 mL 水浴回流4 h, 提取
液挥去部分溶剂, 冷却, 加甲醇定容至10 mL , 用0145Λm 微孔滤膜滤过, 滤液作为供试品溶液。
21113　测定法: 精密吸取供试品溶液10 ΛL , 注入高
·334·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007205209
作者简介: 殷放宙 (1976—) , 女, 江苏南京人, 讲师、博士, 主要从事中药质量标准的研究。
T el: 13951727393　E2m ail: yfz2003@ 1631com3 通讯作者　陆兔林　T el: (025) 85811513　E2m ail: lu tu ling2005@ 1261com
蔡宝昌　T el: (025) 85811112　E2m ail: bccai@ 1261com
效液相色谱仪, 记录 60 m in 的色谱图, 梯度平衡时 间10 m in。铁皮石斛药材的典型指纹图谱见图1。
töm in
图 1　铁皮石斛药材的典型指纹图谱
F ig11　Typ ica l f ingerpr in t of D 1 cand idum
212　方法学考察
21211　空白试验: 精密吸取空白溶液 (甲醇) 10 ΛL ,
注入高效液相色谱仪, 按规定的梯度条件进行洗脱。
结果表明空白不干扰测定。
21212　分析时间确定试验: 取铁皮石斛供试品溶液
按要求进样, 在洗脱 60 m in 后, 再保持 60% 乙腈 60
m in, 经分析, 铁皮石斛药材 2 h 梯度洗脱图谱显示,
保留时间60 m in 后已无成分残留。确定铁皮石斛指
纹图谱的分析时间为60 m in。
21213　稳定性试验: 取同一供试品溶液, 分别在 0、
1、4、7、12、16、24、29 h 检测, 考察各色谱峰相似度
的一致性, 利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱
相似度评价系统》2004 年A 版进行相似度评价, 相
似度平均值为1, R SD 为011%。结果表明供试品在
29 h 内稳定。
21214　精密度试验: 取同一供试品溶液, 连续进样5
次, 考察各色谱峰相似度的一致性, 利用国家药典委
员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004 年A
版进行相似度评价, 相似度平均值为 01999, R SD 为
010%。结果表明仪器精密度良好。
21215　重现性试验: 取同一批铁皮石斛药材分别提
取制备5 份供试品, 进行检测, 考察各色谱峰相似度
的一致性, 利用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱
相似度评价系统》2004 年A 版进行相似度评价, 相
似度平均值为01999, R SD 为011%。结果表明实验
重现性良好。
213　铁皮石斛共有模式的建立
21311　10 批铁皮石斛药材高效液相指纹图谱的建
立: 本实验以铁皮石斛地道产地云南思茅石膏井镇
所产药材为重点研究品种, 于此地共收集 10 批药
材。铁皮石斛的提取方法及色谱条件参照 211 项下
有关内容, 具体图谱见图2。
21312　10 批铁皮石斛药材相似度的比较: 将 10 批
药材的色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评
价系统》2004 年A 版相似度软件, 考察色谱峰相似
度的一致性, 进行相似度的评价。具体数据见表1。
表 1　10 批铁皮石斛药材的相似度
Table 1　Sim ilar ity of ten batches of D 1 cand idum samples
批号 相似度 批号 相似度
1 01981 6　　　 01976
2 01987 7　　　 01971
3 01983 8　　　 01967
4 01980 9　　　 01958
5 01970 10　　　 01968
21313　铁皮石斛共有指纹峰的确立: 以保留时间约
为1517 m in 的3 号色谱峰作为参照峰, 对10 批药材
的指纹图谱进行考察, 确定了15 个共有峰 (见图2)。
并对各峰的相对保留时间及相对峰面积进行了计
算, 统计各批非共有峰与总峰面积的百分比, 其结果
为非共有峰面积百分比在6151%～ 9112% , 符合《中
药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行)》中所规
定“非共有峰总面积不得大于总峰面积的10% ”的检
测要求。
3　讨论
311　在实验过程, 考察了不同提取溶剂, 包括石油
醚、二氯甲烷、甲醇、乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇、50%
乙醇、70% 甲醇、50% 甲醇等对样品提取效果的影
响, 色谱图表明甲醇对铁皮石斛药材的提取效率较
优。对加热回流、索氏提取、超声提取等提取方法进
行了比较, 结果表明索氏提取法能较好地将成分富
集, 因此确定索氏提取为样品的提取方法。并进一步
考察了提取时间, 分别对药材索氏提取 2、3、4、5 h
进行了考察, 结果表明对大多数色谱峰而言, 以 4 h
提取效率最高, 4、5 h 提取效率无明显差异, 因此确
定样品的索氏提取时间为4 h。
·434· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
töm in
图 2　10 批铁皮石斛样品指纹图谱叠加图
F ig12　Overla id f ingerpr in t of ten batches of D 1 cand idum samples
　　此外, 还考察了药材粉碎的粒度情况, 分别进行
了 20、40、50、60、80 目药材的比较实验, 结果表明
20、40、50 目较后两者提取不完全, 60、80 目提取效
率无明显差异, 确定药材的粉碎粒度为60 目。
312　为确定最佳检测波长, 首先对铁皮石斛药材的
供试品溶液在 200～ 400 nm 进行了DAD 全波长扫
描, 发现其在270 nm 处能体现较多的吸收峰且强度
较大, 故选择270 nm 作为检测波长。
313　为将供试品中的化学成分尽可能洗脱和分离,
以最大限度地提供鉴别信息, 本研究采用了反相梯
度色谱法分离了铁皮石斛药材供试品中性质差异较
大的各种组分, 考察了甲醇2水、甲醇2014% 磷酸溶
液和乙腈2014% 磷酸溶液等多种色谱系统, 结果表
明乙腈2014% 磷酸溶液系统各色谱峰的分离和峰形 均较好, 并对乙腈2014% 磷酸溶液系统进行了各种梯度的筛选。试验中还将乙腈体积分数上升至100% , 观察石斛供试品的色谱行为, 图谱显示乙腈上升至 60% 后均未见有明显的色谱峰出现, 因此乙腈相的最终体积分数确定在60%。同时比较 YW G2C 18 柱 (250 mm ×416 mm , 5Λm )、K rom asil25 C18 (250 mm ×416 mm , 5 Λm )、L ich ro spher C 18 (250 mm ×416 mm , 5 Λm ) 3 种色谱柱, 相同色谱条件下, 以K rom asil25 C18柱色谱行为较好, 因此, 选用K rom asil25 C18柱为指纹图谱分析用色谱柱。参考文献:[ 1 ]　中国药典 [S ]1 一部1 20051[ 2 ]　张尊建, 王源园, 李　茜, 等 1 密花石斛的H PL CöUV öM S 指纹图谱研究[J ]1 中草药, 2004, 35 (4) : 39323951
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