全 文 ：移和复发有密切关系[ 11 ,12 ] 。近来的研究也发现
SRC23 在白血病细胞系 K562 中呈现高表达 ,并且
与细胞耐药性相关 ,诱导 SRC23 表达下调后可能促
进白血病细胞的凋亡[13 ] 。在转基因小鼠中 , SRC23
基因高表达明显促进肿瘤发生[14 ] ,而在基因敲除小
鼠模型中 , SRC23 缺乏抑制小鼠肿瘤形成[15 ] 。因
此 ,有报道认为 SRC23 可以成为新的化疗靶点。本
实验的初步结果显示 ,在 RPMI28226 细胞中 SRC23
呈高表达 ,经不同浓度的鱼藤素处理后 ,其蛋白和基
因表达水平均以浓度依赖性方式逐渐递减。而且发
现在 RPMI28226 细胞中 , SRC23 主要位于细胞核
内 ,经鱼藤素干预后 ,SRC23 的表达明显减弱 ,其细
胞定位没有明显改变。然而 ,鱼藤素是如何影响
SRC23 表达 ,它又改变了哪些重要蛋白或基因仍不
清楚 ,有待进一步的研究去发现。
综上所述 ,本实验表明鱼藤素作为一种高效低
毒的抗肿瘤活性成分 ,具有显著抑制肿瘤细胞增殖、
诱导细胞凋亡的作用 ,而该作用可能与其抑制
SRC23 的表达有关 ,因此有望成为一种新型的高效
的抗肿瘤药物。
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利用稻瘟霉模型筛选粗疣合叶苔内生真菌中的活性菌株
郭 　蕾1 ,吴锦忠2 ,许强芝3 ,韩 　婷1 ,秦路平1 3
(11 第二军医大学药学院 生药教研室 ,上海 　200433 ; 21 福建中医学院 中西医结合研究院 ,福建 福州 　350003 ;
31 第二军医大学 生物化学与分子生物学教研室 ,上海 　200433)
摘　要 :目的 　利用稻瘟霉模型快速筛选粗疣合叶苔内生真菌中具有生物活性的菌株 ,并对活性菌株 T11 进行鉴
定。方法 　首次对粗疣合叶苔内生真菌进行了分离 ,通过观察内生真菌醋酸乙酯提取物引起稻瘟霉分生孢子或菌
·0901· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008211219　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :福建省自然科学基金资助项目 (2008J0097)
作者简介 :郭　蕾 (1984 —) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向为内生真菌活性代谢产物。
Tel : (021) 81871311 　E2mail : guoleialice28 @163. com3 通讯作者　秦路平　Tel/ Fax : (021) 25070394 　E2mail : qinsmmu @126. com
丝形态生长异常或生长抑制的情况 ,初步确定具有生物活性的菌株 ,进一步进行体外抗真菌及抗肿瘤活性筛选 ,对
活性最好的 T11 菌株进行了分类鉴定。结果 　粗疣合叶苔分离得到 47 株内生真菌 ,具有抗稻瘟霉活性的活性菌
株 40 株 ,占总分离菌株的 8511 %。其中 T11 号菌株可明显抑制真菌生长和肿瘤细胞增殖。结论 　粗疣合叶苔内
生真菌具有明显的抗真菌和细胞毒作用 ,是潜在的抗菌、抗肿瘤药物资源。
关键词 :粗疣合叶苔 ; 内生真菌 ; 稻瘟霉 ; 抗真菌
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0721090205
Screening of active strains in endophytic fungi from Sca pa nia ver rucosa
using biological model of Pyricula ria or yzae
GUO Lei1 , WU Jin2zhong2 , XU Qiang2zhi3 , HAN Ting1 , Q IN L u2ping1
(11Department of Pharmacognosy , School of Pharmacy , Second Military Medical University , Shanghai 200433 , China ;
2. Academy of Integrative Traditional Chinese and Western Medicine , Fujian University of Traditional
Chinese Medicine , Fujian 350003 , China ; 3. Department of Biochemist ry and Molecular
Biology , Second Military Medical University , Shanghai 200433 , China)
Abstract : Objective 　To rapidly screen t he bioactive st rains in endop hytic f ungi f rom S ca p ani a verru2
cosa by Py ricul ari a ory z ae P22b model and to identify t he active st rain T11. Methods 　The endop hytic
f ungi were firstly isolated f rom S . verrucosa and t he morp hological deformation induced by ethyl acetate
ext ract of bioactive f ungi or growt h inhibition of mycelia germinated f rom t he conidia of P. ory z ae were
observed to screen the bioactive st rains whose i n v i t ro antif ungus activity and cytotoxic effect on t umor cell
lines were st udied f urt herly. The active st rain T11 wit h t he best activity was identified by morp hological
met hod. Results 　A total of 47 endop hytic f ungi were isolated f rom liverwort S . verrucosa. Among t hem ,
40 st rains (85. 1 %) of endop hytes could induce morp hological abnormality of P. ory z ae. The st rain T11
could inhibit t umor cells p roliferation and f ungal mycelia growt h effectively. Conclusion 　Endop hytes f rom
S . verrucosa have antif ungal activity and cytotoxic effect and could be a potential resource for t he develop2
ment of antif ungal and antit umor agent .
