全 文 ：理因素与 CFb 共孵育 6 h,即可见到 NO 及 iNOS
的变化,说明在 Ang Ò 诱导 CFb 增殖的过程中,有
NO 系统的参与,并且是作为一种早期反应的信号。
与模型组比较,原花青素 ( 25~ 100 mg / L ) 可剂量
依赖性升高细胞培养液中 NO 的量、增加 iNOS 活
性。表明原花青素对 CFb 的 iNOS-NO 系统的活
性具有促进作用。
细胞周期可在正、负调控因素共同作用下协调
地进行,正调控因素作用的增强和负调控因素作用
的减弱是细胞增殖的机制。细胞周期蛋白依赖性激
酶抑制因子 ( CKI) 是细胞周期进程的负性调节因
子。CKI 中的 p27 蛋白亚型目前被认为是细胞内
调节增殖及细胞周期的重要影响因素 [ 7]。有研究表
明,在高血压左心室肥厚的形成过程中, p27 蛋白水
平下降,证明 p27 在心室肥厚中发挥重要作用[ 8] ;
血小板源性生长 ( PDGF) 和血管升压素能通过下
调 p27 蛋白表达, 使静止期血管平滑肌细胞
( VSMC) 通过 G 1期进入 S 期开始增殖[ 9]。Diep
等[ 10] 也发现,给动物注射一定量的 Ang Ò 后,血管
壁 DNA 合成增加, p21, p27 的表达降低。
以往的研究表明, 牛磺酸、苦参碱等抗氧化剂在
发挥抑制 CFb 增殖作用时, 主要是影响 p27 的表
达,对于细胞周期正性调节因子未发现有作用[ 7]。
本实验通过免疫细胞化学染色证明, CFb 中存在
p27 的表达,在 Ang Ò 的作用下, p27 的表达降低,
细胞增生活跃;给予原花青素后, CFb 的 p27 蛋白的
表达明显增加,细胞增殖受阻。表明原花青素可通过
促进 p27蛋白表达而发挥对 CFb 细胞周期的调控,
使 CFb停滞于 G0 / G1期,从而抑制 CFb 的增殖及胶
原的合成,降低 ECM 的沉积,抑制心肌纤维化。
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神经网络分析香丹注射液抗心肌缺血有效成分的谱效相关性研究
尹永芹,朱俊访,沈志滨1* ,唐春萍,杨超燕, 孙 悦
(广东药学院中药学院,广东 广州 510006)
摘 要: 目的 寻找香丹注射液中抗垂体后叶素致大鼠心肌缺血的主要有效成分。方法 采取大鼠舌下 iv 垂体
后叶素 ( 01 5 U / kg ) 复制大鼠急性心肌缺血模型,观察香丹注射液的不同萃取部位及萃取部位的组合对大鼠注射
垂体后叶素后不同时间点 Ò 导联心电图 T 波变化情况, 结合香丹注射液不同极性萃取部位及萃取部位组合的指纹
图谱,运用神经网络分析抗垂体后叶素致心肌缺血的香丹注射液中主要有效成分。结果 香丹注射液中主要成分
对垂体后叶素引起的心肌缺血模型 T 波抬高存在影响, 丹酚酸 D和丹酚酸 A 在 0、5、10 s 对 T 波抬高的抑制作用
随质量分数的提高而增强, 其余成分在 5 s、10 s、3 min 对 T 波抬高主要为促进作用。结论 香丹注射液抗垂体后
叶素致心肌缺血的主要有效成分为丹酚酸 A 和丹酚酸 D。
关键词: 香丹注射液; 抗心肌缺血; 谱效相关性; 神经网络
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 08-1284-04
#1284# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
* 收稿日期: 2008-12-18 基金项目:国家科技支撑计划资助项目 ( 2006BAIB03-06) ; 广东省科技计划资助项目 ( 2008B030301035) ; 广东省自然科学基金资助项目 ( 8451022401001607) ; 广东药学院科研启动项目 ( 2007ZYX07)作者简介:尹永芹( 1977 ) ) ,女,黑龙江七台河人,博士,讲师,主要从事中药及天然药物有效成分及谱效相关性研究。
Tel: ( 020) 39352612 E- mai l: yongqinyin@ 126. com
* 通讯作者 沈志滨 Tel: ( 020) 39352179 E-m ail: sz b8113@ yah oo. com . cn
香丹注射液由丹参和降香两味中药组成,具有
祛瘀止痛、活血通经、除烦安神的功效, 可用于治疗
中风、脑供血不足、冠心病等疾病 [ 1] , 另外香丹注射
液对脑出血急性期也有较好的临床疗效[ 2, 3] 。香丹
注射液依次用石油醚( A )、氯仿( B)、醋酸乙酯 ( C)
和正丁醇( D)萃取, 共得到 A、B、C、D和水层 ( E) 5
个极性部位及组合,并采用 HPLC 法分别测定各萃
取部位和萃取部位组合的指纹图谱。本实验采用大
鼠舌下 iv 垂体后叶素 ( 01 5 U/ kg ) 复制大鼠急性
心肌缺血模型,观察香丹注射液的不同萃取部位及
萃取部位组合对模型大鼠 iv 垂体后叶素后不同时
