全 文 ：茅苍术悬浮细胞系建立及内生真菌诱导子对其挥发油积累的影响
方 　芳1 ,戴传超1 3 ,张 　波1 ,梁侨丽2
(1. 南京师范大学生命科学学院 ,江苏 南京 　210046 ; 2. 南京中医药大学药学院 ,江苏 南京 　210046)
摘 　要 :目的 　建立茅苍术悬浮细胞系 ,研究 2 种内生真菌诱导子对茅苍术悬浮细胞产挥发油的影响。方法 　用
内生真菌诱导子对茅苍术悬浮细胞进行诱导处理后超声提取茅苍术细胞中的挥发油 ,利用气相色谱法测定挥发油
中苍术酮、苍术醇、β2桉叶醇和苍术素的量。结果 　获得的茅苍术悬浮细胞生长较快 ,于第 21 天生物量达到最大 ,
为 6195 g/ L 。未经诱导处理的茅苍术悬浮细胞中仅检出β2桉叶醇 ,其在培养 21 d 的细胞中的量达到最大 ,为
171469μg/ g。添加 2 种内生真菌 (分别属于小克银汉霉属和孔球孢霉属 ,编号为 AL4 和 AL12)的粗诱导子对茅苍
术悬浮细胞生物量及挥发油积累均有影响 ,其中 AL4 粗诱导子综合效果更好。添加 AL4 粗诱导子到 14 d 的茅苍
术悬浮细胞培养基中 ,诱导子质量浓度为每升培养基含糖 20 mg ,诱导处理 7 d 后收集细胞 ,发现其干质量比同期
对照提高 3131 % ,且检出细胞中苍术酮、苍术醇、β2桉叶醇和苍术素的干质量分别达到 141715、281395、381794、
81310μg/ g。其中β2桉叶醇的量是对照的 2122 倍。结论 　添加内生真菌诱导子对茅苍术悬浮细胞的生长及挥发
油积累均有促进作用。
关键词 :茅苍术 ;悬浮细胞 ;内生真菌诱导子 ;生物量
中图分类号 :R28611 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0320452204
Establishment of suspension cell l ine of At ract ylodes la ncea and effect of endophytic
fungal el icitors on its essential oil accumulation
FAN G Fang1 , DA I Chuan2chao1 , ZHAN G Bo1 , L IAN G Qiao2li2
(1. College of Life Science , Nanjing Normal University , Nanjing 210046 , China ; 2. School of Pharmaceutical
Science , Nanjing University of Traditional Chinese Medicine , Nanjing 210046 , China)
Abstract : Objective 　To establish t he suspension cell line of A t ract y lodes l ancea and to study t he
effect of two endop hytic f ungal elicitors on it s essential oil p roduction. Methods 　The essential oil was ex2
t racted by using ult rasonic wave after suspension cell was t reated with endop hytic f ungal elicitors. Then ,
t he determination of four compounds (at ractylone , hinesol ,β2eudesmol , and at ractylodin) was carried out
by gas chromatograp hy. Results 　By testing in various conditions , t he suspension cell line wit h a rapid
growt h rate was established. It s highest biomass (6195 g/ L) was obtained on day 21.β2Eudesmol was t he
only detection in the cont rol suspension cell , and it s highest content (171469μg/ g) was also reached on
day 21. The effect of crude elicitors of two endop hytic f ungi ( belong to Cunni n g hamel l a sp . and Gil2
m aniel l a sp . respectively , named AL4 and AL12) on the cell growt h and t he production of essentia1 oil
were investigated. Overall AL4 elicitor got bet ter effect . When suspension cell of 142day2old cultures was
exposed to AL4 elicitor (carbohydrate 20 mg/ L medium) for 7 d , t he biomass increased 3131 % over t he
cont rol , and the four compounds (at ractylone : 141715μg/ g , hinesol : 281395μg/ g ,β2eudesmol : 381794
μg/ g , and at ractylodin : 81310μg/ g) were all detected. Among them , t he content ofβ2eudesmol reached
2122 times as much as t he cont rol . Conclusion 　The cell growt h and t he accumulation of essential oil of A .
l ancea could also be promoted by adding crude elicitors of t he endop hytic f ungi AL4 and AL12.
