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Analysis on genetic diversity of Sarcandra glabra collected from eight provenance based on ISSR markers

采用ISSR分子标记进行草珊瑚8个种源的遗传多样性分析



全 文 :.1392· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
E8]
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采用ISSR分子标记进行草珊瑚8个种源的遗传多样性分析
倪开诚1,闵 芳1,郭卫东h,斯金平2,张真真1,李欢津p
(1.浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;2.浙江林学院,浙江临安311300)
摘要:目的研究草珊瑚的遗传多样性及不同种源之间的遗传关系,为保护种质资源莫定基础。方法采用ISSR
分子标记对8个种源共51个草珊瑚样品进行了DNA分子水平的分析评价,用Popgen32软件计算遗传多样性和遗
传距离,通过UPCMA法进行聚类分析。结果筛选出10条多态性ISSR引物用于草珊瑚不同样品的ISSR—PCR,检
测得到111个位点,其中106个为多态性位点,约占95.50%。草珊瑚不同种源间遗传距离在0.0347~0.1850。8个
种源总遗传多样性主要来自种源内遗传变异,种源间分化指数G。=0.3403。结论 8个草珊瑚种源大体可以分成
2大类群。且根据遗传距离与产地海拔高度的关系,可以将其划分为较高海拔类群(800~900m)、较低海拔类群
(250~300m)、中等海拔类群(600m)。
关键词:草珊瑚;ISSR;遗传多样性;聚类分析
中图分类号:R282.7 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2008)09—1392—05
Analysisongeneticd versityofSarcandraglabracollectedfromeightprovenance
basedonISSRmarkers
NIKai—chen91,MINFan91,GUOWei—don91,SIJin—pin92,ZHANGZhen-zhenl,LIHuan—jinl
(1.CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalU iversity,Jinhua321004,China
2.ZhejiangForestryUniversity,Lin’an,311300,China)
Abstract:ObjectiveSarcandraglabrais widely—usedChinesemedicinalherb,butthewild
germplasmresourcesweredecreasing.Inordertoprotectthegermplasmresources,thegeneticd versity
andgeneticrelationshipamongthevariousprovenancesshouldbeanalyzed.MethodsISSRMolecular
markerswereusedtoanalyzethgeneticd versityofS.glabracollectedfromeightprovenances.The
geneticdiversity,geneticdistan e,andclusteranalysiswereperformedbyPopgen32softwarend
UPCMAmethod.ResultsTenscreenedpolymorphicprimerswereusedinISSR—PCRand111bandswere
amplified,amongthemincluding106polymorphiebandsthatwereabout95.50%.Geneticdistanceof
eightdifferentprovenanceswerrangedfrom0.0347一O.1850.Theg neticd versityofS.glabramainly
camefromtheinteriorva iationofeveryprovenance,forG“=0.3403.ConclusionPr venancesofS.
glabracanbedividedintotwogroupsandbasedontherelationshipofgeneticd stanceandaltitude,the
provenancescanbediviededasfollows:correspondin91yhigheraltitudegroup(800—900m);
correspondinglyloweraltitudegroup(250一300m);middlinga tituderoup(600m).
Keywords:Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai;ISSR;geneticdiversity;clusteranalysis
收稿日期:2007—12-11
基金项目:浙江省科技计划项目(2006C23008)
