全 文 ：中草菊ChineseTraditionalndHerbalDrags第38卷第9期2007年9月·1425·
青蒿素组合生物合成的研究进展
刘项谦1，田 娜2，李娟1，刘仲华““，黄建安1
(1．羽南农业大学湖南省天然产物工程技术研究中心．湖南长沙410128
2．湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙410128)
摘要：青蒿素是来自菊科艾属植物青蒿Artemisia4棚船中的一种抗疟有效成分，近年国际市场对其需求量快速
增长。组合生物合成法将成为制备青蒿素的主要有效手段·在该研究领域也取得了重要进展。综述了青蒿誊生物台
成途径、高产青蒿素工程茵的构建以及青蒿素组合生物台成的基因诃控等方面的最新研究进展，分析了该领域目
前面临的新问题与困难，并探讨未来的发展趋势。 ．
关键词：组合生物合成，青蒿素，疟疾，代谢工程
中田分类号：R284 文献标识码：A 文章缩号t0253—2670(2007)09—1425一07
Advancesinstudiesoncombinatorialbiosynthesisofartemisinin
LIUShuo—qianl，TIANNa2，LIJuanl，LIUZhong—hual～，HUANGJian—anl
(1．HunanProvincialEng neednganTechnologyReseaxehCenterofNaturalProducts，HunanAgricultureUniversity，
Changsha410128·China2-HorticultureandGa deningCollegeofHunan
AgticultureUniv rsity，Changsha410128，China)
Keywordsl combinatorialbiosynthesis，artemisinin，malaria，metabolicengineering
疟疾是流行范围最广，历史最长、危害最大的人类寄生虫
传染病，长期以来一直是第三世界国家发病率和死亡率最高
的病种之一。目前全球每年发生3～s亿起疟疾感染病例，其
中死亡人数达一百万之多o]．由于疟疾致病微生物疟原虫
Plasmodium血lciparum具有对多种药物的耐药性，从而导
致疟疾的防治工作根难取得令人满意的效果嘲。虽然已有一
些化学合成抗疟药物闻世，但其效果和安全性还有待严格的
临床验证，估计至少需要5年时间才能实现商品化o】。青蒿素
“rteannuin)是我国学者首次从菊科艾属植物青蒿(又称黄花
蒿)ArtemisiaantllgaL．中分离得到的一种倍半萜内酯过氯
化物，能有教抑制疟原虫的肌浆一内质喇ATP酶
(SERCA)c]，是治疗疟疾的特效药。特别是对脑型疟疾和抗
氯喹恶性疟疾的疗效更为突出。药用青蒿索是从青蒿植株的
叶片及花蕾中提取的，由于青蒿中青蒿素量不高(o．ol蹦～
0．6％)，而且提取环节复杂，费时费力，致使青蓠素的生产成
本高，产量低，无法满足市场需求嘲。因此，如何有效制备青蒿
素一直是近年来研究的热点问题。虽然有报道利用化学合成
的方法获得了青蒿素，但由于青蓠索有多个手性碳原子，使得
台戚步骤非常复杂、产率低、戒率高，从而很难应用于工业化
生产“)．随着基因工程等生物技术的快速发展，特别是蛊20
世纪90年代，组合生物合成(combinatorialbiosynthesis)概
念的提出，标志着人类应用生物技术又迈进了一个崭新的阶
段踟。组合生物合成是指将不同生物体来源的基因组合在微
生物体内生产生物活性物质的方法口】。本文就组台生物合成
技术在青蒿素规模化制备方面的应用作一综述。
1青蓠素生袖台成途径
青蓠索的生物台戚途径属于植物类异戊二烯代谢途径。
