全 文 ：酶联免疫法研究注射用聚乙二醇化重组人粒细胞集落
刺激因子的临床药动学
蔡永明1 ,陈拯民1 ,李 　铭1 ,刘昌孝1 ,刘 　鹏2 ,韩晓红2 ,石远凯2 3
(11 天津药物研究院 药代动力学与药效动力学省部共建国家重点实验室 ,天津 　300193 ;
21 中国医学科学院肿瘤医院 ,北京 　100021)
摘 　要 :目的 　研究癌症患者化疗后单次 sc 不同剂量的注射用聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子 ( PEG2
rh G2CSF) 的药动学。方法 　采用酶联免疫分析检测 ( EL ISA) 法测定癌症患者 sc PEG2rh G2CSF 后的血药浓度 ,
实验数据用 3P97 药动程序拟合分析并计算药动学参数。结果 　癌症患者化疗后 48 h 单次 sc PEG2rh G2CSF 30、
60、100、200 μg/ kg ,每组 4 例病人的平均消除半衰期 ( t1/ 2ke ) 差异不大 ,分别为 (4718 ±713) 、(4918 ±619) 、
(4517 ±916) 和 (4416 ±613) h ;平均达峰时间 ( tmax ) 分别为 (2110 ±610) 、(2410 ±0) 、(2110 ±610) 、(4210 ±
1210) h ;平均清除率 ( CL) 分别为 (5144 ±0186) 、(5106 ±0169) 、(3136 ±0135) 、(3131 ±1120) mL/ (kg ·h) , CL
有随剂量增加而下降的趋势 ;平均达峰浓度 ( Cmax ) 分别为 (5410 ±1018) 、(12910 ±2019) 、(34419 ±7314) 、
(82819 ±24516) ng/ mL ;平均药时曲线下面积 (AUC0～432 h ) 分别为 (5 714 ±786) 、(12 781 ±1 745) 、(32 714 ±
6 486) 、(85 142 ±26 186) h ·ng/ mL ; Cmax和 AUC 与剂量均呈正相关。结论 　PEG2rh G2CSF 的较长半衰期和较
慢清除率 (与 rh G2CSF 相比) 保证了该药在体内的长效特性。
关键词 :聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子 ( PEG2rh G2CSF) ; EL ISA ; 药动学
中图分类号 :R285161 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0821267204
Pharmacokinetics of PEG2rhG2CSF of injection to cancer patients by EL ISA
CA I Yong2ming1 , CH EN Zheng2min1 , L I Ming1 , L IU Chang2xiao1 ,
L IU Peng2 , HAN Xiao2hong2 , SHI Yuan2kai2
(11 State Key Laboratory of Pharmacokinetics and Pharmacodynamics , Tianjin Institute of Pharmaceutical Research ,
Tianjin 300193 , China ; 2. Cancer Hospital , Chinese Academy of Medical Sciences , Beijing 100021 , China)
Abstract : Objective 　To explore clinical p harmacokinetics by sc injection of pegylated recombinant hu2
man granulocyte colony2stimulating factor ( PEG2rh G2CSF) at various doses to cancer patient s wit h chemo2
t herapy2induced neut ropenia. Methods 　Serum concent ration of PEG2rh G2CSF was measured by an en2
zyme2linked immunosorbent assay ( EL ISA) . Pharmacokinetic parameters were calculated wit h 3P97 sof t2
ware. Results 　After 48 h chemotherapeutic t reat ment , patient s received single sc doses of PEG2rh G2CSF
at 30 , 60 , 100 , and 200μg/ kg. In every group wit h four cases showed no significant difference , t he mean
elimination half2life ( t1/ 2ke ) was (47. 8 ±7. 3) , (49. 8 ±6. 9) , (45. 7 ±9. 6) , and (44. 6 ±6. 3) h , respective2
ly. The mean time to reach peak concent ration ( tmax ) was (21. 0 ±6. 0) , (24. 0 ±0) , (21. 0 ±6. 0) , and
(42. 0 ±12. 0) h. The mean drug clearance f rom serum ( CL) was (5. 44 ±0. 86) , (5. 06 ±0. 69) , (3. 36 ±
0. 35) , and ( 3. 31 ±1. 20) mL/ ( h ·kg) . The mean peak concent ration ( Cmax ) was ( 54. 0 ±10. 8 ) ,
(129. 0 ±20. 9) , (344. 9 ±73. 4) , and (828. 9 ±245. 6) ng/ mL . The mean area under t he serum concent ra2
tion2time curve (AUC0～432 h ) was (5 714 ±786) , (12 781 ±1 745) , (32 714 ±6 486) , and (85 142 ±26 186)
h ·ng/ mL . Pharmacokinetics of PEG302rh G2CSF was dose2dependent , bot h Cmax and t he AUC were in2
creased wit h t he increasing doses. CL , however , was decreased with dose increasing. Conclusion 　Due to
the longer t1/ 2ke and slower CL , PEG2rh G2CSF result s in more desirable p harmacokinetic p roperties i n v ivo
compared to rh G2CSF.