间点 Ò 导联心电图 T 波的影响, 结合香丹注射液萃
取部位及部位组合的指纹图谱, 运用神经网络分析
抗垂体后叶素致心肌缺血的主要有效成分,为香丹
注射液深入研究提供参考。
1 材料与方法
11 1 仪器与试药: Waters 高效液相色谱仪, PDA
检测器, EmPow er 色谱工作站, 色谱柱 Allt ima C18
柱 ( 250 mm @ 4. 6 mm , 5 Lm) , 大连依兰特分析仪
器有限公司) , Sartor ius 天平, M edLab-6. 2 生物信
号采集处理系统 (南京美易科技有限公司)。香丹
注射液,正大青春宝药业提供 (批号 0702071) , 垂
体后叶素, 南京新百药业有限公司 (批号 030307) ,
水合氯醛,上海润捷化学试剂有限公司,硝酸甘油,
广州白云山明兴制药有限公司 (批号 20060725) ,
原儿茶醛、丹酚酸 B、丹参素对照品均购于中国药品
生物制品检定所, 乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析
纯,双蒸水 (自制)。
11 2 实验动物: SPF 级 SD 大鼠, 雄性, 体质量
200~ 250 g ,由广东省医学实验动物中心提供,动物
合格证号: 2007A004。
11 3 萃取部位及组合的制备:香丹注射液依次用石
油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取,每次 500 mL,萃
取 3 次,得到 5 个不同极性部分,分别为石油醚部
分( A)、氯仿部分( B)、醋酸乙酯部分( C)、正丁醇部
分( D)和水部分 ( E )。萃取部位分别浓缩至 500
mL,根据实验要求组合不同萃取部位配伍组 ( AB、
AE、BD、CD、CE、DE、ABC、ACD、BCE、BDE 和
ADE) ,按体积 1B1 进行配伍, 浓缩至干, 加入聚山
梨酯 80与注射用水溶解,滤过即得供试品溶液。
11 4 动物筛选、分组与给药 [ 4] : SPF 级 SD 大鼠
200只, 33 g/ L 水合氯醛 ip 麻醉,背位固定,接生物
信号系统, 筛选 Ò 导联心电图曲线正常动物 160
只,筛选指标为: J 点 ( QRS 波群与 ST 段交界处)
明显者,心率较齐等。随机分为 20组, 每组 8只: 对
照组,模型组, 硝酸甘油组 (阳性对照组, 01 25 mg/
kg ) ,香丹注射液组,香丹注射液萃取部位 A、B、C、D
和 E组,极性部位组合 ( AB、AE、BD、CD、CE、DE、
ABC、ACD、BCE、BDE 和 ADE) 组。香丹注射液及
萃取部位和萃取部位组合给药剂量为生药 16 g/
kg ,连续给药 2 d, 第 1天 ip 给药 ( 01 5 mL/ 100 g ) ,
第 2天用 33 g/ L 水合氯醛 ip 麻醉, 背位固定, 接
Medlab 生物信号系统, 然后舌下 iv 相应的药物
(保持匀速) ,给药 1 min 后除对照组外各组舌下 iv
垂体后叶素 01 5 U/ kg ( 1 mL/ kg , 5 s 内匀速注射
完毕) 进行造模,对照组给予等容量的 01 9% 氯化
钠注射液, 分别记录注射垂体后叶素后 0 s、5 s、
10 s、3 min、5 min、10 min 的心电图,比较各组间心
电图 T 波值变化情况 ( $T = 造模后各时间点 T 波
值- 造模前 T 波值)。
11 5 数据统计方法: 数据统计学处理采用 SPSS
101 0 统计软件包, 计量资料用 x ? s 表示,组间比较
采用秩和检验。
2 结果
21 1 香丹注射液及各萃取部位和部位组合对垂体
后叶素致心肌缺血大鼠心电图 T 波改变的影响: 萃
取部位组合 ADE 和 BDE 组在 0、5、10 s 时间点 T
波变化值明显低于模型组 ( P< 01 01) , 各给药组结
果见表 1。
21 2 谱效相关性分析
21 21 1 采用 HPLC 法对各萃取部位色谱峰的表
征:按 11 3项下制备供试液,取供试液即 A、B、C、D、
E、AB、AE、BD、CD、CE、DE、ABC、ACD、BCE、
BDE、ADE、ABCDE 部位各 10 LL, 注入高效液相
色谱仪, 以乙腈-01 026% 磷酸水系统进行梯度洗
脱,于 288 nm 波长下检测,体积流量 1 mL/ min, 记
录 65 min。共分离出来 8 个色谱峰(图 1) , 其保留
时间 ( t R ) 和质量浓度分别为: 丹参素 ( 41 76 m in,
11 766 mg / mL, 1 号峰 )、原儿茶醛 ( 101 80 m in,
01 447 mg/ mL, 2号峰)、丹酚酸 D ( 381 84 m in, 3号
峰)、迷迭香酸 ( 441 18 m in, 01 317 mg/ mL, 4号峰)、
未知 ( 451 40 min, 5 号峰)、丹酚酸 B ( 511 09 m in,
