全 文 ：中草焉ChineseTraditionalandHedⅪdDrugs第38卷第10期2007年10月
改进Propy法测定柠檬醛损伤黄曲霉质膜中
共轭双烯和丙二醛及作用机制研究
罗曼1，蒋立科2
(1．暨南大学生命科学学院生物医学工程系，广东广州510632}2．安徽农业大学生命科学学院．安徽合肥230036)
柠檬醛是从山鸡椒Linderacubeba(Lour．)
Pers．中蒸馏得到的香精油单体，具有强烈抑制致
肝癌的黄曲霉生长的特性，作用于黄曲霉孢子和菌
丝体缅胞后，能够抑制黄曲霉生长，破坏质膜，改变
质膜的选择性通透性，使原生质渗出[1“]。不饱和脂
肪酸过氧化产生ESR(electronspinresonance)信
号，并能产生对DNA的损伤，而饱和脂肪酸则无此
信号“]。但这些现象只能说明柠檬醛对膜损伤的直
接原因，若要了解内在根源首先必须通过对膜的脂
质过氧化的一级产物共轭双烯测定后，方可确定柠
檬醛是否诱发自由基而破坏膜。本实验通过改进
Propy法测定构成质膜不饱和脂质成分的共轭双烯
和丙二醛变化，阐明柠檬醛损伤质膜的机制，为绿色
香料在粮油饲料、水产品等防菌保鲜及临床皮肤疾
病、白血病等疾病防治上提供参考。
1材料与方法
以黄曲霉Aspergillusf[avlus为实验菌株；将
从山鸡椒蒸馏出的香精油经精馏获得含96．7％柠
檬醛的精油进行抑菌实验；Brurer型波谱仪，
OFT一2型荧光光度计，显微多维分光光度系统装
置，Philps电子显微镜。
Z方法
2．1共轭双烯的测定“’5]：培养黄曲霉并收集孢子
1．0g，然后将收集的黄曲霉孢子分别以梯度浓度柠
檬醛(用含1％异丁醇的pH7．2PBS缓冲液配制成
柠檬醛质量浓度为0．5、1．0、1．5、2．0mg／mL)对所
收集的孢子进行毒化，3h后3000r／rain离心10
rain，收集孢子，毒化后的每种孢子样品均分成两
份；一份留作测定共轭双烯，另一份留作测定丙二
醛。将毒化后的黄曲霉孢子用液态氮破碎，并用5
mLPBS缓冲液分二次转移至试管中，加人5mL
0．5％PBS摇匀，测定共轭双烯的量。
2．2丙二醛的测定：将收集的孢子破碎，制备提取
液，加5mL0．5％TBA，按照试剂盒规定的方法测
定MDA；同时对样品进行固定、制片、电镜观察。
2．3数据处理：所测定结果用z士X表示，最后进
行方差分析。
2．4膜损伤的测定“]：采用细胞波动分解模型法在
多维显微、分光光度系统上测定。
3结果与讨论
3．1黄曲霉孢子中共轭双烯的测定结果：黄曲霉孢
子经不同质量浓度柠檬醛毒化后．双轭双烯的量的
测定结果见表1。结果表明，与对照组相比，不同质
量浓度的柠檬醛在同一时间毒化，黄曲霉孢子内共
轭双烯的量均有变化，并与柠檬醛的质量浓度呈对
应关系，即柠檬醛毒化质量浓度越高，共轭双烯的量
越高。说明这种损伤所引起脂质过氧化物增多，若不
及时进行消除，即殃及孢子内大分子拥挤环境的改
变，导致膜的损伤，如细胞壁破裂、成片脱落、结构疏
松(图1、2)和线粒体的增生融合(图3)。
裹1柠檬醛损伤黄曲霉孢子内的共轭双烯
Table1 ConjugateddienesA．flal|,usspores
damagedbydifferentco sistencecltral
分组 共轭双烯／(pg·mL-1)分组 共轭双烯／(旭·mL一1)
0．0 0．5SO士0．007 1．5 6．590土00 2-
O．5 O．S59土0013。 2．0 0 617±0．013。
1．0 6．572士0．016’
与对用组比较：·尸<0．01
*P
Fig1 EffectsofcltralOBsurfacestructure
ofA．flavlussporesundermicroscope
3．2黄曲霉孢子中MDA的测定：通过柠檬醛毒化
@基I盒项目期目：：2国oo家6发12改2委]、农业部中试项目(农计函[2004]514)
作者简介：罗曼，教授，博士，硬士生导师．研究方商为生豹物理化学。Telt(020)85220469E硼i【Itxionglu@inu，edu。cn
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第10期2007年10月
囤2透射电镶下柠檬醛对黄曲醛孢子超搬结构影响
Fig．2UltrastrttclnreofA．一0Vf#$sporesund rTEM
