全 文 ：in duces caspasedep endent cell death mediated via the mito
chondrial pathw ay in leuk emia cel ls [ J] B lood, 2006, 108
( 2) : 630637
[ 8] Liang M, Fu J T riptolide in hibit s inter ferongamma induces
p rog ramm ed death1 ligan d1 surface exp ress ion in breast
can cer cell [ J] Cancer L ett , 2008, 270( 2) : 337341
[ 9] L e Saqe C, Naqel R, Eqan D A, et al . Regulation of th e P27
( Kip) tum or su ppres sor by miR221 and miR222 pr om otes
can cer cell prolif erat ion [ J] EMBO J , 2007, 12: 15
[ 10] Liu Y, Xi L, Liao G, et al . Inh ibit ion of PC cellderived
gr ow th factor ( PCDGF) / granu lin epithelin p recu rsor ( GEP)
decreas ed cel l prolif erat ion and invasion thr ou gh dow nr egula
t ion cyclin D and CDK4 and inact ivat ion of MMP2 [ J] BMC
Canc er, 2007, 29( 7) : 2226
[ 11] L ee W K, Kim H J, Lee Y S, e t al . Acteoside inhibit s hu
man pr om yelocyt ic HL60 leukemia cel l prolif erat ion via cell
cycle ar rest at G 0/ G 1 ph ase and dif ferent iat ion in to monocyte
[ J] Carcin Og enesi s, 2007, 28: 19281936
[ 12] Vuocolo S, Soprano D R, Soprano K J, e t al . P21/ kip
mediates ret inoic acidin duced su ppres sion of ovarian carcin o
ma cell grow th [ J] Ce ll P hysiol , 2004, 199: 237243
[ 13] Onumah, George E J, Zh ao Y F, et a l . Overexpression of
catalas delays G0 / G1 t oS phase t ransit ion during cell cycle
progression in mouse aort ic endothelial cel ls [ J] Fre e Radic
B iol Med , 2009, 46: 16581667
[ 14] Sriru pa R, Malikarjuna G, Kumaragu ruparan R, et al . p21/
Cip1 and p27/ Kip1 ar e essent ial m olecu lar targets of in os itol
hexahosphate for it s ant itumor eff icacy agains t prostate
cancer [ J] Canc er Re s, 2009, 69( 3) : 11661173
[ 15] Kim D H Prognost ic im plicat ion s of cycl in B1, p34cdc2, p27
( kip1) an d p53 ex pres sion in gast ric can cer [ J] Yonse i Med
J , 2007, 48: 694700
藤黄酸诱导胃癌细胞凋亡及抗肿瘤转移的实验研究
黄恺飞*
(厦门市医药研究所 药物研发中心,福建 厦门 361003)
摘 要:目的 研究藤黄酸对人胃癌 BGC803 细胞增殖和转移相关能力的影响及其机制。方法 MTT、H oechst
染色法检测藤黄酸对 BGC803 细胞的增殖和凋亡的影响;侵袭小室模型等方法检测藤黄酸对 BGC803 细胞侵袭、
黏附、迁移的影响; 运用 RTPCR、Westernblo tting 法分析藤黄酸对胃癌细胞凋亡和转移相关基因 bcl2、bax、细胞
黏附分子1 ( ICAM1) mRNA 和蛋白表达的影响。结果 藤黄酸抑制 BGC803 细胞的生长,其抑制率与药物浓
度及作用时间呈依赖关系。低浓度的藤黄酸处理 BGC803 细胞后, 可明显降低胃癌细胞的黏附、迁移和侵袭能