Key words : S ca p ani a verrucosa Heeg. ; endop hytes ; Py ricul ari a ory zea ; antif ungal activity
　　苔藓植物是潜在的天然活性产物宝库 ,其次生
代谢物中含有萜类、黄酮类及多种生物活性物质 ,具
有细胞毒、抑制细胞生长、调节植物生长、升压、强
心、抗菌、松驰肌肉、释放过氧化物、昆虫拒食及酶抑
制等作用 ,应用前景广阔[1 ,2 ] 。但有限的植物资源
已成为开发其活性产物的巨大障碍[ 3 ] 。近年来发
现 ,植物内生真菌能产生大量新的天然产物[4 ,5 ] ,有
些内生真菌还可以产生与宿主植物相同或相近的代
谢产物[6 ] ,是新的天然产物的重要来源。东京大学
宕崎成夫以稻瘟霉 Py ricul ari a ory z a P22b 为模型
筛选海洋真菌活性成分时发现 ,以菌丝念珠状、膨大
变形及孢子萌发抑制为指标筛选抗真菌活性成分 ,
和以菌丝卷曲变形为指标筛选抗肿瘤活性成分是可
行的。其作用机制与抑制微管蛋白活性 ,干扰细胞
有丝分裂有关[7 ] 。其中 rhizoxin 和 f usarielin A 已
分别开发为抗肿瘤和抗真菌新药[8 ,9 ] 。本研究对粗
疣合叶苔内生真菌进行了分离 ,用稻瘟霉模型初筛 ,
对活性较好的菌株进行抗真菌和细胞毒研究 ,旨在
开发新的抗真菌、抗肿瘤药物 ,开发苔藓类药用植物
活性成分的新来源。
1 　材料
111 　样品 :粗疣合叶苔 S ca p ani a verrucosa Heeg.
