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藤黄酸对 K562 细胞 hERG 钾通道蛋白的调控作用
崔国惠,舒文秀,吴 青,陈 燕*
( 11 华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所, 湖北 武汉 430022)
摘 要:目的 探讨藤黄酸对白血病细胞系 K562 增殖、凋亡、细胞周期的影响, 并观察藤黄酸对 hERG 钾通道蛋
白的调控作用。方法 K562 细胞以不同浓度藤黄酸 ( 01 125~ 81 0 Lmol/ L) 处理 0~ 72 h 后, MTT 法观察藤黄酸
对 K562 细胞生长抑制的情况, Annexin2V/ PI 双标法及透射电镜检测细胞凋亡, PI 单染法检测细胞周期分布,
Western blott ing、RT2PCR 法分别检测藤黄酸对 K562 细胞内 hERG 通道的调控作用。结果 藤黄酸能明显抑制
K562 细胞增殖,具有时间2剂量依赖性, 其 24 h 的 IC50为 ( 21 637 ? 01 208) Lmol/ L。此外, 藤黄酸以浓度依赖性方
式诱导 K562 细胞凋亡,并伴随明显的凋亡细胞形态学改变,而藤黄酸的凋亡诱导效应可能与其诱导 K562 细胞周
期阻滞于 G0 / G1期有关。hERG 钾通道蛋白在人白血病 K562 细胞中表达量较高, 藤黄酸对 hERG 钾通道蛋白及
其表达水平均有不同程度的抑制作用, 该抑制作用呈明显的量效关系 ( P < 01 01)。结论 藤黄酸可通过下调
hERG 钾通道蛋白的表达发挥较强的抗白血病效应, hERG 钾通道有望成为白血病诊治的新靶标。
关键词:藤黄酸; hERG; 白血病; K562 细胞; 凋亡
中图分类号: R2861 91 文献标识码: A 文章编号: 025322670(2009) 0620915205
Regulation of gambogic acid on hERG potassium channel protein of K562 leukemia cells
CUI Guo2hui, SHU Wen2xiu, WU Qing, CHEN Yan
( 11 Institute of H ematology, Union H ospital, Tongji Medical College of Huazhong Univer sity
of Science and Technology, Wuhan 430022, China)
Abstr act: Objective To explore the effects of gambogic acid (GA) on proliferat ion, apoptosis, and
cell cycle dist ribut ion of leukemia cel ls K562, as well as to observe its regulation on the expression of hu2
man ether2„2go2go r elated genes ( hERG) protein. Methods K562 Cel ls were t reated with various concen2
t rat ion of GA (0. 125 ) 8. 0 Lmol/ L) for 0 ) 72 h. MTT Assay was used to evalute the inhibition of GA on
the growth of K562 cells. Cell apoptosis was detected through both Annexin2V/ PI double2labeled cytome2
t ry and tr ansmission electron micr oscopy (TEC) . Cell cycle regulation was studied by a propidium iodide
method. Western blott ing and RT2PCR technologies wer e applied to assess the regulat ion on the expres2
sion level of hERG in K562 cells. Resul ts GA presented st riking growth inhibit ion on the proliferat ion of
K562 cells in vi tr o in a t ime2 and dose2dependent manner. T he IC50 value of GA for 24 h was ( 2. 637 ?
0. 208) Lmol/ L. Moreover, GA induced K562 cells apoptosis in a dose2dependent manner and companied
with the obvious mor phological changes of apoptosis. Meanwhile, the apoptosis induct ion potency of GA
on K562 cells might correlate well with it s effect on the G0 / G1 cell cycle arrest . Over expr ession of hERG
potassium channel protein was found in K562 cel ls, while GA could downregulate it at both pr otein and
mRNA level in a dose2dependent manner ( P < 01 01) . Conclusion GA could exhibit it s ant i2leukemia
effects part ially through the downregulat ion of the pr otein expression level of hERG potassium channel in
K562 cells, which suggests that hERG potassium channel might be a new tar get for future therapy of leu2
kemia.