Key words : pegylated recombinant human granulocyte colony2stimulating factor ( PEG2rh G2CSF) ;
enzyme2linked immunosorbent assay ( EL ISA) ; p harmacokinetics
·7621·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008212225　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家“863 计划”资助项目 (2003AA2Z347D) ;国家“973 计划”资助项目 (2004CB518902)
作者简介 :蔡永明 (1962 —) ,女 ,天津人 ,副研究员 ,主要从事生物工程新药的药动学及临床前安全性评价研究。Tel : (022) 23006871 　
Fax : (022) 27375473 　E2mail : caiymtj @126. com
　　重组人粒细胞集落刺激因子 ( rh G2CSF) 是防
治肿瘤放化疗引起的中性粒细胞减少症的有效药
物 ,具有提高外周血中性粒细胞数的功能 ,在造血干
细胞移植中被广泛应用[1 ,2 ] 。但其半衰期短 ,需要
每日给药[3～5 ] 。聚乙二醇 ( PEG) 化重组人粒细胞
集落刺激因子 ( PEG2rh G2CSF) 是通过基因重组技
术生产的 PEG 化多肽类一类新药 ,是将相对分子
质量为 20 000 的单链 PEG 共价偶联到 rh G2CSF
的 N 末端氨基上而形成的长效制剂。PEG 本身没
有明显的生物活性[6～8 ] ,PEG2rh G2CSF 与 rh G2CSF
作用机制相同 ,都是与细胞表面特异性受体结合 ,促
进骨髓造血干细胞的分化和增值 ,但 PEG 化后的
rh G2CSF 降低肾清除并延长药物在体内持续时间[9 ] 。
本实验研究了癌症患者化疗后 48 h 单次 sc 不同剂
量的 PEG2rh G2CSF ,用酶联免疫 ( EL ISA) 法[10 ]检测
药后不同时间血液中的药物浓度变化 ,以进行临床药
动学研究 ,为临床合理用药提供实验依据。
1 　材料与方法
111 　药品与试剂 : PEG2rh G2CSF 质控样品 ,无色透
明液体 ,每支 015 mL ,150μg/ mL , H PL C 测质量分
数为 9918 % ,批号 20030201 ,由山东格兰百克生物
制药有限公司提供。样品试验前于 4 ℃保存。检
测 PEG2rh G2CSF 的 EL ISA 试剂盒 ,购自美国 Bio2
source 公司。
112 　仪器 : Model 550 型酶标微板读数仪 (美国
Bio2Red 公司) ; Columbus 洗板机 (奥地利 Tecan
公司) 。
113 　受试患者 : 16 例住院癌症患者 (中国医学科
学院肿瘤医院) ,男女各 8 例 ,经组织病理学或细胞
学确诊为非小细胞肺癌或乳腺癌 (其中 14 例非小
细胞肺癌 ,2 例乳腺癌) ,年龄 35～65 岁 (中位年龄
50 岁) ,用药前的基础中性粒细胞 2111 ×109 ～
10142 ×109 / L (中位值 5184 ×109 / L ) 。既往未接
受过化疗或放疗 , KPS 功能状态评分标准 ( Karnof2
sky , KPS) ≥60 分 ,预计生存期 3 个月以上 ,骨髓无
肿瘤转移 ,造血功能和外周血常规正常 ,无出血倾
向 ,无明显心、肝、肾功能异常 ,自愿受试 ,签署知情
同意书。
114 　给药及采血方法 :患者化疗结束后 48 h 单次
sc 给予 PEG2rh G2CSF ,剂量分别为 30、60、100、200
μg/ kg ,每组 4 例病人。于给药前和给药后不同时
间从前肢肘窝静脉取血 ,每次 5 mL 。取血时间点为
0 d (药前) 、0125、015、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、
14、16、18 d (药后) 。血液在室温放置 30 min 后 ,