目前已发现植物类异戊二烯的生物合成至少存在甲羟戊酸
(mevalonicac d，MVA)和由丙酮酸起始的5一磷酸脱氧木酮
糖(deoxyxylulose5-p110sphate，DXP)两条途径”J。青蒿素等
倍半藉类物质的生物合成途径属于MVA途径，该途径在细
胞质中进行。2003年，壬红等[D3对青蒿索的生物合成途径做
了较全面的综述，但近年来又取得了新的进展，提出了许多
新的甚至不同的观点，本文从以下两方面进行阐述。
1．1从紫穆槐一4，11一二烯(amorpha-4tll-diene)到青蒿酸
和二氢青蓠酸：紫穗槐一4，1l一二烯是青蓠索的第一个特异性
前体物质，是由法呢基焦磷酸(FPP)在紫穗槐一4，1l一二烯合
酶(ADS)的催化下发生自身环化而生成“““]。紫穗槐一4，11一
二烯耆有一十烯丙基结构，很容易在细胞色素P450或脱氢
酶作用下氧化生成相应的醇、醛和酸等化台物“扣u]．
Woerdenbag荨[1”首次从青蒿根组织中分离得到了紫稿槐．
4，11一=烯的氧化产物青蒿醇(artemisinicaleoh01)。2005年，
Bertea等【I”利用气一质联用法首次在青蒿的叶及其臁毛体中
检测到了青蒿醇，二氢青蒿醇(dihydro—artemisincalcoh01)、
麟㈣
万方数据
·1426· 中革番ChhtcseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第9期2007年9月
青蒿醛(artemisiniealdehyde)、二氢青蒿醛(dihydro-
artemisinicaldehyde)。同时，通过一系列酶学实验证实了在
非可溶性细胞色索P450单氧化酶立体选择性催化下，紫穗
槐一4。11-二烯羟基化生成青蒿醇[1”I随后，青蒿醇在脱氢酶
的作用下氧化生成青蒿醛，青蒿醛在还原酶作用下生成二氢
青蒿醛，二氢青蒿醛在脱氢酶作用下进一步氧化生成二氢青
蒿酸。由此，提出了紫穗槐一4，11一二烯一青蒿醇÷青蒿醛一
二氢青蒿醛·二氢青蒿酸生成合成框架。Bouwmeester从化
学能的角度对该途径进行了合理的解释Ⅲ]。此后，Teoh“”
和Roc”1厘其合作者先后从青蒿花芽腺毛体中克隆了细胞
色素P450单氧化酶编码基因日PflAVJ。Teoh等“o发现
CYP71AVl基因在酵母中的异源表达产物能体外催化紫穗
槐．4．11一二烯氧化反应生成青蒿醇，继而依次向青蒿醛和青
蒿酸转化。Ro等“”将CYP71AVl基因克隆人工程酵母菌，
体内获得了青蒿醇、青蒿醛和青蒿酿。因此，紫穗槐一4，11一二
烯似乎还存在另外一条氧化途径，即紫穗槐一4，11一二烯_’青
蒿醇一青蒿醛啼青蒿酸途径，P450单氧化酵能催化该途径
的3步氧化反应。
1．2从青蒿酸或二氢青蒿酸到青蒿索：以前人们认为青蒿
酸首先还原生成二氢青蒿酸，然后再经过多步复杂的反应转
化为青蒿索。近年研究结果表明，青蒿索与二氧青蒿酸之间
并没有发生相互转化““。汪猷等。““1用放射性同位紊标记
的方法，证明了青蒿酸是青蒿翥B(arteannuinB)和青蒿素
的共同前体。Sangwan等啡]用“C标记的青蒿酸饲喂青蒿小
枝．随后在青蒿素B和青蒿素中均检测到放射性．表明青蒿
酸是青蒿隶B和青蒿索的共同前体。Nair等“”利用粗提的
和部分纯化的青蒿叶片提取物在体外实现了由青蒿素B向
青蒿索的转变，提出了青蒿寨B是青蓠酸转变成青蒿素的中
间产物。Bharel等Ⅲ3发现青蒿叶细胞提取液能将青蒿酸、青
蒿索B以及二氢青蒿煮B转变为青蒿索，认为青蒿酸首先
转化为青蓠素B．然后还原成二氢青蒿索B，二氢青蒿素B
能迅速转化为青蒿素。Ahdin等“”对转化青蒿酸的青蒿叶细
胞提取液进行了分离纯化，得到两种不同相对分子质量大小