力。随着藤黄酸浓度的增大, bcl2、ICAM1 mRNA 和蛋白表达均下调, bax mRNA 和蛋白表达上调。结论 藤黄
酸对胃癌细胞 BGC803 有明显的生长抑制作用,具有显著的促肿瘤细胞凋亡作用和抑制肿瘤细胞转移相关性质,
其机制可能与下调 bcl2、ICAM1 及上调 bax 的表达有关。
关键词:藤黄酸; 肿瘤; 侵袭; 细胞凋亡; 转移
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11182306
Experimental study on gambogic acidinduced gastric cancer cell apoptosis
and antitumor metastasis
HUANG Kaifei
( Drug R & D Cent er , X iamen M edicine Research Inst itute, Xiamen 361003, China)
Abstract: Objective T o invest ig ate the inhibit ion o f gambog ic acid on pro liferation and metastasis
ability o f BGC803 cells and to study their preliminar y mechanism further. Methods Methy l thiazoly l
tet razolium ( M TT ) and Hoechst staining w ere used to study the effects of gambog ic acidinduced apoptosis
in gast ric cancer cell line BGC803; Invasive methods w er e used to study the ef fects of invasion, adhesion,
migrat ion by gambogic acid; T he inf luence of g ambogic acid on the expression of bcl2, bax , and ICAM1
gene in gast ric cancer cells w as evaluated by RTPCR and Westernblo tt ing. Results Gambogic acid w as
found no t only to inhibit the grow th of BGC803 cells but also to induce the cell apoptosis in a dose and
timedependent manner. The ability of adhesion, mig ration, and invasiveness w as clearly inhibited by
gambog ic acid. With the increase of g ambogic acid concentr at ion, the expression of bcl2, ICAM1 gene,
and pr otein w er e downregulated and the expression of bax gene and pro tein were upregulated. Conclusion
Gambog ic acid could inhibit the g row th o f g ast ric cancer cells BGC803 significant ly, have a significant role
1823 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100205 作者简介:黄恺飞( 1982 ! ) ,男,安徽桐城人,研究实习员,硕士研究生, 现工作于厦门市医药研究所, 主要从事药物研发等相关工作。T el :
( 0592) 2050262 Em ail: hk f5306@ 163. com
in pr omot ing tumo r cell apoptosis, and inhibit tumo r cell metastasisassociated propert ies. The mechanism
may be r elated to decrease of bcl2, ICAM1 expression and increase bax expression.
Key words: g ambog ic acid; tumor; invasion; apoptosis; metastasis
藤黄酸 ( gambog ic acid) 是藤黄 Garcinia han
bur y i Hook. f . 的主要活性成分。近年研究表明,
藤黄酸对肝癌、胃癌等肿瘤细胞株均有明显的抑制
作用[ 12] ,具有广泛的抗肿瘤作用 [ 34]。目前研究认
为其抗肿瘤作用可通过阻滞细胞周期由 G 2期向 M