Key words: gambogic acid ( GA) ; human ether2„2go2go r elated genes ( hERG) ; leukemia; K562 cell
apoptosis
离子通道广泛存在于所有细胞中, 参与细胞多
种生理功能,肿瘤的发生也与离子通道功能失调相
关。近年来,研究者将钾通道蛋白的表达和已知的
癌基因活性联系起来, 认为某些钾通道蛋白与肿瘤
#915#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
* 收稿日期: 2008211213 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30472267)作者简介:崔国惠( 1963 ) ) ,女,湖北宜昌市人,副教授,博士,主要从事恶性血液病研究。
T el : ( 027) 85726387 E2mail: ghcu i@medmail. com . cn
* 通讯作者 陈 燕 T el: ( 027) 85726387 E2mail: yanchen@public. wh . hb. cn
的发生发展密切相关[ 1, 2]。由 hERG (human ether2
„2go2go related genes) 基因编码的 hERG 钾通道
蛋白作为一种特殊类型的电压门控性离子通道, 在
哺乳动物细胞中,表现出很强的内向整流活性,故而
在维持心脏正常节律性和神经元的分化及生理功能
方面发挥重要作用[ 3]。然而, 大量研究表明, hERG
蛋白选择性表达于多种组织来源的肿瘤细胞, 而在
相应来源的正常细胞中不表达。除此以外, hERG
蛋白对肿瘤的生物学行为产生广泛的影响, 与肿瘤
细胞增殖、凋亡、分化及侵袭密切相关[ 4~ 6]。据报
道, hERG 蛋白可影响肿瘤细胞的膜电位,使其处于
去极化状态,从而有利于肿瘤细胞的存活、增殖和侵
袭[ 6]。因此, hERG 钾通道将成为一个很有前景的
肿瘤治疗靶点, 在筛选特异性分子靶向药物过程中
发挥重要作用。藤黄酸 ( gambogic acid, GA) 是藤
黄的主要活性成分。藤黄酸很早即被发现具有抗
炎、抗肿瘤等多种药理作用,对肝癌、结肠癌、肺癌、
白血病、食管癌、脑部肿瘤和膀胱癌等许多肿瘤细胞
的生长、增殖都有抑制作用[ 7, 8]。但有关其抗肿瘤
机制报道较少, 其对 hERG 钾通道蛋白的调控作用
尚未见报道。本实验以 hERG 钾通道作为分子靶
点,探讨不同浓度藤黄酸对其调控作用及与藤黄酸
抗白血病效应的相关性。
1 材料与方法
11 1 药物与试剂:藤黄酸, 质量分数大于 95% , 购
自美国 Calbiochem 公司, 溶于二甲基亚砜 ( DM2
SO) , - 20 e 保存,临用前用 RPMI 1640 培养液稀
释到终浓度。RMPI 1640 培养基、胎牛血清均源于
美国 Gibco BRL 公司。Annexin2V/ PI 凋亡试剂盒
购自深圳晶美生物工程有限公司。兔抗人 hERG1
单克隆抗体购自 Sigma 公司, HRP 标记羊抗兔二
抗购自美国 Santa Cruz 公司产品, Bio2Rad 蛋白定
量试剂盒、T rizol 试剂盒、ECL 发光试剂盒均源于
瑞典 Amersham 公司。RT2PCR 试剂盒购自 Fer2
mentas公司, 引物由上海 Sangon 公司合成。
11 2 细胞系及细胞培养:人髓系白血病细胞 K562
为同济医学院免疫教研室惠赠。在含有 10% 灭活
胎牛血清、青霉素 100 U/ mL、链霉素 100 Lg/ mL
的 RPMI 1640培养液, 37 e 、5% CO2、水饱和湿度
条件下培养。每 1~ 2 d 换液传代 1次,取细胞活性
大于 98% 的对数生长期细胞进行实验。
11 3 MTT 法检测藤黄酸对 K562 细胞增殖的影
响:取对数生长期的 K562 细胞,以每孔 180 LL, 浓
度为 2@105 / mL 接种于 96 孔板中,加入 20 LL 不
同浓度的藤黄酸 ( 01 125~ 81 0 Lmol/ L) , 以含等体
积 DMSO 的培养液作为空白对照,每个药物浓度组
设 3 个复孔, 每孔总体积 200 LL。置 5% CO2、
37 e 培养箱培养 24~ 72 h 后,每孔加入 5 mg/ mL
的 MTT 20 LL, 37 e 继续孵育 4 h,小心吸去培养
上清液, 每孔加入 150 LL 的 DMSO 溶液, 振荡