4 000 r/ min 离心 15 min ,分离出血清 , - 20 ℃保存
待测 (血清样品由中国医学科学院肿瘤医院提供) 。
115 　EL ISA 法测定血药浓度 :在预包被第一抗体
的 96 微孔板上 ,孔内加入样品 (标准品或待测样
品)和生物素化第二抗体各 50 μL (标准品 100
μL) ,轻轻混匀 20 s 后于 37 ℃保温 2 h。除去孔内
液体 ,洗板 4 次 ,每次 3 min ,除净孔内残液后每孔
加 100μL 链亲和素2辣根过氧化物酶 ,室温放置
015 h。洗去并除净孔内残液后 ,每孔加 100μL 底
物液 TMB (3 , 3′, 5 , 5′2四甲基联苯胺) ,室温反应
015 h 后加 100μL 硫酸终止反应。在酶标仪 450
nm 处读取各孔的吸光度 ( A) 值。
116 　数据处理及药动学参数计算 :血药浓度2时间
数据用 3P97 药动程序拟合分析并计算药动学参
数 ;采用梯形法计算 AUC 值 , tmax 和 Cmax 采用实测
值 ;实验数据均以 x ±s 表示。
2 　结果
211 　方法学研究 :分别用药盒中提供的 rh G2CSF
标准品和本实验中 PEG2rh G2CSF 的质控样品制备
标准曲线。rh G2CSF 的终质量浓度为 0、39、78、
156、312、625、1 250、2 500 pg/ mL , PEG2rh G2CSF
的终质量浓度为 0、78、156、312、625、1 250、2 500、
5 000 pg/ mL 。在上述质量浓度范围内 ,药物质量
浓度对数与吸光度值对数呈直线相关 ,回归方程分
别为 lgA = - 2. 636 + 0. 902 ×lg C , r = 01998 7
(rh G2CSF) 和 lgA = - 21850 + 01869 ×lg C , r =
01997 9 ( PEG2rh G2CSF) ,经平行性测验表明 ,两条
标准曲线平行相关 ( P > 0105) 。本试验最低定量限
为标准曲线的最低质量浓度点 ,即 78 pg/ mL 。在
100～4 000 pg/ mL 质量浓度 ,测定血清中 PEG2
rh G2CSF 的板内 RSD 为 616 %～916 % ,平均准确
度 96 %～105 % ;板间 RSD 为 61 3 %～1012 % ,平
均准确度为 99 %～100 %。结果见表 1。另外 ,该药
盒为 IL22、IL23、GM2CSF、IFN2γ、TN F2α等多种细
胞因子均无明显的交叉反应。以上各项条件均能满
足药动学的实验要求[11 ] 。
212 　血清中 PEG2rh G2CSF 的定量测定 :按照测定
方法项下规定的方法测定 ,每次测定均制备 1 条标
准曲线以计算血清中药物的量。癌症患者化疗后
48 h 分别单次 sc 给予 PEG2rh G2CSF 30、60、100、
200μg/ kg 后的平均血药浓度2时间曲线见图 1。
213 　药动学参数的计算和分析 :血药浓度试验数据
用 3P97 药代计算程序进行处理。经拟合优度分析 ,
药物消除符合一房室模型 ,具体药动学参数见表 2。
·8621· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
表 1 　ELISA 法测定 PEG2rhG2CSF 的精密度和准确度
( x ±s , n = 5)
Table 1 　Precision and accuracy of PEG2rhG2CSF
by ELISA method ( x ±s , n = 5)
加入质量
浓度/ (pg ·
mL - 1 )
孔内
测得质量浓度/
(pg ·mL - 1 )
RSD/
%
准确度/
%
孔间
测得质量浓度/
(pg ·mL - 1 )
RSD/
%
准确度/
%
100 10416 ± 1010 916 105 　9912 ±1011 1012 99
500 47815 ± 4210 818 96 49518 ± 4112 813 99
2 000 2 06513 ±13519 616 103 1 99316 ±15318 717 100