于 2006 年 10 月采自浙江雁荡山 ,由上海师范大学
曹同教授鉴定 ,标本存于第二军医大学药学院生药
教研室。取 10 g 样品 ,室温干燥 ,用甲醇提取 3 次 ,
合并滤液 ,浓缩 ,4 ℃冰箱内保存备用。
112 　供试菌株和肿瘤细胞 :稻瘟霉 Py ricul ari a
ory z ae P22b 菌株由复旦大学分子生物学研究所提
供 ;白色念珠菌 ( Can di da albicans ) A TCC76615、
新 生 隐 球 菌 ( Cry ptococcus neof orm ans )
A TCC32609 由长征医院菌种保存中心赠送 ,红色
毛癣菌 ( T richop hy ton rubrum ) 、薰烟曲霉菌 ( A s2
pergi l l us f umi gat us ) 由长海医院真菌室提供。
A549 (人肺癌细胞) 、LOVO (人肠癌细胞) 、HL260
(人白血病细胞) 、Q GY7703 (人肝癌细胞) 均由上
海医药工业研究院药理实验室冻存和传代。
113 　培养基 :分离培养基 PDA 组成为土豆 20 %、
葡萄糖 2 %、琼脂 2 % ; 发酵培养基组成为土豆
20 %、葡萄糖 1 %、蔗糖 1 % ;沙堡葡萄糖琼脂培养
基 (SDA) 组成为蛋白胨 10 g、葡萄糖 40 g、琼脂
·1901·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
18 g ,加入 2 mg/ mL 氯霉素水溶液 50 mL ,用于培
养供试真菌 ; RPMI 1640 培养液 　RPMI 1640 10
g、Na HCO3 2. 0 g、吗啡啉丙磺酸 3415 g ,加三蒸水
900 mL 溶解 , 015 mol/ L NaO H 调 p H 至 710
(25 ℃) ,定容至 1 000 mL 。YEPD 培养液 :酵母浸
膏 10 g、蛋白胨 20 g、葡萄糖 20 g ,加三蒸水 900
mL 溶解 ,加入 2 mg/ mL 氯霉素水溶液 50 mL ,定
容至 1 000 mL 。
114 　仪器 :Nikon TS100 倒置显微镜 ;上海跃进集
团 SPX —250B 生化培养箱 ; 太仓市实验设备厂
H YG—A 摇床 ;苏净集团 SW —CJ —1D 超净工作
台 ;上海博迅实业有限公司 YXQ —L S —75S Ⅱ蒸
汽灭菌器。
2 　方法
211 　内生真菌的分离纯化 :取新采集的粗疣合叶苔
用自来水冲洗 30 min ,置于 75 % 乙醇中消毒 5
min ,无菌水冲洗多次 ,再将样品放入 011 % HgCl2
溶液中进一步消毒 5 min ,无菌水冲洗 3 次 ,贴放于
PDA 平板上 ,每个平板放置 4 片 ,25 ℃培养 ,待菌
丝长出后 ,挑取尖端菌丝移到新的固体平板上继续
培养 ,几次纯化后得到内生真菌。为了检查表面消
毒是否彻底 ,进行对照实验。将最后一次表面消毒
后的无菌水涂抹于空白培养基上 ,置于相同条件下
培养。一直无任何菌丝长出 ,多次重复相同 ,证明表
面消毒彻底。
212 　内生真菌的发酵培养 :取斜面培养物 1 cm2左
右 ,转接入 250 mL 摇瓶装的 100 mL 发酵培养基
中 ,26 ℃、180 r/ min 摇床振荡培养 5 d ,得到发酵
液。发酵液经滤过后得到上清液 ,用等体积的醋酸
乙酯萃取 3 遍 ,浓缩后于 4 ℃保存备用。
213 　抗稻瘟霉活性检测
21311 　稻瘟霉活性检测方法[10 ] :将稻瘟霉 P22b 菌
株接种于斜面土豆培养基上 ,27 ℃培养 12～14 d ,
用适量无菌水刮取孢子 ,滤过除去菌丝 ,得到孢子悬
浮液 ,然后加入 2 % 酵母提取物 ,并用无菌水调节
使其最终孢子浓度为 4 ×104 个/ mL ,以每孔 50μL
的量加入 96 孔培养板各孔中。用 10 % 甲醇超声
配制供试样品使成 10 mg/ mL ,各取 50μL 加入 96
孔板第 1 行各孔中 ,每一列从第一行开始依次倍半
稀释到最后一孔 (即 8 个浓度) ;以酮康唑和 10 %
甲醇溶液作为阳性和阴性对照 ,同法操作。将加好
样品的 96 孔板在 27 ℃培养 16 h ,用倒置显微镜观
察孢子生长和菌丝变形的情况 ,以不再抑制稻瘟霉
生长作为判断终点 ,得到最小抑制浓度 (MIC) 。上