10 min,使结晶充分溶解后于 Bio2Rad M450 酶标
仪测定 492 nm 波长处的各孔吸光度 ( A) 值,实验
重复 3次,计算细胞增殖抑制率。
增殖抑制率= ( 1- 实验组 A/对照组 A 值) @100%
11 4 Annexin2V/ PI 双染检测细胞凋亡:按试剂盒
说明书进行操作,分为实验组和单标对照组。收集
不同浓度藤黄酸处理后的 K562 细胞及空白对照组
细胞,用 4 e 预冷的 PBS 洗涤 2 次, 然后以 1 @
106 / mL的细胞密度重悬于 100 LL 的 1@结合缓冲
液中,加入 5 LL Annexin2V 和 10 LL PI 染液, 轻轻
混匀,避光室温反应 15 min, 再加入 300 LL 上述缓
冲液,于 1 h 内流式细胞仪检测。
11 5 透射电镜观察:收集药物处理 24 h 的细胞于
11 5 mL 的 EP 管中,离心, 去上清, 加入 4 e 预冷
的 2% 戊二醛固定 2 h, 用 PBS 洗涤 3遍, 洗毕用
1% 锇酸固定 1~ 2 h,用乙醇梯度脱水, 100% 丙酮
浸透,环氧树脂包埋,制片、染色,置透射电子显微镜
(H27500, H itachi, 日本) 下观察。
11 6 流式细胞术检测细胞周期:收集各处理组的
K562细胞 1@106个, 以 PBS 缓冲液清洗 2 次, 用
70% 冷乙醇 4 e 固定过夜,离心,用 PBS 洗 1 次,
加入 20 LL 的 RNase A 于 37 e 水浴 30 min, 再加
入 300~ 500 LL 的 PI 染液混匀, 至 4 e 避光 30
min,用流式细胞仪进行检测,记录激发波长 488 nm
处的红色荧光。
11 7 半定量 RT2PCR 法检测藤黄酸对 K562 细胞
hERG 基因表达的影响:应用 T rizol试剂盒提取细
胞总 RNA, 按说明书合成 cDNA。以细胞 cDNA
的第一链为模板, 进行 PCR 反应。PCR 反应引物
由上海 Sangon 公司合成, 其中, hERG 基因上游引
物 5c2CAGCGGCTGTSCTGGGCACAG23c, 下游引
物 5c2CAGAAGTGGTCGGAGAACTC23c, 扩增片
段为 345 bp; 32磷酸甘油醛脱氢酶基因 ( GAPDH)
上游引物 5c2GATTTGGTCGTATTGGGGCGC2
3c, 下 游 引 物 5c2CAGAGATGACCCTTTTG2
GCTCC23c,扩增片段为 623 bp。PCR 扩增条件为
95 e 预变性 5 min, 94 e 、1 min, 55 e 、50 s,
72 e 、1 min, 循环 35 次, 72 e 、10 min 结束反应。
#916# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
PCR 产物经 11 5% 琼脂糖凝胶电泳,紫外照相并进
行扫描分析, 以 hERG/ GAPDH 进行 hERG 基因
表达水平的半定量分析。
11 8 Western 印迹方法检测:收集不同浓度藤黄酸
处理的 K562 细胞以及空白对照组细胞, 加入 100
LL 预冷的细胞裂解液 (按分子克隆方法配置) 冰
上裂解 30 min, 提取细胞总蛋白,以 Lowry 法进行
蛋白定量。常规制胶、上样,进行蛋白质电泳, 然后
转膜。加入兔抗人 hERG1 单抗 ( 1 B 1 500) , 4 e
孵育过夜。漂洗过后再加入 HRP2标记的羊抗兔
IgG ( 1 B 2 000) , 于 37 e 摇床温育 1 h。最后用
ECL 化学发光试剂显色, 进行 X 线片曝光显影, 计
算机软件处理分析。每个浓度组重复 3 次, 取均值
代表测定结果。
119 统计学分析:实验数据以 x ? s表示,组间比较
采用单因素方差分析,统计学软件 SPSS 1115 分析。
2 结果
21 1 藤黄酸对 K562 细胞增殖的影响:由图 1 可
见, 分别以 01 125、01 25、01 5、11 0、21 0、41 0、81 0
Lmol/ L 的藤黄酸作用 K562 细胞 24~ 72 h 后, 各
药物组的细胞增殖活性均低于空白对照组细胞, 但
在浓度低于 01 5 Lmol/ L时,藤黄酸对 K562 细胞的
增殖活性影响很小, 而当藤黄酸浓度达到 11 0
Lmol/ L 时,其增殖抑制活性明显增强,具有统计学
差异 (P < 01 05)。并且, 随着藤黄酸药物浓度的增