的蛋白质，证实了这两种蛋白质参与了青蒿酸向青蒿京的转
化。Dhingra等o“”3同样采用青蒿叶无细胞体系成功实现了
青蒿素B向青蒿素的转化，并分离与鉴定了参与该转化反应
的酶蛋白。2006年，Tatineni等“”利用微生物
Mcirobacte—umtrichotecenolyticum发酵产物，以青蒿紊B为
底物，结果获得了青蒿素，并在微生物的发酵产物中分离到
一种未知酶，该酶负责青蒿索B向青蒿索的转化。
同样．=氢育蒿酸可通过一条独立于青蒿酸的途径转化
成青蒿褒，但研究者认为由二氢青蒿酸向青蒿素的转化对青
蒿生物合成青蒿素的意义不大Ⅲj。Wallaart等m‘3”从青蒿中
分离得到二氢青蒿酸和二氢青蒿酸氢过氧化物，在体外模拟
植物体内存在的光化学反应条件下，二氢青蒿酸可转化成青
蓠素．在反应的中间产钫中检测刭二氢青蒿酸氢过氧化物，因
而认为从二氢青蒿酸向青蒿索转变的过程不需要酶的参与，
在具光致敏性质的化合物的激发下自发完成。sy等o“发现二
氢青蒿酸在有机溶液中能发生自发氧化反应·援慢转化为青
蒿索。进一步的实验表明二氢青蒿酸分子中(；-12燕酸基对其
自发的氧化反应有促进作用。c一12靛酸基的作用主要表现在
A4，5双键加氧需要C一12羧酸基}同时，该基团能催化随后
的二青蒿酸氢过氧化物的Hock裂解{此外-青蒿素的1州24
三氧烷环结构的形成也离不开该基团的参与m]．Brown等口”
将同位素标记的二氢青蒿酸通过青蒿植株的根饲喂青蒿植
株．结果几天后在青蒿植株地上部分检测到具放射性的青蒿
索及其他C一12羧酸基倍半萜类化合物．其中15种化台物已
知在青蒿体内自然存在。Brown等认为二氢青蒿酸在体内首
先通过A4．5双键与单线氧反应生成氢过氧化合物，该反应
可能需要致敏化合物(如植物色素)的参与，随后，该氢过氧化
合物经过与体外相同的3步自发反应(Hock裂解、三线氧加
成和环化反应)生成青蒿素。在该研究中，Brown等还注意到
同位素标记的青蒿索占青蒿中总青蒿素的比例非常小．从而
推测，青蒿植株体内富集的青蒿素可能主要是由青蒿酸转化
而来，而二氢青蒿酸的贡献较小”“。
根据以上研究结果，结合更早报道的有关青蒿素及植物
类异戊=烯类化合物的生物合成研究成果．可以初步总结出
青蒿索的生物合成途径(图1)。从图1可以看出，青蒿紊的
合成是首先由乙酰辅酶A经MVA途径生成FPP，然后在
ADS酶作用下FPP环化生成紫穗槐一4，11一二烯，在P450的
作用下紫穗槐一4，11_二：烯氧化生成青蒿醇和青蒿醛．青蒿醛
可能经过两条独立的氧化途径最后生成青蒿紊t其中青蒿酸
氧化途径可能是青蒿素主要的生物合成途径。
2工程大肠杆菌生产青蓄素
2．1 DXP途径的基因调控：FPP是大肠杆菌合成辅酶Q和
细胞壁必不可少的物质，同时它又是青蒿素等具有重要药理
作用的类异戊二烯生物台成的先导物质．这为利用大肠杆菌
生产青蒿素提供了必需的物质基础。在大肠杆菌等原棱生物
中，FPP是由异戊烯基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙
基焦磷酸(DMAPP)在酶的作用下合成，细胞中IPP和
DMAPP的量对大肠杆菌生产类异戊二烯化合物的效率非
常重要o”。一般情况下，原棱生物IPP和DMAPP都是来自
于DXP的生物合成途径，与MVA途径不同，该途径中lPP
和DMAPP的合成需经过两个不同的分支．从而增加了其生
物合成的基因调控复杂性。Sandmann呻]和Huang口”及其合
作者的研究表明，DXP途径合成IPP和DMAPP的不足是
大肠杆菌高效生产类异戊二烯化台物的主要障碍。1一脱氧一
口．木酮糖一5一磷酸合成酶(DXS)是DXP途径的起始酶，它对
IPP和DMAPP的合成至关重要。Cunningham等o”将藻青