期过渡[ 5]、抑制 NFB 信号通路[ 6] 、抑制 T OPO ∀
的催化活性 [ 7] 等途径来实现, 但是其确切机制尚未
清楚。
肿瘤转移是恶性肿瘤生物学特征之一, 也是肿
瘤临床治疗的难题[ 8] 。目前对其研究较多的是有关
其分子机制方面,肿瘤转移是一个多阶段复杂的过
程,其中包括肿瘤细胞的脱落、迁移、黏附、生长等,
每一阶段都受不同因素的影响和调控[ 9]。胃癌细胞
的淋巴转移也成为胃癌治疗的一大障碍, 对胃癌转
移及其机制研究也逐渐成为热点[ 10] 。
目前关于藤黄酸抑制肿瘤细胞侵袭和转移的研
究报道很少,因此本实验选用人胃癌细胞株 BGC
803 为研究对象, 考察藤黄酸诱导肿瘤细胞凋亡及
对其黏附、迁移和侵袭的影响,并从分子水平上初步
探讨其作用机制。
1 材料
1 1 药品与试剂:藤黄酸 (质量分数> 99% ) 由中
国药科大学郭青龙教授惠赠。兔抗人 bcl2、bax、细
胞黏附分子1 ( ICAM1) 抗体、HRP羊抗兔 IgG
抗体 (武汉博士德公司) ; Hoechst 33258 染料 ( Sig
ma 公司) ; RPMI 1640培养基干粉、小牛血清 (美国
Gibco 公司) ; 化学发光试剂盒和蛋白定量试剂盒。
#型胶原蛋白 (美国 Sigma公司) , Thincert 侵袭小
室 ( Greiner 公司)。
1 2 仪器:梯度 PCR 仪 (美国 BioRad 公司) ; 荧
光倒置相差显微镜 (德国 Leica 公司) ; 凝胶成像仪
及分析系统 (美国 BioRad 公司) ; 水平、垂直电泳
槽 (南京大学仪器厂)。
1 3 细胞株: 胃癌细胞 BGC803 由中国药科大学
海洋药物中心提供。
2 方法
2 1 增殖抑制实验: 将 RPM I 1640 培养基培养的
胃癌细胞 BGC803 细胞每孔 5 ∃ 103个细胞接种于
96 孔板, 用不同浓度 ( 0、0 375、0 75、1 5、3、6
mol/ L) 藤黄酸分别处理 24、48、72 h 后,结束前 4
h 每孔加入新鲜配制的 0 25 mg / mL MTT 液 100
L,继续培养 4 h, 弃去培养基, 每孔加入二甲基亚
砜 ( DM SO) 150 L, 待完全溶解后, 酶标仪测定
570 nm 波长处的吸光度 ( A ) 值, 重复 3 次。细胞
抑制率= ( 1- A 加药 / A 对照 ) ∃ 100%,以 3个复孔的平
均值,计算藤黄酸作用 48 h 的 IC50 , 实验重复 3次。
2 2 Hoechst 染色观察藤黄酸对胃癌细胞 BGC
803凋亡的影响:将细胞以 6 ∃ 104 /孔接种于 24 孔
细胞培养板, 24 h 细胞完全贴壁后, 更换含有 0、
0 75、1 5、3 mo l/ L 藤黄酸的 RPM I 1640 培养基,
在 37 % 、5% CO 2、95% 湿度条件下培养 48 h, PBS
洗涤两次,用甲醇醋酸 ( 3 & 1) 固定细胞 20 min,
PBS 洗涤两次,加入 Hoechst 溶液 37 % 闭光温浴
10 m in 后,荧光显微镜下观察凋亡细胞。
2 3 细胞与#型胶原蛋白间黏附能力的检测: 将#
型胶原蛋白储液用 PBS 稀释成 0 1 mg/ mL, 按 50
L/孔加入到 96 孔培养板中, 4 % 过夜后再于
37 % 下孵育 2 h。将细胞分为两组: 黏附细胞组,
分别以 0、0 1、0 2、0 3 mol/ L 藤黄酸处理 BGC
803细胞 2 h 后,用 0 125% 胰蛋白酶消化细胞,按
1 5 ∃ 104 /孔接种到已包被#型胶原蛋白的 96 孔培
养板中,于 37 % 、5% CO 2条件下培养 24 h,用 PBS
洗涤未黏附的细胞, M T T 法测定黏附细胞的 A 值;
对照组细胞处理同黏附细胞组, 但不用 PBS 洗涤,
直接采用 MT T 法测定 A 值。每组设 6个平行孔。
同时,测定#型胶原蛋白包被但未接种细胞的孔作
为空白组。按照如下公式计算黏附率。
黏附率= ( A黏附组- A 空白组 ) / ( A对照组- A 空白组 ) ∃ 100%
2 4 二维水平细胞迁移实验:将 BGC803 细胞按
6 ∃ 104 /孔接种到 24 孔培养板中, 培养 24 h, 待细
胞长成均匀单层后,用无菌 10 L 移液器吸头延孔
的中轴线轻轻划过。用 37 % PBS 除去细胞残骸
后,加入 37 % 含有 0 1、0 2、0 3 mol/ L 藤黄酸的
培养基,继续培养 0 5~ 1 h 后, 以这一时间作为零
时间点,分别在 0、12、24、48 h 时通过倒置显微镜
( 50 ∃ ) 观察细胞迁移情况,并利用目镜刻度尺测量
划痕宽度 ( S) , 每孔测量 5 处(即两端、中点、左 1/ 4
处和右 1/ 4处) ,求平均值。每组细胞均设 3个平行
孔,按照如下公式计算细胞迁移率。
迁移率= ( S零时间点- S 测试点 ) / S零时间点 ∃ 100%
1824 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
2 5 三维水平细胞迁移实验: 用无血清 RPMI