Key words : A t ract y lodes l ancea ( Thunb. ) DC. ; suspension cell ; endop hytic f ungal elicitor ; biomass
　　茅苍术 A t ract y lodes l ancea ( Thunb. ) DC. 为
菊科苍术属多年生草本植物。其干燥的根茎为中药
苍术 ,是江苏省著名的道地药材。苍术主要活性部
位是挥发油 ,主要功效为燥湿健脾 ,祛风散寒 ,明
目[1 ] 。近年来由于野生茅苍术资源被严重破坏[2 ] ,
并且茅苍术的人工栽培有一定的难度 ,因此如何解
·254· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
3 收稿日期 :2008205225　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30500066 ,30770073)
作者简介 :方　芳 (1981 —) ,女 ,江苏淮安人 ,硕士研究生 ,主要从事微生物与植物相互关系研究。
Tel :13861553356 　E2mail : fangfang989898 @126. com3 通讯作者　戴传超　Tel : (025) 85891382 　E2mail : daichuanchao @njnu. edu. cn
决日益增长的市场需求成为了一个难题。细胞培养
可大规模生产次生产物 ,故利用它来生产挥发油是
解决供需矛盾的最佳途径。目前关于茅苍术愈伤组
织培养已有报道[3 ] ,但暂无人建立茅苍术悬浮细胞
系。本研究建立茅苍术悬浮细胞系 ,分析了不同培
养时间茅苍术悬浮细胞中挥发油的成分及量 ,并考
察了 2 种内生真菌诱导子对茅苍术细胞生长及产挥
发油的影响 ,为调控茅苍术细胞高产次生代谢产物
提供基础。
1 　材料与方法
111 　茅苍术悬浮细胞系的建立 :茅苍术于 2004 年
5 月采自宁镇山脉 (汤山) ,经南京师范大学生命科
学院植物教研室杨启银副教授鉴定。
以茅苍术无菌苗为试验材料 ,无菌苗培养基为
MS + 62BA 2 mg/ L + NAA 013 mg/ L 。取培养 25
d 的无菌苗根为外植体 ,进行愈伤组织诱导 ,培养基
为 MS + 2 ,42D 015 mg/ L + 62BA 1 mg/ L + NAA
015 mg/ L 。上述培养基均为固体培养基 (琼脂量为
10 g/ L) ,且分别附加蔗糖 30 g/ L ,灭菌前调 p H 为
610 ,培养条件均为 :光照 12 h/ d ,光照强度 1 000
lx ,温度白天 (23 ±1) ℃,夜晚 (18 ±1) ℃。
取 110 g 左右生长旺盛的疏松愈伤组织 ,转入
装有 25 mL MS 液体培养基的 100 mL 三角瓶中培
养。培养基附加 62BA 1 mg/ L + NAA 015 mg/ L
以及 3 %蔗糖 ,灭菌前调 p H 为 610。培养温度
(23 ±1) ℃,摇床转速 120 r/ min。
悬浮细胞每隔 14 d 继代 1 次 ,每次继代时将培
养物摇匀 ,用无菌移液管吸取培养基中的培养物加
入新鲜培养液中 ,新鲜培养液与原细胞培养基比例
为 3 ∶1。继代 5 次以上的培养细胞可达到稳定
状态。
112 　细胞生长曲线的测定 :用继代培养 6 次后的悬
浮细胞建立生长曲线。0～35 d 每 7 天取样 1 次 ,测
定细胞干质量、耗糖曲线及 p H 变化情况。细胞干
质量的测定方法为 :用烘干称质量的滤纸过滤茅苍
术悬浮细胞 ,蒸馏水洗 3 次 ,真空冷冻干燥至恒质量
(取 3 次测定结果平均值) 。发酵液中残糖的测定采