01 566 mg/ mL, 6 号峰 )、丹酚酸 A ( 551 04 m in,
01 236 mg/ mL, 7号峰)、丹酚酸 C ( 591 06 min, 8 号
峰)。
21 21 2 采用 BP 神经网络进行抗心肌缺血实验的
谱效相关性分析: 选取 A、B、C、D、E、AB、AE、BD、
CD、CE、DE、ABC、ACD、BCE、BD、ADE 共 16个部
#1285#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
表 1 香丹注射液各萃取部位及部位组合对垂体后叶素致大鼠心肌缺血 T波抬高的影响 ( x ? s, n= 8)
Table 1 Effect of extracting fractions and their combination in Xiangdan Injection on T wave
raise induced by pituitrin ( x? s, n= 8)
组别 $T / mV
0 s 5 s 10 s 3 min 5 min 10 m in
对照 01 022 ? 01 016 01 019 ? 01019 01012 ? 01 015 01001 ? 01 013 01 001 ? 01 020 - 01 023 ? 01 021
模型 01 098 ? 01 040 v v 01 072 ? 01053 v 01075 ? 01 059 v - 01045 ? 01 054 v - 01 054 ? 01 036 v v - 01 055 ? 01 042
香丹注射液 01 024 ? 01 018* * 01 041 ? 01046* 01029 ? 01 051* - 01039 ? 01 033 - 01 040 ? 01 036 - 01 003 ? 01 053
硝酸甘油 01 039 ? 01 019* * 01 022 ? 01028* 01018 ? 01 033* - 01055 ? 01 035 - 01 053 ? 01 029 - 01 056 ? 01 053
A 01 066 ? 01 031 01 039 ? 01024 01019 ? 01 038 - 01057 ? 01 066 - 01 051 ? 01 059 - 01 050 ? 01 064
B 01 055 ? 01 030* 01 049 ? 01028 01026 ? 01 036 - 01048 ? 01 026 - 01 057 ? 01 041 - 01 032 ? 01 038
C 01 024 ? 01 025* * 01 015 ? 01025* 01017 ? 01 023* - 01064 ? 01 057 - 01 075 ? 01 043 - 01 068 ? 01 044
D 01 012 ? 01 049* * 01 032 ? 01046 01029 ? 01 029 - 01028 ? 01 051 - 01 040 ? 01 047 - 01 056 ? 01 035
E 01 083 ? 01 081 01 080 ? 01075 01063 ? 01 065 - 01015 ? 01 045 - 01 021 ? 01 041 - 01 011 ? 01 034
AB 01 083 ? 01 039 01 068 ? 01024 01064 ? 01 068 - 01074 ? 01 049 - 01 056 ? 01 042 - 01 075 ? 01 045
AE 01 037 ? 01 031* * 01 049 ? 01054 01021 ? 01 051* 01022 ? 01 062 01 025 ? 01 028 01 033 ? 01 026
DE 01 021 ? 01 040* * 01 031 ? 01044 01022 ? 01 079 - 01049 ? 01 046 - 01 049 ? 01 062 - 01 053 ? 01 074
CD 01 068 ? 01 027 01 053 ? 01033 01111 ? 01 137 - 01095 ? 01 057* - 01 084 ? 01 071 - 01 107 ? 01 061
CE 01 024 ? 01 029* 01 018 ? 01046* 01002 ? 01 035* - 01053 ? 01 039 - 01 055 ? 01 038 - 01 065 ? 01 032
BD 01 047 ? 01 039* 01 027 ? 01034 01037 ? 01 038 - 01036 ? 01 077 - 01 047 ? 01 083 - 01 048 ? 01 034
ADE 01 003 ? 01 054* * - 01 005 ? 01041* - 01016 ? 01 051* * - 01016 ? 01 046 01 002 ? 01 030* 01 007 ? 01 054