1640 培养基制备单细胞悬液, 调整浓度为 2 5 ∃
10
5
/ mL;向 24 孔培养板中加入 600 L 含 10% 小
牛血清的 RPM I 1640 培养基, 然后将 Thincert 侵
袭小室浸入,再向小室中加入 200 L 含有 0、0 1、
0 2、0 3 mol/ L 藤黄酸的培养基处理过的细胞悬
液 (即 5 0 ∃ 104个细胞) ; 37 % 培养 24 h 后, 取出
Thincert 小室,用手术刀片小心沿小室边缘将膜切
下,将膜下表面向上放在一个洁净的 24 孔培养板
的孔中;用甲醇冰醋酸 ( 3& 1) 固定 10 min, 然后
用 10% 姬姆萨染液染色 15~ 30 m in; 将膜用蒸馏
水漂洗干净后在倒置显微镜下 ( 200 ∃ ) 随机选取 6
个视野 (上、下、左、右各一, 中央两个) 计数细胞
(呈紫色)。
2 6 RTPCR 法检测 bcl2、bax、ICAM1 基因的
mRNA 表达: 以 0、0 75、1 5、3 mo l/ L 藤黄酸处理
BGC803细胞 24 h 后, T rizol 一步法提取细胞总
RNA,取总 RNA 2 g , 用 MMLV 逆转录酶进行
逆转录, PCR 扩增 bcl2、bax、ICAM1, 同时扩增磷
酸甘油醛脱氢酶 ( GAPDH) 作为内参照,引物由上
海生工生物技术公司合成。bcl2 引物序列:上游为
5∋TGT GT GTGGAGAGCGT CAACC3∋, 下 游 为
5∋TT CAGAGACAGCCAGGAGAAATC3; bax
引物 序列: 上游 为 5∋TCAGGAT GCGT CCAC
CAAGAA3∋, 下游为 5∋T CCCGGAGGAAGTC
CAAT GTC3∋; ICAM1 引物 序列: 上游为 5∋
TAGCCAACCAAT GTGCTAT T3∋, 下 游为 5∋
CAGCGTAGGGT AAGGT TCT TG3∋; 内 参 照
( GA PDH ) 引物序列: 上游为 5∋ATT CAACG
GCACAGTCAAGG3∋, 下游为 5∋GCAGAAGG
GGCGGAGATGA3∋。PCR 反应程序为: 预变性
94 % 、5 min,变性 94 % 、1 min,退火 58 % 、1 m in,
延伸 72 % 、90 s, 循环 30 次; 72 % 延伸 10 m in。
PCR 产物经 1 5% 琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下
观察并拍照。通过 Quant ity One 分析软件测定条
带吸光度值,以目的基因与 GAPDH 的比值表示各
基因 mRNA 的相对表达水平。
2 7 Western blot ting 法检测 Bcl2、Bax、ICAM1
蛋白表达变化: 以 0、0 75、1 5、3 mo l/ L 藤黄酸处
理 BGC803 细胞 24 h, 取样本离心收集细胞, 提取
细胞总蛋白, 12% SDSPAGE 电泳 ( 100 V) 2 h, 电
转移至硝酸纤维素 ( NC ) 膜上, 10% 脱脂奶粉封
闭,加入 1 &200稀释兔抗人 Bcl2、Bax、ICAM1 多
克隆抗体, 4 % 孵育过夜, TBST 漂洗后加入 HRP
羊抗兔 IgG 抗体, 室温孵育 2 h, 最后以化学发光法
显色。以!act in 作为内参。
2 8 统计学处理:结果以 x ( s 表示,用 SPSS 13 0
统计学软件进行分析, 数据两两比较采用 t 检验,多
组之间比较用 ANOVA 进行。
3 结果
3 1 藤黄酸对胃癌细胞株 BGC803 的增殖及凋亡
的影响:随着藤黄酸浓度的增加, 细胞存活率降低,
有明显的剂量依赖关系,藤黄酸作用 48 h 的 IC50值
为 1 54 mol/ L (图 1)。Hoechst 染色结果, 对照
组细胞饱满,胞浆丰富, 胞核圆形或椭圆形,染色质
荧光着色均匀。3 mol/ L 藤黄酸作用下明显看到
细胞核体积变小、皱缩, 可见致密浓染荧光,染色体
DNA 呈浓染的团块状、颗粒状分布, 提示出现了明
显的凋亡 (图 2)。
图1 藤黄酸对 BGC803 细胞增殖的抑制作用 ( x( s, n= 3)
Fig. 1 Inhibition of gambogic acid on prolif eration
of BGC803 cells ( x ( s, n= 3)
1对照组 2~ 4 075、1 5、3 m ol / L 藤黄酸组
1 cont rol g rou p 2 ! 4 0 75, 1. 5, an d 3 mol/ L
gam bogic acid group
图 2 Hoechst 染色观察藤黄酸对 BGC803 细胞凋亡
形态学的影响
Fig. 2 Effect of gambogic acid on morphology of BGC803
cells apoptosis observed via Hoechst staining
1825 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