用苯酚2硫酸法[4 ] ,p H 值采用德国赛多利斯 sartori2
us 酸度计测定。
113 　苍术酮、苍术醇、β2桉叶醇和苍术素的定性和
定量
11311 　仪器条件与试药 :惠普上海分析仪器有限公
司 1890 型气相色谱仪 ( HPSF21890 GC) 。程序升
温 :从 60 ℃开始以 10 ℃/ min 上升至 190 ℃并保持
2 min ,之后以 5 ℃/ min 上升至 210 ℃保持 2 min ,
再以 10 ℃/ min 上升至 220 ℃保持 8 min。数据处
理用 N2010 型色谱工作站 (浙江大学智达信息工程
有限公司) 。其他仪器条件同文献方法[5 ] 。
苍术酮、苍术醇、β2桉叶醇和苍术素对照品由南
京中医院大学梁侨丽副教授提供 ,经气相色谱面积
归一化法计算质量分数大于 99 %。正十五醇和α2
硝基萘为 GC 级 ,其他试剂均为分析纯。
11312 　保留时间法定性 :苍术酮、苍术醇和β2桉叶
醇采用正十五醇为内标[6 ] 。苍术素则选用α2硝基萘
为内标[ 7 ] ,采用保留时间法对苍术酮、苍术醇、β2桉
叶醇和苍术素进行定性。当存在保留时间推移时 ,
则在每张指纹图谱上选择 2 个内标峰作为保留时间
校正峰 ,采用二点校正法进行保留时间的校正[8 ] 。
11313 　标准曲线的绘制 :精确称取 4 种对照品和 2
种内标各 5 mg ,分别加环己烷配制成 5 mg/ mL 的
溶液。然后精密吸取 5 个不同体积的对照品溶液
(吸取苍术酮溶液的体积分别为 25、50、75、100、150
μL ;吸取苍术醇、β2桉叶醇和苍术素溶液的体积分别
为 25、50、100、150、200μL ) ,分别置于 1 mL 量瓶
中 ,各加入内标溶液 100μL ,用环己烷稀释至刻度 ,
摇匀。分别精密吸取 1μL ,注入气相色谱仪测定 ,
由对照品浓度与对照品/ 内标峰面积的比值进行
回归。
114 　苍术酮、苍术醇、β2桉叶醇和苍术素最低检测
浓度的确定 :将 01125 mg/ mL 的 4 种对照品溶液不
断稀释后分别精密吸取 1μL ,注入气相色谱仪测
定。当信噪比 (SN R)为 3 ∶1 时的进样质量浓度即
为该化合物的最低检测质量浓度。
115 　茅苍术悬浮细胞中挥发油的提取和测定 :精确
称取一定量的茅苍术干细胞 ,加 4 倍量 (1 ∶4) 的环
己烷过夜冷浸 ,之后超声 15 min ,5 000 r/ min 离心
4 min 后取上清液。真空旋转蒸发仪浓缩 ,最后在
浓缩液中加入内标 ,定容到一定体积。用上述气相
色谱法分析。
116 　内生真菌粗诱导子的制备、总糖的测定及诱导
细胞实验 :内生真菌 AL4 和 AL12 分别分离自茅苍
术叶片和茎 ,经南京师范大学生命科学院硕士研究
生陈佳昕鉴定分别属于小克银汉霉属 ( Cunni ng ha2
mel l a sp . )和孔球孢霉属 ( Gil m aniel l a sp . ) 中的一
个种[9 ] 。两株内生真菌在马铃薯葡萄糖液体培养基
( PD) 28 ℃、150 r/ min 培养 6 d ,滤纸滤过得菌丝
·354·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
体。充分洗涤过的菌丝体在 10 倍体积的重蒸馏水
中匀浆 ,后滤过 ,滤液 121 ℃处理 20 min ,此即为内
生真菌粗诱导子[10 ] 。采用苯酚2硫酸法[4 ] 测定其总
糖的量。
在第 14 天的茅苍术悬浮细胞培养基中分别加
入 AL4 和 AL12 的粗提物 ,加入量按菌液中的含糖
量计算 ,本研究采用的诱导子质量浓度为每升培养