述实验均平行操作 3 次。
21312 　活性指标 :根据菌丝的卷曲、膨胀、分枝过多
或念珠状等形态生长异常现象 ,可分为 5 个等级 (图
1) ,记录下生长完全抑制的最低浓度 MIC。
A2菌丝完全抑制 ,孢子不萌发　B2菌丝强烈抑制
C2菌丝中度抑制　D2菌丝轻度抑制　E2正常生长的菌丝
A2growt h inhibition 　B2st rong morphological deformation
C2moderate morphological deformation 　D2slight
morphological deformation 　E2cont rol
图 1 　稻瘟霉生长状态示意图
Fig. 1 　Morphological deformation of P. oryzae
214 　抗真菌活性测定
21411 　真菌液制备 :从 SDA 培养基上挑取新生隐
球菌、白色念珠菌、球状菌少量 ,接种至 1 mL YEPD
培养液 ,于 35 ℃、250 r/ min 振荡培养 ,活化 16 h ,
使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至 1 mL
YEPD 培养液中 ,用上述方法再次活化 ,16 h 后 ,用
血细胞计数板计数 ,以 RPMI 1640 培养液调整菌液
浓度至 1 ×103 ～5 ×103 个/ mL 。将丝状菌接种至
SDA 斜面 ,烟曲霉菌 35 ℃,培养 1 周 ;红色毛癣菌
28 ℃,培养两周。活化两次后 ,加适量 RPMI 1640
培养液于 SDA 斜面 ,用吸管吹打菌落 ,使真菌孢子游
离于 RPMI 1640 培养液中 ,然后经 4 层无菌纱布滤
过。培养液经血细胞计数板计数后 ,加 RPMI 1640
培养液调整孢子浓度至 1 ×103～5 ×103个/ mL。
21412 　检测方法 :取无菌 96 孔板 ,于每排 1 号孔加
RPMI 1640 100μL 作空白对照 ;3～12 号孔各加新
鲜配制的菌液 120μL ; 2 号孔分别加菌液 160μL
和样品溶液 (分别用 DMSO 配成 1218 g/ L ) 116
μL 。2～11 号孔 10 级 4 倍稀释 ,使各孔中的药物终
质量浓度分别为 128、32、8、2、015、01 125、01031 3、
01007 8、01002 0、01000 49 mg/ L ,各孔中 DMSO
体积分数均低于 1 % ;12 号孔不含药物 ,作阳性对
照。各药敏板于 35 ℃培养。念珠菌、新生隐球菌
及丝状菌分别于 35 ℃培养 24、72 h 和 1 周后 ,用
酶标分析仪于 630 nm 测各孔吸光度 ( A) 值。与阳
性对照孔比较 ,以 A 值下降 50 % 以上的最低浓度
孔中的药物浓度为 MIC50 (真菌生长 50 % 被抑制时
·2901· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
的药物浓度) 。当药物的 MIC50 值超过测定浓度范
围时 ,按以下方法进行统计 :MIC50值高于最高浓度
128 mg/ L 时 ,计为“> 128 mg/ L”; MIC50 值为最低
浓度或在最低浓度以下时 , 不作区别 , 均计为
“≤0. 000 49 mg/ L”。上述实验均平行操作 3 次。
215 　抑制肿瘤细胞增殖实验
21511 　肿瘤细胞培养与供试样品配制 :将肿瘤细胞
培养于 RPMI 1640 培养液中 ,加入 15 % 胎牛血清 ,
1 % 抗生素 (1 ×107 U/ L 青霉素、10μg/ L 链霉素)
于 37 ℃、5 % CO2的湿热培养箱中培养。每 2 天继代
培养 ,使细胞保持在对数生长期。对具有较好抗稻瘟
霉活性的 10 种内生菌提取物均分别用 DMSO (Mer2
ck) 溶解后 ,加入 PBS 配成 1 000μg/ mL 的溶液。
21512 　细胞毒活性测定 :96 孔板每孔加入浓度为
4 ×104 ～ 6 ×104 个/ mL 的细胞悬液 100 μL ,置
37 ℃、5 % CO2 培养箱内。24 h 后加入样品液 ,10
μL/ 孔 ,设双复孔 ,同时设阳性对照、空白对照 ,在 37
℃、5 % CO2 作用 72 h。然后 ,每孔加入 5 mg/ mL