3 2 藤黄酸对 BGC803 细胞黏附、迁移、侵袭的影
响:藤黄酸对胃癌细胞 BGC803和#型胶原蛋白的
黏附有明显的影响, 藤黄酸浓度为 0 3、0 2、0 1
mol/ L 时黏附率 分别为 ( 54 39 ( 2 42 ) %、
( 66 64 ( 1 98) %、( 91 90 ( 2 09) %,其中后两组与
对照组比较有显著差异 ( P< 0 05) (图 3) , 表明藤
黄酸能够显著降低胃癌细胞 BGC803 与#型胶原
蛋白间的黏附能力。与对照组相比, BGC803 细胞
在给予藤黄酸 0 1、0 2、0 3 mol/ L 后, 48 h 内的
迁移率表现出明显的降低 (图 4) , 表明藤黄酸可以
显著抑制 BGC803 细胞在二维水平上的迁移。藤
黄酸浓度为 0 1 mol/ L 时, BGC803细胞从 T hin
cert 侵袭小室上室穿过 8 m 孔径的 PET 膜迁移
到下室的细胞数目表现出轻微的减少, 细胞数目为
( 168 ( 40 5) 个。当剂量增大到 0 2、0 3 mol/ L
时, 迁移细 胞数目逐渐减少, 细胞数目 分别
为 ( 113 ( 3 2 3 ) 、( 1 0 1 ( 3 6 3 ) 个 , 对照组为
( 175 ( 37 6) 个 (图 5)。表明藤黄酸可以显著抑制
胃癌细胞 BGC803 在三维水平上的迁移。
与对照组比较: * P< 0 05
* P< 0 05 v s cont rol g rou p
图 3 藤黄酸对 BGC803 细胞和#型胶原黏附的影响
Fig. 3 Effect of gambogic acid on adhesion
of BGC803 cell to type # collagen
图 4 藤黄酸对 BGC803 细胞二维水平迁移的影响
Fig. 4 Effect of gambogic acid on BGC803 cell migration in two dimensions
与对照组比较: * P < 0 05
* P < 0 05 v s cont rol group
图 5 藤黄酸对 BGC803 细胞侵袭的影响
Fig. 5 Effect of gambogic acid on BGC803 cell invasion
3 3 藤黄酸对胃癌细胞 BGC803、bcl2、bax、
ICAM1基因 mRNA 和蛋白表达的影响:实验结果
表明藤黄酸能导致人胃癌细胞 BGC803 中 bcl2
和 IACM1 基因 mRNA 和蛋白表达明显下调, 并
随着藤黄酸的浓度升高而降低; 促凋亡基因 bax 表
达明显增加,并随着藤黄酸的浓度升高而增加, 呈一
定浓度依赖性。提示藤黄酸可能通过抑制 bcl2 基
因表达、降低 bcl2/ bax 值而诱导细胞凋亡。同时
减少 ICAM1 基因表达而抑制胃癌细胞 BGC803
的黏附和转移 (图 6)。
4 讨论
藤黄酸作为一种有效的抗肿瘤药物已被众人所
1826 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
与对照组比较: * P < 0 05
* P < 0 05 v s cont rol group
图 6 藤黄酸对 BGC803 细胞 bax、bcl2、ICAM1 基因 mRNA ( A) 和蛋白 ( B) 表达的影响
Fig. 6 Effect of gambogic acid on gene and protein expression of bax, bcl2, and ICAM1 of BGC803 cells
关注,近年来关于其机制有所研究,但具体的机制仍
不清楚。本研究发现藤黄酸可以通过减少 bcl2 基
因表达、降低 bcl2 与 bax 比率诱导肿瘤细胞凋亡,
同时通过减少 ICAM1 基因表达而抑制胃癌细胞
BGC803的黏附、迁移、侵袭。
肿瘤转移是一个多阶段复杂的过程,包括肿瘤
细胞的脱落、迁移、黏附、生长等,每一阶段都受不同
因素的影响和调控。首先, 原发肿瘤细胞从原部位
脱落,侵入细胞外基质 ( ECM) 与基底膜 ( BM) 中
大分子蛋白黏附。其次, 激活细胞合成并分泌各种
降解酶类, 降解 BM 及 ECM , 穿过脉管壁进入循环
系统,在循环中逃避免疫系统攻击, 最后穿过脉管,
外渗到达继发部位形成克隆, 增殖形成转移灶 [ 8]。
ICAM1 是一种重要表面黏附分子, 属免疫球蛋白
超家族,为 80~ 115 000 单链糖蛋白,在人体正常组
织基本不表达, 在一些恶性肿瘤中过度表达, 在肿瘤
细胞的黏附和侵袭转移过程中具有重要作用 [ 11]。
细胞凋亡是受基因控制的,有众多基因参与凋
亡过程, bcl2 原癌基因是迄今为止研究得最为深入
和广泛的凋亡调控基因之一。在许多肿瘤的发生过
程中, Bcl2 蛋白表达率呈逐渐增加的趋势, 提示
Bcl2蛋白表达增加是肿瘤细胞凋亡受抑的重要机
制之一。同时, M iyake等 [ 12]也发现 Bcl2 可以通过
延长不利环境下细胞生存而增强肿瘤细胞的转移
能力。
综上所述,藤黄酸可以诱导胃癌细胞 BGC803
的凋亡并抑制其黏附和转移,其诱导凋亡的机制可
