全 文 ：木兰花碱对 HERG钾通道蛋白表达的
影响
沈国平，龙启福
(青海大学医学院生物化学教研室，西宁 810001)
摘要:目的 探讨木兰花碱抗心律失常的作用及机制。方法 将低浓度(1、3 μmol /L)及高浓度(10、30 μmol /
L)木兰花碱分别作用于转染 HERG基因重组载体的 HEK-293 细胞，采用Western blot法、免疫荧光化学染色法分别
定量、定性检测 HEK-293 细胞中 HERG钾通道蛋白(以下简称 HERG蛋白)表达。结果 低浓度木兰花碱对 HERG
蛋白表达无明显影响;高浓度木兰花碱作用后 HERG蛋白表达明显受抑。结论 高浓度木兰花碱能够抑制 HERG
蛋白表达，此可能为木兰花碱抗心律失常的作用机制。
关键词:木兰花碱;HERG钾通道;心律失常
中图分类号:R282． 71;R541． 7 文献标志码:B 文章编号:1002-266X(2011)31-0036-02
心律失常为人类猝死的主要原因，其发生、发展
与心肌细胞膜上的离子电流改变密切相关，心肌细
胞膜上的离子通道为心律失常发生的重要靶点和抗
心律失常药物的作用靶点［1］。HERG(human ether a
go-go related gene)编码心肌快速激活的延迟整流钾
通道 (IKr)的 α 亚基，在心肌细胞的复极化过程中
发挥重要作用，既是抗心律失常药物作用的重要靶
点，也是产生致死性心律失常的分子靶点［2］。木兰
花碱(又名木兰碱，别名唐松草碱)是毛茛科植物粗
果唐松草的根街植物中主要的活性物质，具有抗炎、
降压、抑制肿瘤细胞生长及抗心律失常等作用［3，4］，
但其对 HERG钾通道蛋白(以下简称 HERG 蛋白)
表达的影响鲜见报道。2010 年 12 月 ～ 2011 年 6
月，我们观察了不同浓度木兰花碱对 HERG 蛋白表
达的影响，旨在探讨木兰花碱抗心律失常的作用机
制。
1 材料与方法
1． 1 材料 细胞:HEK-293 细胞株(中国协和医科
大学) ，稳定转染 HERG 基因重组载体的 HEK-293
细胞(中国科学院上海生命科学研究所)。药品与
试剂:胎牛血清(上海华壹生物科技有限公司) ;
DMEM培养基(上海沪峰生物科技有限公司，含
10% 胎牛血清和 400 μmol /L G418) ;抗 HERG的多
克隆兔抗体(1 ∶ 200，北京博奥森生物技术有限公
司) ;木兰花碱标准品(中国药品生物制品检定所，
实验前用 PBS 溶解，过 0． 22 μm 微孔滤膜，无血清
培养基稀释，使终浓度分别为 1、3、10、30 μmol /L;
1、3 μmol /L为低浓度，10、30 μmol /L为高浓度。
1． 2 细胞培养及 HERG 蛋白测定 将 HERG-
HEK-293 细胞培养于 DMEM培养基中，HEK-293 细
胞培养于上述不含 G418 的培养液中，于 37 ℃、5%
CO2 饱和湿度孵育培养箱培养，消化传代，取对数生
长期细胞采用 Western blot 蛋白印迹法测定 HERG
蛋白表达。结果证实 HEK-293 细胞中没有 HERG
蛋白表达;而 HERG-HEK-293 细胞中存在 HERG 蛋
白表达，共发现两条带，一条带的相对分子质量约为
155 kD，另一条带的相对分子质量在 135 kD 附近，
见图 1A 。
1． 3 细胞干预及 HERG 蛋白测定 ①蛋白印迹
法:将对数生长期 HERG-HEK细胞分别以空白培养
基和含木兰花碱 1、3、10、30 μmol /L 的培养基中孵
育 24 h，PBS收集细胞并提取总蛋白，用 Bradford 法
行蛋白定量。测定 HERG 蛋白表达:取等量样品，
加入等体积上样缓冲液，煮样、电泳、转膜、封闭［5］，
加入一抗(1∶ 2 00) ，室温孵育 2 h，用 PBS-T 缓冲液
洗膜 3 次，每次 10 min，用红外荧光标记的羊抗兔二