的 M T T 溶液 20μL ,作用 4 h 后加入溶解液 ,100
μL/ 孔 ,置培养箱内 ,溶解后用 M K22 全自动酶标仪
于 570 nm 处测 A 值 ,计算 IC50值。
216 　内生真菌的鉴定 :真菌鉴定按常规方法进行。
将 PDA 培养基薄片置于载玻片上。挑取纯化的菌
株尖端菌丝 ,接种后盖上盖玻片培养 ,真菌即在载玻
片与盖玻片之间有限的空间内沿盖玻片横向生长。
培养一段时间后 ,将载玻片置于显微镜下观察。结
合菌落形态、颜色、生长速率及显微镜下分生孢子的
结构及大小 ,分生孢子梗的形态等 ,将菌鉴定到
属[11 ,12 ] 。
3 　结果
311 　抗稻瘟霉活性 :从粗疣合叶苔中分离出 47 株
真菌 ( T1～T47) ,以稻瘟霉孢子形态异常或生长抑
制为活性指标 ,对真菌进行初步筛选 ,得到 40 株有
活性的菌株 ,占总分离菌株的 8511 %。经过多次反
复筛选得到活性较好的 8 株 ,其中 T27 菌株能引起
稻瘟霉孢子畸形为变形活性。见表 1。
312 　抗真菌活性 :进一步考察对稻瘟霉有较好活性
的 8 株菌的抗真菌活性 ,酮康唑为阳性对照 ,结果见
表 2。可见 ,大多菌株都有较好的抗病原真菌作用 ,
且比原植物本身的活性好。
313 　抑制肿瘤细胞增殖 :对于具有较好抗稻瘟霉活
性的 8 种内生真菌提取物 ,采用 MTT 法[13 ] ,以两性
霉素为阳性对照 ,进行细胞毒性测定 ,结果见表 3。
从粗疣合叶苔中分离得到的 8 株内生菌对体外培养
的 4 种肿瘤细胞生长均有不同程度的抑制作用。
表 1 　粗疣合叶苔及其内生菌抗稻瘟霉活性 ( n = 3)
Table 1 　Anti2P. oryzae activity of S. ver rucosa
and its endophytic fungi ( n = 3)
样品 MIC/ (μg ·mL - 1 ) 样品 MIC/ (μg ·mL - 1 ) 样品 MIC/ (μg ·mL - 1 ) 样品 MIC/ (μg ·mL - 1 )
T1 5001 0 T13 > 50010 T25 50010 T37 50010
T2 5001 0 T14 25010 T26 25010 T38 25010
T3 1251 0 T15 50010 T27 12510 T39 25010
T4 2501 0 T16 25010 T28 6215 T40 25010
T5 2501 0 T17 25010 T29 12510 T41 50010
T6 > 5001 0 T18 50010 T30 12510 T42 25010
T7 2501 0 T19 50010 T31 718 T43 25010
T8 > 5001 0 T20 25010 T32 12510 T44 > 50010
T9 > 5001 0 T21 > 50010 T33 25010 T45 12510
T10 1251 0 T22 50010 T34 > 50010 T46 25010
T11 621 5 T23 50010 T35 3112 T47 50010
T12 621 5 T24 6215 T36 6215　　粗疣合叶苔 50010
表 2 　粗疣合叶苔及其内生菌的抗真菌活性 ( n = 3)
Table 2 　Antifungal activity of S. ver rucosa
and its endophytic fungi ( n = 3)
样品
MIC50 / (μg ·mL - 1 )
白色念珠菌 新生隐球菌 红色毛癣菌 薰烟曲霉菌
粗疣合叶苔 > 1281 0 6410 6410 > 12810
T11 　　81 0 810 810 810
T12 　 321 0 810 3210 > 12810
T24 　 321 0 12810 12810 > 12810
T28 　 321 0 3210 3210 > 12810
T31 > 1281 0 3210 3210 3210
T32 　 321 0 3210 12810 > 12810
T35 　 321 0 3210 3210 3210
T36 　 321 0 3210 3210 12810
酮康唑 　　01 25 015 410 6410
表 3 　粗疣合叶苔及其内生菌对人体肿瘤细胞的