能与下调 Bcl2, 上调 Bax 相关; 同时可能通过下调
bcl2、ICAM1 基因的表达而抑制肿瘤细胞的黏附
和转移。
致谢:奚涛教授对本论文的指导和支持。
参考文献:
[ 1] Liu W, Guo Q L, You Q D, et al . Ant icancer ef fect an d
apoptosi s in duct ion of gam bogic acid in hum an gast ric can cer
line BGC803 [ J] Wor ld J Gast roenterol , 2005, 11 ( 24 ) :
36553659
[ 2] Guo Q L, You Q D, Wu Z Q, e t al . General gam bogic acids
inhib ited g row th of h uman h epatom a SMMC7721 cells in
v i tr o and innud e m ice [ J] A cta P har macol Sin , 2004, 25
( 6) : 769774
[ 3] 崔国惠, 舒文秀, 吴 青, 等 藤黄酸对 K562 细胞 hERG 钾
通道蛋白的调控作用 [ J] 中草药, 2009, 40( 6) : 915919
[ 4] 舒文秀, 陈 燕, 何 静, 等 藤黄酸对急性白血病细胞
U937 增殖和凋亡的影响及对核孔蛋白 Nup88 的调控作用
1827 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
[ J ] 中草药, 2008, 39( 1) : 7478
[ 5] C hen J, Gu H Y, Lu N, et al . Microtub ule dep olymeriz at ion
and phosph orylat ion of cJu n Nt erminal k inas e1 and p38
w ere involved in gambogic acid induced cell cycle arrest and
apoptosis in hum an b reast carcin om a M CF7 cell s [ J] L if e
Sc i , 2008, 83( 34) : 103109
[ 6] Pandey M K, Sung B, Ahn K S, et al . Gambogic acid, a novel
ligand for t ransferrin receptor, potentiates TNFinduced apoptosis
through modulat ion of the nuclear factorkappa B signaling path
w ay [ J] B lood, 2007, 110( 10) : 35173525
[ 7] Qin Y, Meng L, Hu C, e t al . Gambogic acid in hibit s th e ca
t alyt ic activity of hum an topois om erase ∀A b y binding to it s
AT Pase domain [ J] Mol Cancer Th er , 2007, 6 ( 9) : 2429
2440
[ 8] 张润玲 肿瘤转移的分子机制 [ J] 兰州医学院学报, 2000,
26( 2) : 5456
[ 9] 佟 玲, 王文萍, 邢玉庆 肿瘤转移的分子机制研究进展
[ J] 肿瘤学杂志, 2004, 10( 3) : 185187
[ 10] 赵静丽, 季 峰 胃癌细胞转移相关促移动因子研究进展
[ J] 国际消化病杂志, 2009, 29(3) : 178180
[ 11] Gho Y S, Kim P N, Li H C, et al . St imu lat ion of tum or
grow th by hum an soluble intercellular adhesion molecule1
[ J] Carcinoma Res , 2001, 61: 42534257
[ 12] Miyake H , H ara I, Yamanake K, e t al . Overex pres sion of
Bcl2 enhances metastat ic poten tial of h uman bladder can cer
[ J] Br i J Canc er , 1999, 79( 11) : 16511656
白杨素提高肿瘤坏死因子诱导肝癌细胞 HepG2 凋亡能力的研究
李 欣1 ,王剑宁2 ,熊习昆1 ,陈美芬1 ,古梅英1 , 杨 颖1 ,王凤岩1 ,杨杏芬1 ,黄俊明1 *
( 1 广东省疾病预防控制中心 毒理所, 广东 广州 510300; 2 中山大学光华口腔医学院
附属口腔医院 口腔颌面外科, 广东 广州 510055)
摘 要:目的 研究白杨素提高肿瘤坏死因子( TNF)诱导肝癌细胞 H epG2 凋亡的能力, 并对其分子机制进行