抗(1∶ 4 000)避光孵育 1 h，用 PBS-T 缓冲液洗膜 3
次，每次 15 min，再用 PBS缓冲液洗膜 10 min。用图
像分析软件 Scion Image 计算光密度积分值。②免
疫荧光法:将对数生长期 HERG-HEK 细胞稀释至
铺有盖玻片的 6 孔板中培养。待细胞爬片贴壁后，
分别以空白培养基和木兰花碱 1、3、10、30 μmol /L
的无血清培养基孵育 24 h。依次进行固定、穿透、封
闭［5］，一抗(1 ∶ 200)4 ℃孵育过夜，用 PBS 冲洗 3
次，每次 5 min，加入荧光标记的羊抗兔抗体
(1∶ 200) ，室温避光反应 2 h。用 PBS 冲洗 3 次后利
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用激光共聚焦显微镜观察。
1． 3 统计学方法 采用 SPSS12． 0 统计软件。计量
数据以 珋x ± s 表示，采用 Students t 检验，P≤0． 05 为
差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 蛋白印迹法 低浓度木兰花碱不影响 HERG
蛋白的表达(P ＞ 0． 05) ，高浓度的木兰花碱显著抑
制 HERG蛋白，P ＜ 0． 01。1、3、10、30 μmol /L 的木
兰花碱作用后 HERG 蛋白表达的光密度积分值分
别为 1． 01、1． 03、0． 71 和 0． 69。高浓度与低浓度比
较，P ＜ 0． 01。
2． 2 免疫荧光法 显微镜观察发现，低浓度木兰花
碱荧光强度与对照组相比并无明显变化，随木兰花
碱浓度升高，细胞膜上的荧光强度逐渐减弱，与蛋白
印迹法结果一致。
3 讨论
HERG蛋白属于 N 连接糖蛋白，研究发现其细
胞外部分存在两个糖基化的位点(N598，N629) ，N
连接糖基化与 HERG 通道的稳定性有密切关系，控
制蛋白质的折叠、运输、修饰、以及使其免受蛋白酶
的降解［6］。HERG蛋白在转运至细胞膜前，需要在
内质网中合成，经高尔基复合体的修饰加工，在这个
过程中，发生错误的折叠或装配不完全的蛋白会在
内质网中被质量控制识别并使其潴留在内质网中被
降解，其中质量控制机制包括伴侣蛋白控制和蛋白
酶降解，均可以影响成熟蛋白的表达。近年来发现，
HERG钾通道在心律失常的发生与治疗中起双重作
用，HERG缺陷可引起先天性 QT 间期延长综合征
(LQTS) ，同时某些药物通过阻断钙通道，抑制
HERG蛋白表达，可引起获得性 LQTS，甚至引起猝
死［7，8］。即 HERG钾通道不仅是抗心律失常药物作
用的一个重要靶点［1］，也是产生致命性心律失常的
分子靶位。因此对 HERG 钾通道的研究将有助于
开发更安全、更高效的抗心律失常药物。
木兰花碱属于双苄基异喹啉类生物碱，具有良
好的抗心律失常作用［2］。但其具体的分子机制及
细胞生物学机制并未完全阐明。本研究采用针对 N
末端的 HERG通道蛋白抗体作为一抗，蛋白印迹法
发现 HERG-HEK-293 细胞存在两条带，其中相对分
子质量为 155 kD的蛋白为 HERG 通道完全糖基化
形式，即该通道的成熟形式，主要定位于细胞膜上;
而相对分子质量为 135 kD 的蛋白为 HERG 通道核
心糖基化的形式，即成熟通道的前体，主要存在于内
质网和高尔基复合体中［9］。高浓度木兰花碱作用
后 HERG蛋白表达明显受抑。
本研究证实，高浓度木兰花碱可明显抑制
HERG蛋白表达，此可能为其抗心律失常的分子机
制。本研究为木兰花碱的安全性应用提供了理论支
持。
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(收稿日期:2011-06-08)
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