体外增殖抑制作用 ( n = 3)
Table 3 　Inhibition of S. ver rucosa and its endophytic
fungi on proliferation of human tumor cells
in vit ro ( n = 3)
样品
IC50 / (μg ·mL - 1 )
A549 LOVO HL260 Q GY7703
粗疣合叶苔 > 100100 > 100100 421 00 > 1001 00
T11 5179 12163 11 26 71 89
T12 13151 63140 101 34 471 20
T24 39162 53155 341 64 > 1001 00
T28 9114 18163 11 13 401 25
T31 > 100100 9111 41 06 311 23
T32 9112 30113 61 78 > 1001 00
T35 43196 > 100100 621 77 > 1001 00
T37 > 100100 > 100100 391 79 > 1001 00
两性霉素 01020 7 01734 0 01 020 7 01 011 0
314 　T11 菌株的遗传稳定性 :抑制稻瘟霉分生孢子
生长活性较强的 T11 号菌株 ,同时又有最好的抗真
菌活性 ,并且有较好的抑制肿瘤细胞作用。为此 ,考
察了其遗传稳定性情况 ,将 T11 菌株传 3 代 ,每 1
·3901·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
代分别进行发酵培养 ,其提取物抑制稻瘟霉生长的
MIC 均为 6215μg/ mL ,证明稳定性良好。
315 　T11 的分类鉴定 :菌丝淡灰色 ,早期不明显 ,子
囊壳表生 ,球形 ,壁初期半透明 ,成熟后色暗 ,膜质 ,四
周有毛。子囊棍棒形 ,内有 8 个子囊孢子 ,子囊壁早
期胶化 ,使子囊散在子囊壳内 ,子囊孢子单细胞 ,柠檬
形 ,橄榄色。菌落初期白色 ,后为褐色 ,可见针头大小
的颗粒。鉴定其属为毛壳属 Chaetomium sp . 。
4 　讨论
　　从天然产物中筛选生物活性成分或先导化合物
是研究创制新药的有效途径之一。目前已证实 ,许
多来自植物的天然产物与植物内生真菌有密切关
系 ,甚至也是内生真菌的次生代谢产物。近年来 ,植
物内生真菌化学成分的研究备受关注 ,发现了许多
具有新颖结构和独特生理活性的化合物[14 ] 。由于
苔鲜植物生境特殊 ,其内生真菌的生境较种子植物
内生真菌生境更为特殊。鉴于苔藓植物尤其是苔类
植物具有独特的细胞或油体 ,富含萜类和酚类等多
种活性成分 ,体现抗肿瘤、抗菌等多种生理活性作
用 ,而且植物株型小 ,资源蕴藏量少 ,因此 ,从苔类植
物中筛选能够合成具有抑制真菌和肿瘤细胞生长活
性成分的内生真菌意义重大。
本实验利用这一简单、快速的生物检测模型和
方法从粗疣合叶苔内生真菌中筛选出多株产生抗真
菌、细胞毒活性物质的菌株。通过对抗稻瘟霉活性
与体外细胞毒活性比较发现 ,具有较好的抗稻瘟霉
活性的真菌提取物 ,大多也能够抑制肿瘤细胞增殖 ,
这说明稻瘟霉体系与细胞水平的抗癌筛选体系具有
较好的平行性。由于该方法具有快速、重现性好、用
样量少、费用低、操作简单、易于观察和判断活性等
特点 ,因此是较好的初筛模型 ,对于寻找抗真菌、抗
癌先导化合物具有很好的指导作用。
T11 菌株具有良好的活性及稳定性 ,对其二次
代谢产物进行活性跟踪分离 ,可望从中得到强抑制
真菌活性的新的化合物 ,为研制开发新的有效的抗
真菌药物提供必要的先导化合物。通过对其次级代
谢产物初步进行活性跟踪分离 ,已得到了 3 个活性
化合物 ,其结果将随后报道。
粗疣合叶苔本身具有抗真菌和细胞毒作用 ,其
内生菌发酵液对真菌和肿瘤细胞也有抑制作用 ,二
者是一致的 ,这也再次证明了植物内共生菌可产生
与寄主类似药理活性物质的理论。如果内生菌产生
的活性物质和苔藓的化学成分一致 ,那么采用发酵
培养内生菌就可以解决因苔藓难以人工栽培将导致
资源短缺的问题。
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·4901· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月