作童简介:.倪开域(1982一),男,浙江永康,现为浙江师范大学生化学院植物生物技术方向在读研究生.E—mail:nkcl982@163.corn
-通讯作者郭卫东 E—mail:gwdzjnu.cn
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1393·
草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai别
名接骨金粟兰、肿节风、九节风、九节茶等[1],属金粟
兰科(Chloranthaceae)草珊瑚属(Sarcandra
Gardn.)常绿半灌木,在我国主要分布于长江以南
如华东、华南及西南各省区[2矗]。草珊瑚是一种广谱
中药材,全株可入药,药性温,味苦、辛,具有清热解
毒、祛风通络、活血散结、抗菌消炎之功能,常用于治
疗由细菌感染引起的炎症、高热及预防手术感染等,
具有很高的药用价值。《中国药典>>2005年版列为法
定药材使用。近几年来,草珊瑚野生资源急剧减少,
药材质量参差不齐,通过人工栽培提高草珊瑚药材
来源的稳定性是保障草珊瑚资源可持续利用,以及
相关制药业可持续发展的必然要求。为了有效地进
行草珊瑚栽培,开展资源评价研究是非常必要的。目
前,草珊瑚相关研究主要在生物活性成分分析方面,
对草珊瑚资源进行DNA分子水平评价的研究尚未
见报道,而DNA分子水平评价可以从遗传背景出发
判断种质材料之间的差异,为种质资源的评价提供
更加稳定、可靠的参考依据。
ISSR(intel—simplesequencerepeat)即简单序
列重复区间扩增多态性分子标记“],是近年来发展
起来的十分有效的分子标记技术,具有稳定、多态性
高,简便及易操作等优点。目前已在多种动植物的亲
缘关系、种质鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性
等研究方面得到应用[4~9]。本实验应用ISSR标记对
不同种源的草珊瑚进行DNA分子水平的分析评价,
以了解不同种源草珊瑚的遗传多样性,为进一步开
展草珊瑚优良品种筛选和栽培利用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料:分别采集8个种源共51个样品,除江西
新干和江西遂川为栽培种源外其余都为野生种源,
均经斯金平教授鉴定。见表1。每个样品分别提取
DNA,用于ISSR分析。
1.2方法
裹I草珊瑚不同种源的概况及样品编号
Table1 Gener址situationofvariousprovenancesdsamplecodesofS·glabra
1.2.1 DNA的提取:DNA的提取方法为改良
CTAB大量提取法,参考王关林等[10]方法并略加修
改。用紫外分光光度计测定总DNA在230、260、280
nm的吸光度(A),通过A26。/A。。。及A260/A280比值和
1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的浓度和质量,
并稀释至50ng//-L备用。
1.2.2 ISSR引物合成:根据加拿大British
Columbia大学公布的ISSR引物序列设计[5],由上
海生工生物技术公司合成。
1.2.3PCR扩增条件及程序:采用25pL反应体系
进行PCR扩增,其中含50ng/ttL模板DNA1.0弘L、
10肛mol/L随机引物1.0弘L、10×Buffer2.5pL、
2.5mmol/LdNTPs2.0肛L、1UTaqDNA聚合
酶,加无菌超纯水使总体积达到25弘L。反应程序为
94℃预变性5min,然后进行94℃变性30S、不同退
火温度下退火40S、72℃延伸50S的循环反应,共40
个循环,最后于72℃下延伸5min,4℃保存。采用的
PCR仪为Bio—RadThermalMyCycler。
1.2.4PCR产物的电泳检测:扩增产物采用2%琼
脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,电泳缓冲液为1×
TAE,采用Bio—RadUniversalholdI凝胶成像分析
仪进行图像处理。
1.2.5数据分析:将电泳条带按有无分别赋值为
“1,’和“0”,模糊不清的条带不计,统计后转换为数值
矩阵。利用Popgen32软件进行遗传多样性分析,计
算种源问的Nei
7S遗传相似系数和遗传距离,并根
据Nei7S遗传距离利用UPGMA法(非加权配对算
术平均法)对群体进行聚类分析,构建亲缘关系图。
利用Past软件按照Ward’S相似性系数对所有个体
进行聚类分析。
2结果与分析
2.1 草珊瑚ISSR扩增产物多态性:以浙江缙云草
珊瑚DNA为模板,对合成的ISSR引物进行筛选。以
扩增条带清晰、重复性好、可获得4个以上扩增片段
万方数据
·1394- 中草稿ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
的引物作为候选引物。本研究选用其中扩增效果较
好的 UBC836、UBC835、UBC846、UBC856、
UBC807、UBC808、UBC809、UBC811、UBC840和
UBC842共10条引物用于草珊瑚ISSR—PCR扩增。
对8个种源地共51个草珊瑚样品进行ISSR扩增,获
得了清晰的扩增条带,而且多态性丰富(图1)。i0条
引物共检测得到了111个位点,其中106个为多态性
位点,约占95.50%,扩增产物条带大小主要集中于
200~2000bp。其中,以引物UBC856扩增出条带最
多,共检测到19个位点,多态性比率100%,另外