4 000 3 89816 ±28914 714 97 3 90619 ±24418 613 98
x ±s - 811 ±114 100 ±4 - 811 ±116 99 ±1
图 1 　癌症患者 sc 不同剂量 PEG2rhG2CSF 后的
平均血药浓度2时间曲线 ( x ±s , n = 4)
Fig. 1 　Serum concentration2time curves of single
sc injection of PEG2rhG2CSF to cancer
patients at various doses ( x ±s , n = 4)
表 2 　癌症患者 sc 不同剂量 PEG2rhG2CSF 后的
药动学参数 ( x ±s , n = 4)
Table 2 　Pharmacokinetic parameters of single sc injection
of PEG2rhG2CSF to cancer patients at various
doses ( x ±s , n = 4)
参　数 单　位
不同剂量 PEG2rhG2CSF/ (μg·kg - 1 )
30 60 100 200
A ng·mL - 1 12319 ±4715 21011 ±6814 61011 ±26515 1 27912 ±20518
t1/ 2ke h 4718 ±713 4918 ±619 4517 ±916 4416 ±613
tmax h 2110 ±610 2410 ±010 2110 ±610 4210 ±1210
Cmax ng·mL - 1 5410 ±1018 12910 ±2019 34419 ±7314 82819 ±24516
AUC ng·h ·mL - 1 5 714 ±786 12 781 ±1 745 32 714 ±6 486 85 142 ±26 186
CL mL ·h - 1 ·kg - 1 5144 ±0186 5106 ±0169 3136 ±0135 3131 ±1120
3 　讨论
311 　关于 EL ISA 药盒 :本实验所用 EL ISA 药盒
中的两株抗体是针对天然和重组人粒细胞集落刺激
因子 ( G2CSF) 的单克隆抗体组成 ,用药盒提供的标
准品 rh G2CSF 作标准曲线能很好地重复出药盒说
明书上的数据 ,标准品浓度的对数与吸光度值对数
呈直线相关 ;但用该药盒测定本研究提供的 PEG2
rh G2CSF ,相同质量浓度下所测定的 A 值均偏低 ,
这可能与 PEG 大分子影响了抗 rh G2CSF 抗体的亲
和力有关 ,造成对 PEG2rh G2CSF 结合灵敏度的降
低 ;但基于两条标准曲线平行相关 ,说明该药盒没有
改变测定 rh G2CSF 的本质 ,可以用于测定样品中的
PEG2rh G2CSF。每次试验均用 PEG2rh G2CSF 质控
样品制备标准曲线 ,从而确保了血药浓度测定的准
确性。另外 ,本方法的精密度和准确度 ,最低定量限
以及特异性均能符合新药药动学的试验要求。
312 　PEG2rh G2CSF 临床药动学的特点 :病人 sc 给
予 PEG2rh G2CSF 后 ,4 个剂量组的消除相半衰期
( t1/ 2ke ) 差异不大 , 组间平均半衰期为 4710 h
(4416～4918 h) ; Cmax和 AUC 随给药剂量的增大而
增大 , CL 随剂量增大有降低的趋势 , tmax在 30～100
μg/ kg 剂量范围内基本一致 ,而高剂量组 200μg/
kg 则明显延长。病人化疗后 48 h 单次 sc 给予
PEG2rh G2CSF 100μg/ kg 后血药浓度变化与中性
粒细胞提升的关系如图 2 所示 ,化疗后病人先经历
3 d 由于化疗而自身动员中性粒细胞的升高期后 ,
从化疗后第 3 天 (给药次日) 起开始下降 ,到化疗后
第 6 天 (药后 4 d) 降到低谷 (3100 ×109 / L ) ,该期
间血液中 PEG2rh G2CSF 一直维持在较高的质量浓
度 ;药后 5～7 d 中性粒细胞开始持续上升 ,在第 7
天达峰值 11159 ×109 / L ;此时 PEG2rh G2CSF 的血
药浓度开始很快下降 ,提示 PEG2rh G2CSF 在血液