BCE 01 014 ? 01 023* * 01 004 ? 01019* * 01001 ? 01 042* - 01047 ? 01 058 - 01 021 ? 01 047 - 01 040 ? 01 030
ACD 01 037 ? 01 037* 01 028 ? 01028* 01016 ? 01 048 - 01001 ? 01 045 - 01 001 ? 01 042* - 01 020 ? 01 058
ABC 01 062 ? 01 048 01 054 ? 01052 01046 ? 01 046 - 01060 ? 01 042 - 01 077 ? 01 042 - 01 073 ? 01 035
BDE 01 016 ? 01 020* * 01 013 ? 01017* 01005 ? 01 042* * - 01002 ? 01 031 - 01 007 ? 01 038* - 01 016 ? 01 034
与对照组比较: v v P< 01 01; 与模型组比较: * P < 01 05 * * P < 0101
v v P < 01 01 v s cont rol group; * P< 01 05 * * P< 01 01 v s m odel group
1-丹参素 2-原儿茶醛 3-丹酚酸D 4-迷迭香酸 5-未知化合物
6-丹酚酸 B 7-丹酚酸 A 8-丹酚酸 C
1-den shensu 2-protocatechu ic aldehyde 3- salvianolic acid D 4-
r os emarinic acid 5- unkn ow n compound 6-salvianolic acid B
7-salvianolic acid A 8-salvianolic acid C
图 1 CE部位的 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC Chromatogram of CE fraction
位的各色谱峰数据作为输入层神经元, 选取心肌缺
血实验 0、5、10 s 药效学指标作为输出神经元。中
间层选择 1层神经元, 建立 BP 神经网络[ 5] 。所有
实验数据在输入前应用规格化函数 A ( i) = A ( i ) /
MAX( A) 进行处理,使所有输入、输出样本规范到
[ 0, 1]的范围内。建立 BP 神经网络, 经过反复试
验,将隐含层神经元数目确定为 8, 输入层和隐含层
间以及隐含层和输出层间的转换函数都采用对数
Sigmoid 函数 - logsig , 训练函数为 Levenberg-
M arquardt 优化法-trainlm。采用默认的初始化参
数对网络连接权重和阈值进行初始化, 设置最大的
循环迭代为 1 000;设定学习速率为 01 01。
由于各部位用 HPLC 表征共 8 个色谱峰, CE
部位包含此 8个色谱峰, 因此以 CE 部位为背景, 通
过应用各部位 8 个色谱峰的 HPLC 数据与药效学
指标的非线性映射模型,利用仿真函数 sim 加以模
拟,可以得出各个色谱峰在 CE 部位为背景下的量
效关系[ 6]。经过 200次的学习和训练, 网络误差从
11 684 4 下降到 11 328- 30。通过仿真函数 sim 模
拟,结果显示,丹酚酸 D和丹酚酸 A 在 0、5、10 s 对
T 波抬高的抑制作用随质量分数的提高而增加。其
余成分在 5 s、10 s、3 m in 对 T 波抬高主要为促进作
用。BP 神经网络分析结果见图 2。
3 讨论
近年来随着医疗水平的提高和知识普及, 心肌
缺血发病率和病死率有下降趋势,但仍然是导致死
亡的重要原因之一。实验中采用垂体后叶素复制心
肌缺血模型,以 T 波抬高为观察指标。本实验中各
萃取部位含生药量为 16 g/ kg, 其中萃取部位组合
ADE 和 BDE 能明显抑制注射垂体后叶素后引起的
T 波抬高,通过神经网络分析丹酚酸 A 和丹酚酸 D
能够在 0、5、10 s 对 T 波抬高的抑制作用随质量分
数的提高而增强。丹酚酸 A 和丹酚酸 D为酚酸类
#1286# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
1-0 s 2-5 s 3-10 s
图 2 BP 神经网络分析共有峰抗心肌缺血作用
Fig. 2 BP neural networks analysis on antimyocardial ischemia of common peaks
成分,极性较大主要存在 D和 E部位与实验结果一
致,表明人工神经网络在复方成分的药效学研究,具
有一定的实用价值。
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