加和作用时间的延长,这种增殖抑制作用明显增强,
呈现明显的时效和量效关系。其 24 h 的 IC50值是
( 21 637 ? 01 208) Lmol/ L。
21 2 藤黄酸对 K562细胞凋亡的影响:从透射电镜
结果可以看出, 21 0 Lmol/ L 藤黄酸处理 24 h 的
K562 细胞中见较多典型的凋亡形态学改变: 细胞
膜表面微绒毛消失, 细胞膜表面出泡,细胞质密度增
加,染色体凝集、边缘化, 核凝集以及凋亡小体形成
等( 图2)。随后, 采用Annexin2V / PI双标法定量
检测藤黄酸对 K562 细胞凋亡的影响,结果表明,随
着藤黄酸作用浓度的增加, K562 细胞发生凋亡的细
胞比例逐渐增加 (表1)。015 Lmol/ L 藤黄酸作用 24
h 后,其总凋亡率为 ( 9183 ? 0132)% ,当藤黄酸浓度
为 21 0 Lmol/ L时,其总凋亡率达 ( 191 65 ? 11 56)%。
21 3 藤黄酸对 K562 细胞周期及凋亡率的影响:不
同浓度藤黄酸与 K562 细胞作用 24 h 后,细胞周期
分布也随着发生改变, 见图 3。随着藤黄酸浓度的
增加, G0 / G1期细胞比例逐渐增加,而 S期细胞比例
呈剂量依赖性减少,相对而言, 藤黄酸对 G2 / M 期
细胞作用并不明显 (表 1)。表明藤黄酸主要诱导
K562细胞周期阻滞于 G0 / G1期。
图 3 藤黄酸对 K562 细胞周期分布的影响
Fig. 3 Effects of GA on K562 cells cycle distr ibution
#917#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
表 1 藤黄酸对 K562 细胞周期分布和凋亡的影响
( x? s, n= 3)
Table 1 Effects of GA on K562 cells cycle distribution
and apoptosis (x ? s, n= 3)
藤黄酸/
(Lmol # L- 1 )
细胞周期/ %
G0 / G1 S G2/ M
凋亡率/
%
0(对照) 391 95? 11 88 491 45? 11 67 101 60? 11 33 31 19 ? 01 63
01 5 401 48? 21 34 461 19? 11 86 131 33? 11 84 91 83 ? 01 32
11 0 511 40? 11 96* * 371 67? 21 03* * 101 93? 01 98 141 05 ? 11 08* *
20 681 58? 21 89* * 231 29? 11 52* * 81 13? 11 02 191 65 ? 11 56* *
与对照组比较: * * P < 01 01
* * P< 01 01 vs cont rol gr ou p
21 4 藤黄酸对 K562细胞 hERG 钾通道蛋白的调
控作用: 和骨髓正常单个核细胞 ( bone marrow
mononuclear cells, BMMNC) 相比, K562 细胞中
存在较高表达水平的 hERG 钾通道蛋白,经 01 5~
21 0 Lmol/ L 的藤黄酸处理 24 h 后,其蛋白表达水
平呈浓度依赖性地下降, 差异显著 (P < 01 01)。为
了进一步明确藤黄酸对 hERG 蛋白的调控作用, 在
基因转录水平检测了 hERG 蛋白 mRNA 量的变
化。同样, hERG 钾通道蛋白的 mRNA 水平亦呈
剂量依赖性地下调,并明显高于正常对照的单个核
细胞内 hERG 的基因表达水平 (图 4和 5)。半定
量结果见表 2。
3 讨论
本研究结果表明,藤黄酸能明显抑制 K562 细
表 2 藤黄酸对 K562 细胞 hERG 钾通道蛋白和 mRNA
表达的调控作用 ( x ? s, n= 3)
Table 2 Regula tion of GA on protein and mRNA
expression of hERG potassium channel
in K562 cells ( x ? s, n= 3)
组别 剂量/ (Lmol # L- 1 ) 蛋白表达 ( hERG/GAPDH )基因表达 ( hERG/ GAPDH)
BMMNC(正常对照) - 01 19 ? 0102 01 13? 01 14
藤黄酸(空白对照) 0 01 89 ? 0109 01 92? 01 06
01 5 01 85 ? 0108 01 87? 01 04