苗和植物LytB基因(功能尚未清楚)导人产类胡萝h素工程
苗，均能显著提高类胡萝卜素的产量，该基因表达产物可能
起到平衡工程菌体内IPP和DMAPP相对量的作用。
Kaiiwara等o”将IPP异构酶编码基因／di在细菌中过量表
达，结果提高了类异戊二烯的积累量，显然，通过对DXP途
径关键酶的基因调控，在一定程度上提高了类异戊二烯化舍
物的产量，但由于DXP代谢途径调控复杂·特别是IPP和
万方数据
中卓鸯ChineseTraditiomdudHerbalDrugs第38卷第9期2007年9月·1427·
CO=+H,O
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乙酰辅酶A
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锻嘲强一。从《人畦入
1一紫穗槐一4，11一二播2一青蒿醇3-青蒿醛}二氧青蓠醛5一青蔫酸6--氢青蒿酸7-青蒿酸氯垃氯化物8一二氢青
蓠酸氧过氧化翱9一青蒿素B10-来命名1l·二氢青蒿素B12-来龠名13-青蒿烯“一青蒿素▲表示可艟的青莆
素生物合成前体
1-amorpha-4．1l叫lieneZ-art misiuicalcohol3-artemlsinicaldellyde@didydreanemlslnical如hyde5-lutemisitdcac d
6-dihydroartenlisinicacid7-artemisinicac dhydroperoxlde8_dihydroe_rtemisinlc扯Idhydroperoxide*盯钯咖inB
10-unnamed11坷hydroarteannuinB 12一 nDaIned13-artemieitcne14-artemleinln▲possibleint rmediates。f
artemislinn
田1推舅的膏麓囊生物台成途径
Fig．1Proposedpathwayofrtemlsinlab esynthesb
DMAPP存在两个生物台成分支，从而制约了目标钫质产量HMGS和酵母去调节区HMG辅酶A还原酶基因IHMGR
的进一步提高。
2．2外源MVA途径的构建；Martin等Ⅲ1绕过DXP途径，
将酵母中MVA途径申8十关键酵基因组合，在大肠杆菌体
内构建一条外源MVA途径。将MVA途径8个关键酶基匿
分解成两个操纵子，其中大肠杆菌乙酰辅酶A硫解酵基因
atoB、酵母HMG(3一羟基·3一甲基戊二酰)辅酵A台酶基因
组装在同一个质粒载体pMevT中构成操纵子MevT，而将
酵母甲羟戊酸激酶基因ERGIZ、酵母磷酸甲羟羟戊酿激薅
基因ERG&酵母甲羟戊酸焦磷酸脱羧酵基因MVDI、大脑
杆菌IPP异构酵基因idi和大肠杆菌FPP合酶基因却一组
装在另一个质粒载体pMBI$中构成操纵子MBIS。将两质粒
同时转人大肠杆菌，结果8十基因在该工程苗中全部表达-
蝴●龇雌
万方数据
·1428· 中草焉 ChineseTraditionalndHerbalDrugs第拍卷第9期2007年9月
并大量富集了FPP。虽然由于FPP的过量富集导致大肠杆
菌停止生长．但该菌株为高效生产倍半萜类化合物提供了良
好物质基础。Zahiri等“13的研究就是一个典型的应用实例，
他们将根癌农杆菌聚十异戊烯焦礴酸台酶基因ddsA转入该
工程菌，辅酶QlO最高产量达2428Pg／g干细胞，其产量为
转野生大肠杆菌的6倍左右，且不需添加MVA而直接以葡
萄糖为原料。其研究还表明，MVA途径构建在两个操纵子中
鞍在一个操纵于中表达所积累的代谢目标产物水平要高“”。
Pitera等“”增强了pMevT的表达，但必须同时额外增加
tHMGR的表达量，以保证HMG辅酶A(HMG—CoA)能快速