中的清除受中性粒细胞的介导 ,这与非 PEG 化的
rh G2CSF 主要是通过肾小球滤过被清除的机制不
尽相同 ,该结果与文献报道基本一致[12 ] 。
图 2 　癌症患者 sc PEG2rhG2CSF ( 100μg/ kg) 后的
血药浓度与中性粒细胞变化关系
Fig. 2 　Relationship between mean serum level and ANCs
by sc injection of PEG2rhG2CSF ( 100μg/ kg)
to cancer patients
313 　与非 PEG化 rh G2CSF 比较 :津恤力是山东格
兰百克生物制药有限公司上市的非 PEG 化的 rh G2
CSF 产品 ,其血液消除半衰期为 315 h ,血液清除率
为 30 mL/ ( h ·kg) ,临床上用 5μg/ kg 的剂量 ,需
要每天注射 1 次[ 13 ] ; PEG 化后的本品在血液中的清
除半衰期明显延长 (平均半衰期为 4710 h) ,清除率
·9621·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
明显减慢 [平均清除率为 4129 mL/ ( h ·kg) ]。根
据文献报道[14 ] ,当 PEG2rh G2CSF 剂量为 100μg/
kg 时 ,一周只需要 sc 1 次 ,就可以达到持续升高中
性粒细胞的临床效果 ;与每天注射 5μg/ kg 的 rh G2
CSF ,连续注射 1 周的效果相同。本实验结果也证
明了这一长效作用。
314 　与国外同类产品 Pegfilgrastim 比较 : Pegfil2
grastim ( PEG 化重组人粒细胞集落刺激因子) 是
美国 Amgen 公司的同类产品。据文献报道[15 ,16 ] ,3
例临床非小细胞肺癌病人化疗后 24 h 按 100μg/
kg 剂量单次 sc Pegfilgrastim 后的平均半衰期为
3312 h (30. 3～53. 8 h) ,平均清除率为 1410 mL/
(h ·kg) [412～1518 mL/ (h ·kg) ] ;而本实验 4 例
病人化疗后 48 h 单次 sc 同剂量 ( 100 μg/ kg)
PEG2rh G2CSF ,平均半衰期为 4517 h (34. 7～58. 2
h) ,平均清除率为 3136 mL/ ( h ·kg) [ 2196～3167
mL/ (h ·kg) ]。两者比较 ,本实验结果的半衰期更
长 ,清除率更低 ,这可能是个体差异或药物本身差异
所致 ,其所显示的更强的长效和临床意义有待进一
步研究。
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红花注射液对肝星状细胞 HSC2T6 增殖、凋亡
及凋亡相关基因表达的影响
刘 　珺 ,徐选福 ,杨文娟 ,郭传勇 3
(同济大学附属第十人民医院 消化科 ,上海 　200072)
摘 　要 :目的 　研究红花注射液对肝星状细胞 ( hepatic steuate cell , HSC) HSC2T6 增殖、凋亡及凋亡相关基因
bcl22 及 bax mRNA 表达的影响。方法 　体外培养 HSC 株 ,用不同质量浓度的红花注射液处理 HSC2T6 ,采用
·0721· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 8 期 2009 年 8 月
3 收稿日期 :2008210216　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家重点基础研究发展计划“973 计划”资助项目 (2006CB504810) ;上海市自然科学基金资助项目 (06ER14090)
作者简介 :刘　珺 (1982 —) ,女 ,山西省洪洞县人 ,博士 ,讲师 ,研究方向为中西医结合消化系统疾病诊治。
Tel : 13816951240 　E2mail : liujun19820124 @yahoo. com. cn3 通讯作者　郭传勇　E2mail : guochuanyong @sina. com