UBC835、UBC809、UBC811和UBC840多态性比率
均高达100%,其他不同引物的扩增结果多态性位点
比例也在90%以上,多态性较高(表2)。
2.2 草珊瑚8个种源的遗传多样性:根据Popgen
32软件计算,草珊瑚8个种源总的遗传多样性(日。)
M—DNA标记(kDNA/HindI+EcoRI)泳道1~17一样品编号
SY一1~SC一4顺序见表1
M—LambdaDNA×EcoRI+HindMarker
Lane1—17一JY一1一SC一4inordershown曲inTable1
图l ISSR引物UBC836对部分草珊瑚样品的扩增结果
Fig.1PCRResultsofsomesamplesofS.glabra
usingISSRprimerUBC836
表2 10种不同的ISSR引物及扩增结果
Table2 AmplificationresultsoftendifferentISSRprimersonS.glabra
0.2344大于各种源内遗传多样性(H,)O.1546。种
源间分化指数G。=0.3403,表明8个种源总遗传多
样性主要来自种源内的遗传变异,占65.97%;而种
源间的遗传变异只占34.03%。居群每代迁移数
(Ⅳ。)是测量基因流的一种方法,据N。一0.5(1一
G。)/G。计算出N,=0.9691,说明种源间存在一定
的基因交流。
应用Nei73基因多样化指数(H)、Shannon7信
息指数(J)、多态性条带百分率(PPB)、观测等位基
因数(Ⅳ。)、有效等位基因数(M)对草珊瑚各个种源
进行了遗传多样性分析(表3)。结果表明,各种源J
在0.1688~o.3153,江西新干最高为0.3153,最低
的为福建长汀0.1688。江西省作为草珊瑚的主产地
之一,其种源的各项多样性指数都明显高于其他种
源。H和,的估测结果基本一致,只是H值偏低
一些。
2.3草珊瑚8个种源的遗传距离分析:通过Nei
(1978)计算各种源间遗传距离和遗传相似性(表4)。
各种源间遗传相似性在0.8311~o.965,遗传距离
在0.0347~O.1850,说明不同种源的草珊瑚之间虽
表3各种源地遗传多样性分析
Table4 Analysisongeneticd versityofeveryprovenance
种源 居群代号 采样数 N。 Ⅳ。 H PPB/%
浙江缙云
江西新干
江西遂川
江西信丰
福建长汀
福建南平
浙江泰顺
广西东兰
0.157
0.208l
0.2039
0.1554
0.1142
0.1341
0.1193
0.1442
0.2396
0.3153
0.3071
0.2340
0.1688
0.2006
0.1769
0.2164
8
0
8
6
7
7
6
5
l
4
0
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5弱驺弘弱加∞∞孔
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4拍∞乱们;;;骢驼n
11
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1吡眈媳M吣蝇昕魄&阢艮艮凡艮如凡
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1395·
表4草珊瑚8个种源遗传距离(左下)与遗传相似性分析
(右上)
Table4 Geneticd stance(belowdiagonal)andsimilarity
(abovediagonal)ofeightprovenances
序号 1 2 3 4 5 6 7 8
***0.93120.94220.90930.87980.93160.84240.8428
0.0713---0.96590.90520.8810.94710.89700.8869
0.0,590.0347---0.94640.92120.94830.89830.8753
0.09510.09960.0550-*-0.93980.94680.89200.8668
0.1281 0.12660.08200.0621**-0.91670.88790.8311
0.07080.05440.05310.05470.0870·*·0.91770.8958
0.17150.10870.10720.11430.11880.0859***0.9533
0.1711 0.12000.13320.14290.18500.11000.0473***
然存在不同程度的遗传差异,但总体上种源间亲缘
关系较近。其中江西新干与江西遂川之间遗传距离
最小(D=0.0347),福建长汀与广西东兰之间的遗
传距离最大(D=0.1850)。
2.4草珊瑚8个种源的聚类分析:根据Nei7S遗传
距离利用UPGMA法进行聚类分析,构建种源的遗
传距离聚类图(图2)。结果表明,8个草珊瑚种源大
体可以分成2大类群,浙江缙云、江西新干、江西遂
川I、福建南平、江西信丰和福建长汀构成第1大类
群,浙江泰顺和广西东兰划为第2大类群。第1大类
群又明显地可以划分成两个小类群,江西信丰和福
建长汀聚在一起构成一个小类群,浙江缙云、江西新
干、江西遂川、福建南平则构成另外一个小类群。
类群的划分与行政区划和种源之间的地理距离
关系不大。例如同属浙江省的缙云与泰顺其草珊瑚
种源的遗传距离很远,而浙江的泰顺与广西的东兰
地理位置很远,但其草珊瑚种源的遗传距离却很近。
考察不同产地的海拔高度不难发现,草珊瑚野生种