转化为MVA，消除其对宿主细胞的毒害作用，结果进一步积
累了目标产物。
2．3青蒿紊生物合成相关基因的导人：2001年，Martin
等[|”将青蒿中ADS基因导人大肠杆菌，获得了紫穗槐一4，
11---．--烯，并消除了FPP对工程菌的毒害作用。但是，由于密
码子的偏爱性，青蒿中的ADS基因在大肠杆菌中表达非常
有限。为了提高植物ADS基因在大肠杆菌中的表达水平．
Martin及其合作者后来采用点突变的方法，对ADS基因密
码子进行了优化，结果紫穗槐一4，11-=烯产量提高了30～
100倍【|”。Picaud等“o深人研究了不同菌株、不同的诱导剂
以及诱导剂浓度对删基因表达的影响．结果发现3因素
对AnS的表达影响不大，但是在培养基中添加2．5mmol／L
甜菜碱和660mmol／L山梨醇后，虽然重组菌生长速度减慢
了，而诱导剂浓度对ADS基因表达量影响较大．通过改善诱
· 导荆的浓度，ADS的产量比对照提高了7倍。Newman等“”
对发酵工艺进行了优化，利用Martin构建的紫穗槐一4．11一=
烯工程菌t采用两相发酵法，使紫穗槐一4，11一=烯的产量达蓟
0．48g／L。
3酵母工程菌生产青蓠蠢
3．1青蒿素生物合成相关基因导人：酵母是单细胞真棱生
物，无论在蛋白质的翻译后加工、基因的表达调控迁是生理
生化上，都与植物十分相似，酵母表达系统是一种理想的植
物细胞基因表达体系。Lindahl等[．”分别利用质粒载体和整
合载体将青蒿紫穗槐一4．11一二烯台酶基因转人酵母中，通过
对转基因酵母的16d培养，均积累了紫穗槐一4。11一二烯产
物。其中，通过高拷贝酵母表达质粒pYeDP60获得的转ADS
基因酵母，紫穆槐一4，11一二烯产量选600飕／L}而通过同源
基因重组方式将ADS基因整合到酵母染色体的转基因组酵
母，积累了100腭／L紫穗槐一4，11一二烯。Ro等将青蒿ADS
基因亚克隆人pRS425质粒，转^酵母细胞中，在GALl启
动子的控制下得到了表达，合成了4．4mg／L的紫穆槐一4，
11一二烯。此后，他们又将细胞色素P450氧化还原酶基因
CPR通过由半乳糖启动子控制的质粒载体．转人转ADS基
因的酵母中．但未检测到青蒿酸产物，而将青蒿中1>450单氧
化基因CYP71AVl与CPR同时转人，在半乳糖的诱导下，
转基因酵母积累了青蒿酸。
3．2 MVA途径的分子调控：3一羟基一3一甲基戊二酰CoA还
原酶(HMGR)催化HMG-CoA形成MVAt由于MVA的形
成是一个不可逆过程，因此HMGR被认为是动物、植物、真
菌可能也是昆虫的类异戊二烯代榭途径的一个限速酶“”。酵
母菌中存在Hmglp和Hm92p两种同功HMGR，分别由
HMGRl和HMGR2基因编码，均台有一个催化结{暂域和一
个调控结构域。Donald等“”将去除调控区序列的H瞄R1
基目(f日枷R)导人酵母甚中，结果HMGR的表达量提高，
从而酵母中角鲨烯的水平提高了10倍o。Ro等用同样方法
使得工程酵母菌生产紫穗槐一4，11一二烯的能力提高了5倍。
角鲨烯台酶(ERG9)促进FPP向角鲨烯转变．不利于青蒿索
的台成。Ro等将外探ERG9基因克隆^蛋氨酸抑制性启动
子PMET3，与酵母中同稠基因重组，在蛋氨酸的存在下抑翩
了酵母中的ERG9的表达，从而使紫穗槐一4，11一二烯的积累
量提高了2倍。Davies等的研究发现UPC2是酵母细胞中一
个重要转录因子，调控固醇生物合成，经半域突变后UPC2
括性得以提高。Ro等通过过量表达半域突变等位基因upc2-
1，在一定程度上提高丁紫穗槐一4，11c二烯的产量；而过量表
达FPP台酶基因EGR20，对紫穗槐一4，11-二烯积累影响不
大。Ro等“”综合以上所有调控措施，结果紫穗槐一4，11-二烯