基含糖 20 mg。取样时刻为加入诱导子后的第 7
天 ,测定细胞干质量、挥发油成分及量。以不加诱导
子的作为对照。
2 　结果与分析
211 　细胞生长曲线的建立 :茅苍术细胞在一个生长
周期 (35 d)中的生长情况见图 1。35 d 的培养周期
中 ,茅苍术悬浮细胞的生长曲线基本上呈现“S”型。
0～7 d 为延滞期 ,之后进入对数生长期 ,21 d 时细
胞生物量达到最大 ,为 6195 g/ L 。耗糖曲线也表
明 :在 21 d 时培养基中的糖大部分已被利用。此
外 ,p H 在整个生长周期内维持在 5101～5189 ,变化
趋势为 0～7 d 不断下降 ,之后逐渐升高。
培养时间/ d
图 1 　茅苍术悬浮细胞的生长
Fig. 1 　Growth of suspension cell from A. lancea
212 　苍术酮、苍术醇、β2桉叶醇和苍术素的定性和
定量 :4 种对照品及 2 种内标的混合进样图谱见图
2。4 种对照品的标准曲线为 ,苍术酮 : Y = 21115 0
X + 01035 3 , R2 = 01999 2 ,在 01125～01750 mg/
mL 线性关系良好 ; 苍术醇 : Y = 11241 1 X -
01020 8 , R2 = 01998 9 ,在 01125～11000 mg/ mL 线
性关系良好 ;β2桉叶醇 : Y = 11318 6 X - 01051 0 ,
R2 = 01998 2 ,在 01125～11000 mg/ mL 线性关系良
好 ;苍术素 : Y = 11758 2 X - 01013 2 , R2 = 0. 999 4 ,
在 01125～11000 mg/ mL 线性关系良好。
213 　苍术酮、苍术醇、β2桉叶醇和苍术素的最低检
测质量浓度 :采用上述方法 ,测得苍术酮、苍术醇、β2
桉叶醇、苍术素的最低检测质量浓度分别为
01625 0、11562 5、31125 0、11000 0μg/ mL 。
214 　不同培养时间茅苍术悬浮细胞中挥发油分析 :
对培养了 14、21、28、35 d 的茅苍术悬浮细胞中的挥
发油进行分析 ,结果仅检出β2桉叶醇。原因可能为
细胞在此培养条件下不产生苍术酮、苍术醇和苍术
素 ,也可能是细胞产生这 3 种物质的量低于本研究
的最低检出量。此外 ,不同培养时间的细胞中β2桉
叶醇的量也不一样。在 14 和 35 d 的茅苍术悬浮细
胞中β2桉叶醇的量很少 (未能定量) ,而 21 d 的悬浮
细胞中β2桉叶醇的干质量最高 ,为 171469μg/ g ,其
次为 28 d 的悬浮细胞中的量 ,为 121962μg/ g。图
3 为 21 d 茅苍术悬浮细胞气相色谱图。
215 　内生真菌粗诱导子对茅苍术悬浮细胞生长及
挥发油产量的影响 :添加内生真菌 AL4 和 AL12 的
粗诱导子对茅苍术悬浮细胞的生长具有微弱的促进
作用 ,分别使诱导后第 7 天 (即细胞培养的第 21 天)
的细胞干质量达到对照的 103131 %和 104103 % ;且
经诱导后的细胞中均能检测到苍术酮、苍术醇、β2桉
叶醇和苍术素的存在 ,同时β2桉叶醇的量有了不同
程度的提高 (分别为对照的 2122 倍和 1105 倍) 。结
果见表 1。总体来看 , AL4 粗诱导子的效果更好。
图 4 为用 AL4 粗诱导子诱导 7 d 后的茅苍术悬浮
细胞气相色谱图。
·454· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 3 期 2009 年 3 月
表 1 　内生真菌粗诱导子对茅苍术悬浮细胞生长及挥发油产量的影响( x ±s , n = 3)