11 0 01 59 ? 0106* * 01 67? 01 04* *
21 0 01 35 ? 0104* * 01 21? 01 03* *
与空白对照组比较: * * P< 01 01
* * P < 01 01 vs blank cont rol group
胞的增殖,该抑制作用与药物作用时间和药物作用
浓度呈正相关。同时, 藤黄酸对 K562 细胞具有较
强的诱导凋亡作用,经 01 5~ 21 0 Lmol/ L 藤黄酸处
理 24 h 后, K562 细胞凋亡率明显增加,并出现典型
的凋亡细胞形态学改变。而藤黄酸的凋亡诱导效应
可能与其诱导的周期阻滞作用密切相关。随着藤黄
酸作用浓度的增加, G0 / G1期细胞比例逐渐增加,相
应的 S期细胞比例逐渐减少,而藤黄酸对 G2 / M 期
细胞比例影响甚微。推测藤黄酸主要通过阻滞
K562细胞于 G0 / G1期发挥凋亡诱导效应, 这和前
期的报道一致[ 7, 8]。在人胃腺癌 SGC27901 细胞中,
藤黄酸同样能以周期依赖性方式诱导细胞凋亡, 但
主要是诱导 SGC27901 细胞周期阻滞于 G2 / M
期[ 9 ] ;而在人乳腺癌 T47D 细胞中,藤黄酸则以一种
周期非依赖方式诱导细胞发生凋亡[ 10]。可见,对于
不同的肿瘤细胞系,藤黄酸的抗肿瘤机制不尽相同。
离子通道蛋白在正常细胞和肿瘤细胞间的差异
表达逐渐成为肿瘤学界研究的热点。而在众多研究
的离子通道蛋白中,由 hERG 基因编码的 hERG 钾
通道蛋白选择性地表达于多种组织来源的肿瘤细胞
系及原代肿瘤细胞中, 并与肿瘤细胞的增殖、分化、
凋亡、侵袭以及化疗敏感性密切相关,被认为是肿瘤
细胞比较特异的分子靶点。一般情况下, hERG 基
因只在胚胎发育的早期阶段表达, 随后便被内向整
流钾通道电流所取代[ 11]。hERG 钾通道是典型的
电压门控性离子通道, 在哺乳动物中, hERG 由于电
压依赖性的快速灭活而表现出很强的内向整流活
性,因而在维持心脏正常节律性和神经元的分化及
生理功能方面发挥重要作用[ 3, 12]。此外, hERG 钾
通道与多种心律失常密切相关, 并可能是引起先天
性长 QT 综合征 ( LQTS) 的主要致病因素之
一[ 1 3]。如前所述, hERG 钾通道蛋白在维持细胞静
息膜电位于去极化状态至关重要,而最新研究表明,
#918# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
肿瘤细胞无限制的增殖特性与细胞膜去极化状态密
切相关,提示 hERG 钾通道蛋白与肿瘤细胞增殖活
性有关。而陆续的研究也证实, hERG 蛋白在子宫
内膜癌、结肠癌、神经母细胞瘤等多种组织来源的肿
瘤细胞系及其原代细胞中均高表达,而在相应来源
的正常组织或细胞中不表达或低表达[ 5, 6]。除此以
外,在多种恶性血液肿瘤细胞,包括白血病细胞中也
存在 hERG 钾通道蛋白的高表达[ 4, 14]。应用特异
性的 hERG 钾通道蛋白阻断剂可以抑制相应肿瘤
细胞的增殖和转移,并增加肿瘤细胞对化疗药物的
敏感性[ 15, 16]。目前认为, hERG 钾通道蛋白可通过
与肿瘤坏死因子、整合素受体、VEGF 等蛋白相互
作用, 发挥癌蛋白活性[ 17~ 20]。不难看出, hERG 钾
通道是一个很有前景的肿瘤治疗靶点。故而, 本实
验以 hERG 基因作为靶点, 观察藤黄酸对 K562 细
胞 hERG 钾通道蛋白的调控作用。结果表明, 和正
常对照的骨髓单个核细胞相比, K562 细胞内存在
较高表达水平的 hERG 钾通道蛋白,而正常单个核
细胞几乎不表达。经藤黄酸干预后,其蛋白和基因
表达水平均呈浓度依赖性地下调。说明藤黄酸对
K562 细胞的增殖抑制作用与细胞内 hERG 钾通道
的表达密切相关。也进一步证实, 在肿瘤细胞中, 抑
制 hERG 钾通道蛋白表达可以抑制肿瘤细胞增殖,
诱导肿瘤细胞凋亡。而藤黄酸有望成为新一代的
hERG 钾通道蛋白抑制剂。
hERG 钾通道蛋白对肿瘤生物学行为的影响表
明可以通过抑制其表达或通道电流 IhERG来抑制肿
瘤细胞的生长, 促进肿瘤细胞分化或凋亡,降低其侵
袭性。为抗肿瘤靶向治疗和药物筛选奠定了良好的
基础。
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#919#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月