的产量达153mg／L．轻Martin等利用工程大肠杆菌生产紫
穗槐一4，11一二烯的产量提高了500倍。
3．3丙酮酸脱氢酶旁路(pyruvatedehydrogenasebypass)调
控：虽然通过对MVA生物合成途径的调控，有效提高了紫
穗槐一4，11一二烯的量，但MVA生物合成途径的起始物乙酰
辅酶A的供应不足是进一步提高产量的瓶颈。Boubekeur等
发现酵母中存在一／卜丙酮酸脱氢酶旁路，该途径通过丙酮酸
脱教酶、细胞质乙醛脱氢酶和乙酰辅酵A合成酶的共同作
用，将丙酮酸转变成乙酰辅酶A。由于乙酰辅酶A不能从线
粒体转到细胞质中，因此该途径是酵母细胞质合成乙酰辅酶
A的主要途径，对该途径中关键基因的调控是调节酵母细胞
质中己酰辅酶A水平的重要手段。Shiba等[‘”分别利用高拷
贝质粒载体和整合载体，将酵母细胞中的丙酮酸脱氢酶基因
ALD6过量表达，结果该酶的活性分别提高了19倍和4．6
倍，但是紫穗槐一4．11一二烯的量却反而下降了。对酵母乙酰
辅酶A台酶基因ACSI过表达的研究表明．乙酰辅酶A台
酶的活性提高了2倍左右，并且紫穗槐一4，11一=烯的量提高
了8％～23蹦。乙酰辅酶A舍酶存在一个乙酰基化位点，其
活性受乙酰基化和去酰基化调控。Starari等o”对沙门氏杆
菌乙酰辅酶A合酶调控进行了深人的研究，结果发现，乙酰
基转移酶对乙酰辅酶A合成酶609位点的赖氪酸乙酰基化，
则乙酰辅酶A合酶失插，NADP依赖性Sir2蛋白催化乙酰
辅酵A舍酶脱去乙酰基，从而使其恢复酶活性。在后续的研
究中，将乙酰辅酶A台成酶641位的脯氨酸替换为亮氨酸，
可阻止乙酰辅酶A合酶的乙酰基化反应，使细胞能一直维持
其酶活性。由于沙门氏杆菌乙酰辅酶A台酶乙酰基化位点与
酵母菌具有高度保守性，因此酵母乙酰辅酶A台酶存在与抄
门氏杆菌相似的翻译后调控机制。基于此，Shiba等“”通过
高拷贝质粒载体将沙门氏杆菌乙酰辅酶A合成酶去乙酰基
化位点基因L641P与ALD6基因转入Ro等构建的产紫穗
万方数据
中革番ChineseTraditionalandHerbDrugs第鹅卷第9期2007年9月·1429-
槐w411二烯工程酵母中。结果紫穗槐一4，11一二烯的量提高
了1．9倍。
4向置与晨盟
青蒿素作为治疗疟疾的特效药。在国际市场上供不应
求。自从青蒿紊被发现以来．科学家们便通过各种手段试图
提高青蒿素的产量，但未能取得突破性进展。近年来，随着组
合生物合成技术的迅速发展，为低成本获取青蒿素开辟了一
条新途径，并已表现出非常诱人的前景，但要真正实现工业
化生产，还有很多路要走。
首先，要尽快阐明青蒿素的完全生物合成途径。虽然利
用工程微生物生产青蒿紊取得了重大的进展，但目前还只能
生产青蒿酸，由青蒿酸到青蒿素的转化还未能在微生物体内
完成“”。其主要原因是青蒿索的生物合成途径还未完全阐
明。目前，青蔫酸和二氲青蒿酸的生物合成途径已完全了解，
从二氢青蒿酸到青蒿素的途径与机制也在近年被揭示。但
是，从青蒿酸到青蒿素的转化途径目前还设明确。目前主要
有两个假说，其一是认为青蒿酸首先转化为二氢青蒿酸，然
后再经过二氢青蒿酸的途径，但近年的研究结果并不支持这
种假说，其二，是认为青蒿酸有一条独立于二青蔼酸的转化
选径，虽然该途径还未完全弄清楚，但已有更多的研究支持
这种说法．并且目前的研究结果显示，该途径可能是青蒿裹
在青蒿体内的主要生物台成途径，与二青蒿酸白发氧化途径
不同，至少有两种酶参与。因此，综合现代分离纯化技术、现
代仪器分析检测技术和同位索标记等技术，迸一步深人探讨
青蒿紊的生物合成途径是非常必要的。
其次．克隆青蒿紊生物合成相关的新基因。从青蒿素组
台生物台成研究的发展历程可以看出，从ADS基因的发现
到成功实现利用微生物高效生产青蒿素第一个特异前体紫