Table 1 　Effect of endophytic fungi elicitors on growth and essential oil yield
of suspension cell from A. lancea ( x ±s , n = 3)
处理类别
生物量
/ (g ·L - 1)
质量分数/ (μg ·g - 1)
苍术酮 苍术醇 β2桉叶醇 苍术素
对照 6. 95 ±0. 07 - - 17. 469 ±1. 346 -
AL4 粗诱导子 7. 18 ±0. 08 14. 715 ±1. 806 28. 395 ±1. 799 38. 794 ±2. 403 8. 310 ±0. 808
AL12 粗诱导子 7. 23 ±0. 05 11. 217 ±0. 796 12. 890 ±0. 634 18. 346 ±1. 089 8. 193 ±0. 206
t/ min
12苍术酮　22苍术醇　32β2桉叶醇　42正十五醇
52α2硝基萘　62苍术素
12at ractylone 　22hinesol 　32β2eudesmol 　42pentadecanol
52α2nit ronapht halene 　62at ractylodin
图 4 　AL4 粗诱导子诱导 7 d后的茅苍术悬浮细胞气相色谱图
Fig. 4 　GC Chromatogram of suspension cell treated
with AL4 crude elicitor for 7 d
3 　讨论
311 　悬浮细胞系的建立 :利用植物细胞培养技术生
产药用次生代谢产物 ,是目前生物技术重要的研究
内容。与在固体培养基上培养相比 ,细胞悬浮培养
能使细胞繁殖速度加快 ,提供大量均一的植物细胞。
本研究首次建立茅苍术悬浮细胞系 ,这一体系生长
较快 ,分散性好 ,稳定均一 ,可适用于生理、生化和细
胞周期调控等方面的研究。
312 　诱导子的利用 :目前 ,制约细胞培养法产业化
的关键问题之一是培养细胞中次生代谢产物的量偏
低。因此 ,有必要进一步研究调控植物细胞高产次
生代谢物的方法及相关机制。利用真菌诱导子促进
植物细胞次生代谢物积累即为其中的一条重要途
径。近年来 ,这方面的研究越来越多 ,也有很多研究
成功地利用真菌诱导子刺激了悬浮细胞中萜类的合
成[11 ,12 ] 。但目前对于真菌诱导子的研究 ,大多集中
在植物病原菌诱导子 ,而利用植物内生真菌制成诱
导子的例子不多。本实验则采用内生真菌粗诱导
子 ,其优点是对细胞生长有促进作用 ,且能显著地提
高茅苍术悬浮细胞中挥发油的量 ,即达到双增长。
这与病原菌诱导子诱导产生的单增长 (即抑制细胞
生长 ,仅提高次生代谢物产量) 显著不同[13 ] 。原因
可能是内生真菌和病原菌都能影响细胞的代谢途
径 ,但二者的刺激强度和方式不同。在用内生真菌
AL4 和 AL12 粗诱导子处理过的 21 d 茅苍术悬浮
细胞主要成分与野生茅苍术相近 ,虽然前者的挥发
油的量远低于后者 ,但这显示出该方法产挥发油的
潜能。真菌诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导
子加入时间以及诱导的时间长短等多种因素密切
相关[14 ] 。
在本实验中 ,也发现添加内生真菌 AL4 和
AL12 粗诱导子的处理组与对照组相比 ,茅苍术悬
浮细胞培养基碱化 ;细胞中超氧化物歧化酶 (SOD) 、
过氧化物酶 ( POD) 和苯丙氨酸解氨酶 ( PAL ) 活性
增高。这些变化是否与诱导子提高茅苍术悬浮细胞
中挥发油产量直接相关 ,还需要进一步的研究。
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