甩3扫描电镜下拧檬醛引起黄曲霉组胞线粒体增生
Fig．3MitochondriahyperplasieofA．月口ws
inducedbycitralunderTEM
后，在孢于内产生脂质过氧化物MDA，再经与硫代
巴比妥反应，生成红色物质。经测定试验组的MDA
的量均比对照组要高(表2)，但是试验组胞外液
MDA的量要比胞内液高出几倍到几十倍，这可能
与质膜上无自由基清除系统有关。与对照组相比，试
验组脂质过氧化自由基产生量明显增高。清楚地表
明了柠檬醛不仅在损伤细胞质膜的跨膜渗入过程中
引发了自由基的产生(即不饱和脂肪酸发生过氧化
并进入细胞)，然后通过多种途径进一步导致新自由
基的产生及由之而诱发自由基级联放大效应。与此
同时也表明试验组细胞膜损伤的分子机制，是自由
基诱发的膜脂质过氧化加剧及线粒体因存在自由基
清除系统及因该系统抵御柠檬醛的侵入而增生、融
合增强了对自由基清除能力，从而减少胞内自由基
量。从另一方面看，MDA的增加，反映柠檬醛通过
对筷上不饱和脂肪酸的作用，诱茇膜脂不饱和脂肪
酸产生自由基，不仅损伤膜的结构，改变膜的流动
性．而且进入原生质中，引发了胞内与对照组所不同
的其他一系列效应。这种效应如线粒体的清除自由
基能力的减弱，丽所减弱的程度与柠檬醛剂量相关。
一旦线粒体对自由基清除能力完全丧失，则该孢子
或细胞即死亡。因此，认为柠檬醛是产生脂质过氧化
的引发物，很可能与该醛上的反式一CHO相关。
3．3弹性膜量发生不可逆增加：弹性膜量表示膜在
吸收物质时收缩与伸展的能力。在外界因素影响下，
膜量越大表明收缩性与伸展性之问可恢复能力减
小，意味着机械强度增大，吸收转运能力减弱，反之
下降。膜弹性膜量测定表明实验组与对照组相比，弯
曲膜量和剪切膜量分别呈不可逆性提高2000倍和
160倍。从本实验结果进一步所提示抑菌药物对病
原体质膜上不饱和脂肪酸的作用是首选的目标之
一，或者是靶部位，也提示临床药物的设计，首先考
虑的是当药物与细胞作用时，能否对细胞质膜产生
作用，如果无任何作用则可通过对使用药物引人能
产生过氧化的基团(如一H。c—C=O)，使其是否引发
一系列的连锁反应，若能使细胞质膜的物理属性发
生不可逆的转变，继之失去选择性通透性，从而改变
胞内大分子拥挤环境，则该抗菌药物有效。
寰2黄曲霉受柠檬醛毒化后细胞内外MDA■的变化
Table2 MDAQualitychangeofinternalandexternalcel
bycitralcontamination
柠穰醛／(mg·Lr1)
MDA／(vg·mL一1)
细胞外蒗 细胞内液
综上所述，柠檬醛对黄曲霉孢子萌发，生长的抑
制作用是在于该醛诱发了黄曲霉孢子质膜的脂蛋白
上不饱和脂肪酸过氧化，从而使共轭取键发生重新
排列而形成脂质过氧化物的一级产物，释放出ESR
信号。最终产生诸如小分子的产物丙二醛，该类小分
子化合物进入细胞原生质中，能引起细胞多种生理
功能的改变，近年通过慧星电泳”]，定量地研究了该
醛对DNA的损伤，其机制很可能是柠檬醛引起膜
上不饱和脂肪的邻近共轭双烯链(亚甲基)形成过氧
自由基之故，从而通过改变膜的板状流动性而导致
膜的选择性渗透性的丧失或减弱，干扰了正常的新
陈代谢，影响孢子的萌发和菌丝体的生长。
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万方数据
改进Propy法测定柠檬醛损伤黄曲霉质膜中共轭双烯和丙二醛
及作用机制研究
作者： 罗曼， 蒋立科
作者单位： 罗曼(暨南大学生命科学学院,生物医学工程系,广东,广州,510632)， 蒋立科(安徽农业大学
生命科学学院,安徽,合肥,230036)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(10)
被引用次数： 2次
参考文献(7条)
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引证文献(2条)
1.程婵娟.韦伟.胡尚勤 柠檬醛对绳状青霉抑制作用研究[期刊论文]-东北农业大学学报 2010(3)
2.罗曼.郭高峰.柯迪.韩中平.周正红 新型仓贮超声雾化熏蒸装置的研制[期刊论文]-氨基酸和生物资源 2012(3)
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