穗槐一4，11‘二烯，中同只用了2年多的时间t而细胞色素
P450单氧化酶基因的克隆与青蒿酸的酵母工程茵的生产几
乎在同一年内完成。因此，可以说青蒿素生物合成相关基因
不但是在微生物中构建完整的青蒿索合成途径所必不可少
的元件，也是推进该研究领域划时代发展的重要园索。青篙
酸的生物合成相关基因均已克隆．虽然有一些研究者已经分
离或部分分离了参与青蒿酸向青蒿襄转化的相关蛋白酶，但
还未见相关蛋白序列分析的报道，更无相关基因的克隆与功
能研究。由此可见，青蒿素生物台成新基因分离也是该研究
领域必需尽快解决的问题。
再次，组合生物合成相关基础研究还需加强。组合生物
合成已成为生产具有重要药理活性物质研究领域中的热点
和重点研究方向，并日益表现出了它的优越性。另一方面，组
合生物合成的有效运用也依赖于快速方便的基因操作技术
的发展。将庞大的生物合成基因族在异源体系中成功表达的
同时，也表现出各种同题。其中最突出的问题是当外源基因
或途径导人后，宿主细胞内部严格舶基因调控系统被破坏，
导致基因表选和酶活性失去平衡。同样，过量表达微生物单
十基因也会导致宿主细胞前体物质或其生长、繁殖所需的能
量过度消耗。日，或者对过量的外豫蛋白产生抗逆反应。酶蛋
白总活性的失衡会严重影响细胞代谢的正常磷代谢漉，在细
胞内积累一些对细胞毒害作用的中同体或剐产物，从而降低
微生物的繁殖速度和产率，因此，如何开发新的高教宿主一载
体系统，如何有效平衡外源生物合成途径，仍然是该领域的
研究重点。
此外．发酵工艺的改息与创新对实现组合生物合成青蒿
紊工业化生产具有重要意义。利用代谢工程改造的微生物合
成青蒿寨，还处在实验童水平。目前还未实现工业化生产。应
用现代发酵工程技术。建立高教的菌株发酵和产品纯化回收
工艺，是实现青蒿索工程微生物规模化生产的必由途径。因
此，发酵工艺的改良与创新也是今后一个重要的研究方向。
总之，虽然目前还没有构建青蒿索的完全生物合成途
径，但有理由相信，在不久豹将来，利用廉价易得的碳源为底
物的微生物生物合成法将成为制备青蒿素的主要方法。
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超临界CO：萃取工艺集成与中药提取分离现代化
雷华平1，葛发欢2，r晓英1
(1．吉首大学湖南省林产化工工程重点实验室，朝南张家界427000}2．中药提取分离过程
现代化国家工程研究中心。广东广州510240)、
摘要。分析了超临界CO：萃取技术应用千中药提取分离的优势和局限性。结合实例阐述了超临界COz萃取技术
与其他提取分离技术工艺集成用于中药提取分离的可行性和优越性。研究认为发展该工艺集成技术对宴现中药现
代化有重要意义。
关键词t超{I缶界CO。萃取；工艺集戚；中药
中圈分类号：R284．2 文赫标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)09—1431—03
ProcessintegrationofsupereriticalC02extractionformodernizationofextraction
andseparationofChinesemateriamedica
LEIHua—pin91，GEFa-huan2，BUXiao—yin91
(1．KeyLaboratoryofHunanForestProductandChemicalIndustryEngineering，JishouUniversity，Zhangjiajie
427000．Chinal2．NationalE gineeringCenterforModernizationofExtractionandSeparation
ProcessingofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510240，China)
Keywords：supercritiealC02extr ction，processintegration；Chinesemateriamedica
十多年来，国内超临界co。萃取应用于中药提取分离
走过了一条较为漫长的路，从最初的疑虑，到逐渐成为研究
的热点，到现在其已成为中药现代化的关键技术之一。至今
大量研究表明超临界CO。萃取技术应用于中药开发是可行
的，并且显示了其独特的优越性。与传统的中药提取方法相
比，超临界CO。萃取具有很多优点，但超临界CO：萃取也有
某些局限性。本文结合中药提取分离过程现代化国家工程研
究中心建设与发展过程中应用超临界co：萃取技术的实
践．阐述如何将超临界COt萃取与其他提取分离技术集成·
发挥它们工艺集成的优势．实现中药提取分离的现代化。
1超临界CO：革职是一种优越的提取分离技术
超临界CO：萃取作为一种单元技术，兼有高产率和高
效率的特性。该技术萃取中药，提取率高，有效成分不被破
坏；并且最大限度地获取有用成分的同时，能选择性地萃取
与分离。通过优选萃取压力等条件可以将需要的某一类成分
选择性地萃取出来．也可以通过优化分离条件选择性地将目
标成分与杂质进行初步分离，从而富集目标成分。超临界
CO：萃取技术从整体上看是一种单元技术，某种程度上，它
又是一种集成技术，它集提取分离浓缩为一体．在萃取的同
时就进行革取物的分离与浓缩。对于添加央带剂的萃取．也
可通过多级分离将大部分夹带剂从萃取掖中分离出来。
超临界COz萃取中药，与传统方法相比，具有提取率
高，操作温度低、中药有效成分不被破坏、无有机溶剂残留和
工艺简单等优点“。】。该技术对中药挥发油、脂肪油、香豆素、
萜类、生物碱和醌类等有效成分的提取分离。基本可以独立
完成，具有其他技术无可比拟的优越性。如利用超临界∞：
技术从黄花蒿中萃取青蒿衰．青蒿紊是一种倍半藉，由于其
分子中古有一个过氧基圃，对湿热不稳定，用有机藩剂提取
易被破坏分解；而用超f临界COz提取，提取率可达92％以
上。收率提高了1．9倍m“。笔者用超临界C02萃取技术制
备鸦胆于油，发现该技术具有萃取收率高、产品品质好、工艺
简单和生产周期短等优点．可利用脂肪酸、油中聚合物与甘
油酯沸点的不同，完成脱脏过程，并可起到脱酸、脱臭、脱色
教果，大大简化后续工艺⋯。
收藕B期；2006·11—17
荐喜蔷异：誓辜草嚣蓦荽考焉只茹南6F郴J30州0人9)，讲师，硪士，主要从事超驻界c0：葶取技术与中草药提取分离现代化研究．
Tel：(0744)B231386E—mail：audenlei@163．tom
万方数据
青蒿素组合生物合成的研究进展
作者： 刘硕谦， 田娜， 李娟， 刘仲华， 黄建安， LIU Shuo-qian， TIAN Na， LI Juan，
LIU Zhong-hua， HUANG Jian-an
作者单位： 刘硕谦,李娟,黄建安,LIU Shuo-qian,LI Juan,HUANG Jian-an(湖南农业大学,湖南省天然产
物工程技术研究中心,湖南,长沙,410128)， 田娜,TIAN Na(湖南农业大学园艺园林学院,湖
南,长沙,410128)， 刘仲华,LIU Zhong-hua(湖南农业大学,湖南省天然产物工程技术研究中
心,湖南,长沙,410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南,长沙,410128)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
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