初步探讨。方法 白杨素以不同浓度 ( 10、20、40 mol/ L ) 单独或联合 T NF( 10 ng/ mL ) 处理 H epG2 细胞后, 于
普通及荧光倒置显微镜下观察细胞形态变化,获得细胞死亡的定性资料; 流式细胞术检测 subG1 峰,分析峰值变
化规律,获得细胞死亡的定量资料; 并以 Western blotting 方法检测凋亡标志蛋白 caspase3、caspase8 和 PARP 原
蛋白和相应的裂解产物的变化情况及凋亡抑制蛋白 BclxL、cIAPs、x IAP、cFLIP 的时间效应变化规律。结果 形
态学观察可发现白杨素联合 TNF处理 H epG2 细胞后, 与对照组比较细胞出现明显的死亡数量增加, 而单独白
杨素组、TNF组与对照组比较则未观察到明显的细胞减少 (P> 0 05) ;流式细胞术分析 subG1 的定量资料也支
持这一结果,联合处理组 subG1 值随着白杨素剂量增加而增大,最高达到 ( 27 84 ( 0 54) % ,与对照组比较有显著
差异 ( P< 0 05) , H ochest 33342 荧光染色在联合处理组可观察到明显的核固缩细胞增加; Western blott ing 检测到
凋亡标志蛋白 caspase3、caspase8 和 PARP 原蛋白减少、相应的活化裂解片段出现;全 caspase 酶抑制剂 zVAD
fmk 可有效抑制联合处理组 H epG2 细胞死亡、subG1 峰消失比值减少, 阻止凋亡标志蛋白 caspase3、caspase8 和
PARP 的活化降解; TNF引起的凋亡抑制蛋白 cFL IP1 表达量增加, 随联合处理时间延长而明显下调,与对照组
比较有明显差异, BclxL、x IAP 等其他凋亡抑制蛋白没有明显改变。结论 白杨素能够有效提高 T NF诱导
HepG2 细胞凋亡的能力, NFB 调节的凋亡抑制蛋白 cFLIP1 表达减少是其重要的分子机制。
关键词:白杨素; 肿瘤坏死因子 ( T NF) ; 细胞凋亡
中图分类号: R286 91 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 11182807
Acceleration of chrysin on apoptosis of hepatoma cell lines HepG2 induced by TNF
LI Xin
1
, WANG Jianning2 , XIONG Xikun1 , CHEN M eifen1 , GU M eiying1 ,
YANG Ying
1
, WANG Fengyan1 , YANG Xingfen1 , HUANG Junming1
( 1 I nstit ute o f Tox icolog y, Center fo r D isease Contro l and Prevention of Guangdong Province, Guang zhou 510300, China;
2. Oral and Maxillofacial Sur ger y, Guanghua School of Stomatolog y, H ospital of Stomat olo g y,
Sun Yatsen Univ ersity , Guang zhou 510055, China)
Abstract: Objective T o research whether chrysin can sensit ize the cell death of hepatoma ( HepG2)
cell lines induced by TNFand explore the molecular mechanism of this sensit izat ion. Methods HepG2
Cells w ere pret reated w ith designed dose of chry sin ( 10, 20, and 40 mo l/ L ) fo r 2 h, then fol low ed
TNF ( 10 ng/ mL) for 24 h, the morpholog ic changes w ere obser ved under inversed m icroscope and the
percentag e of subG1 was measured using f low cytometry , the proprotein and cleavage o f caspase3,
1828 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 11 期 2010 年 11月
收稿日期: 20100312 基金项目:广东省自然科学基金资助项目 ( 9151030003000004) ; 广东省中医药强省科研立项资助项目 ( 2009431)作者简介:李 欣( 1973 ! ) ,女,副主任医师,医学硕士,研究方向为天然产物的生物学活性。
* 通讯作者 黄俊明 T el: ( 020) 84452254 Email: lixinsm@ gmail. com