源的遗传距离与其产地的海拔高度有着密切的关
系。第2大类群(浙江泰顺与广西东兰)分布在较高
海拔(800和900m);第1大类群的第1小类群(江西
信丰和福建长汀)分布在较低海拔(250和300m);
第1大类群的第2小类群(浙江缙云、福建南平)分布
在中等海拔(600m)。江西新干和江西遂川为栽培
种源由于存在人为的基因交流,与海拔高度关系相
对较小。
t
●一⋯一一5’
●·⋯⋯⋯●
● t
- t
● ●
7 41,
-


’呻opl浙江缙云(600m)
一-Pop2江西新干(200m)
● .-一wl·⋯一3·一——⋯———卞叩3江西遂川(500m)
-
Pop6福建南平(600m)
·⋯⋯——⋯·-一一-——Pop4江西信丰(300m)
一·——一⋯——⋯一—Pop5}目建长汀(250m)
2
Pop7浙江泰顺(800m)
Pop8广西东兰(900m)
图2 8个草珊瑚种源聚类围(种源地后数字为海拔高度)
Fig.2DendrogrambasedoneightprovenancesofS.glabra(numberbehindisaltitudeofprovenance)
2.5 草珊瑚不同种源51个样品的聚类分析:运用 扦插进行繁殖和栽培,品种来源具有多样性,且两地
Past软件按照Ward7Smethod,对所有51个样品进种源之间可能存在人为基因交流,所以江西新干和
行聚类分析(图3)。从整体上看,所得到的全部样品的 江西遂川I的样品聚类结果中出现遗传关系交叉
遗传关系聚类图与不同种源的UPGMA聚类图,在现象。
遗传结构与遗传关系上相吻合,有比较好的一致性。 3讨论
从51个样品的聚类图可以看出,浙江泰顺、广 本研究通过ISSR分子标记方法和聚类分析对8
西东兰、福建南平3个产地的草珊瑚种源区域性特 个种源地草珊瑚的遗传多样性进行了探讨。研究结
点显著,同一产地不同样品间遗传距离近。浙江缙云 果表明,草珊瑚不同种源之间的遗传距离与行政区
的5个样品在聚类图中的分布分散而且跨度大,表 划和地理距离无相关性。这可能由于种源间存在的
明该产地种源的变异比其他产地大,无明显种源区 地理隔离和不同生境条件所决定,虽然在行政划分
域性特点。其他4个产地的种源区域性特点介于上 上同属一个省份或地理距离较近,但这不代表他们
述两种类型之间。江西新干和江西遂川主要为栽培 所处的生境条件一样,相反有些不同来源且地理距
种源,在人为栽培条件下草珊瑚主要是通过分株和 离较远的种源,其遗传距离却很近,如浙江泰顺和广
万方数据
·1396· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
图3草珊瑚个体水平的聚类结果
Fig.3Dendrogramofallindividualsamples
ofS.glabra
西东兰、江西信丰和福建长汀,这可能是由于种源地
间所处相似的小生境所决定的。根据聚类结果,结合
在调查采样时记录的各产地海拔高度,发现草珊瑚
种源的遗传距离与其产地的海拔高度有着密切的关
系。除江西新干(海拔200m)和江西遂川(海拔500
m)海拔高度相差大,而遗传距离较近外,7个种源
可以根据遗传距离和产地海拔高度划分为:较高海
拔类群(浙江泰顺与广西东兰),海拔高度800900
m;较低海拔类群(江西信丰和福建长汀),海拔高度
250~300m;中等海拔类群(浙江缙云、江西遂川、
福建南平),海拔高度500~600m。
在采集样品时发现许多传统产区已经无药可
采,许多药效品质好的优良种质如不及时收集和保
存,有可能会永久消失,而且不同产地的野生药材有
效成分存在显著差异,严重影响中成药的质量。有些
种源草珊瑚表现出比较明显的种源区域性特点,如
浙江泰顺、广西东兰、福建南平,同一产地不同样品
间遗传距离近;也有些种源地不存在种源区域性特
点,如浙江缙云,同一产地不同样品间遗传距离较
远。所以,为了保障草珊瑚资源的可持续性利用,必
须加大草珊瑚种质资源收集保存的力度,而且在收
集不同产地的草珊瑚种质资源时,应尽可能广泛地
收集,不仅要在每个种源中取足够多的个体,而且要
在尽可能多的居群中取样,最大限度地收集草珊瑚
的遗传多样性,并建立规模化、标准化的种质资源
圃,进行保护性栽培,为优良品种筛选、种质创新和
栽培利用奠定基础。
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万方数据
采用ISSR分子标记进行草珊瑚8个种源的遗传多样性分析
作者: 倪开诚, 闵芳, 郭卫东, 斯金平, 张真真, 李欢津, NI Kai-cheng, MIN Fang,
GUO Wei-dong, SI Jin-ping, ZHANG Zhen-zhen, LI Huan-jin
作者单位: 倪开诚,闵芳,郭卫东,张真真,李欢津,NI Kai-cheng,MIN Fang,GUO Wei-dong,ZHANG Zhen-
zhen,LI Huan-jin(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004), 斯金平,SI
Jin-ping(浙江林学院,浙江,临安,311300)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2008,39(9)
被引用次数: 7次

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引证文献(7条)
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