全 文 ：·588· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
药材与资源
植物表达载体在三分三发根中的高效表达
潘夕春1，陈敏1，张磊2，廖志华r，张明生3
(1．西南大学生命科学学院三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆400715；2．第二军医大学药学院
生药学教研室，上海200433；3．贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025)
摘 要：目的 建立基于发根培养的三分三Anisodusacutangulus遗传转化体系及在三分三发根中表达外源基因
的方法。方法 由种子直接萌发得到无菌苗，建立了三分三的无菌苗培养系统。将植物高效表达载体
pCAMBIAl304+导入经过“disarmed”改造的根癌农杆菌C58C1(携带pRiA4质粒)，获得了携带外源基因表达载
体的重组C58C1工程菌。取生长良好的幼嫩真叶作为外植体，在乙酰丁香酮的诱导下用重组C58C1进行感染，诱
导发根。选取在无激素培养基上生长迅速，分支多的发根单克隆进行继代培养。经过3次继代培养，PCR
(polymerasech inr action，聚合酶链式反应)检测用于验证发根型质粒pRiA4和表达型质粒pCAMBIAl304+是
否整合到三分三发根基因组内。结果建立了基于发根培养的三分三遗传转化体系，发根诱导频率达到100％，
PCR检测表明pRiA4和pCAMBIAl304+质粒共转化率达到32％。结论该方法可以用于在三分三发根中高效表
达外源基因，为实现基于发根的三分三产托品烷类生物碱的代谢工程奠定了基础。
关键词：三分三；发根；共转化
中图分类号：R282．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)04—0588—04
EfficientexpressionofplantexpressingvectorinAnisodusacutangulushairyoots
PANXi—chunl，CHENMinl，ZHANGLeiZ，LIAOZhi—hual，ZHANGMing—shen93
(1．KeyLaboratoryofEco—environmentsi ThreeGorgesR ervoirRegion，MinistryofEducation，SchoolofLifeSciences，
SouthwestUniversity，Chongqing400715，China；2．DepartmentofPh macognosy，SchoolofPharmacy，
SecondaryMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433，China；3．SchoolofLifeSciences，
GuizhouUniversity，Guiyang550025，China)
Abstract：ObjectiveToestablishthegeneticransformationsystemofAnisodusacutangulusbased
onhairyootculturesandthemethodofexpressingexo enousgenesinA．acutangulushairyoots．
M：ethodsThebacteria—freeseedlingsofA．acutanguluswereobtainedfromthesterilizedse sthatwere
usedforgeneticransformation．Thed sarmedAgrobacteriumumefaciensstrainC58C1harboringthe
plasmidpRiA4wasengineeredbyintroducingtheplantexpressingvectorpCAMBIAl304+．Theyoung
leavesofA．acutanguluswereinfectedwiththengineeredC58C1inthetreatmentofASoinducethe
hairyoots．Theindependentlytransformedhairyootswhichwell—grownonhormone—freemediumwere
subculturedforthreetimestoerasebacteria．Then，genomicPCRwasappliedtodetectingwhetherpRiA4
andpCAMBIAl304+hadintegrateintohostgenomeofA．acutangulus．hairyroots．ResultsThegenetic
transformationsystemofA．acutanguluswasestablished，thehairyootswereinducedfromthewounded
sitesatthefrequencyof100％．Bothofthetwoplasmidsweresimultaneouslydetectedin32％(co-
transformationfrequencyofpRiA4andpCAMBIAl304+inhairyoots)hairyrootclones．Conclusion
TheresultsdemonstratehatexogenousgenescanbeexpressedinhairyootsofA．acutangulusata
relativelyhighfrequencybythemethodinthepresentstudy．Andthisisafundamentalworkformetabolic
engineeringt opanelkaloidsinhairyootsofA．acutangulus．
Keywords：AnisodusacutangulusC．Y．WuetC．Chen；hairyroots；CO—transformation
三分三AnisodusacutangulusC．Y．WuetC． Chen是茄科(Solanaceae)一种重要的珍稀药用植
收稿日期：2006—09—10
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30500303)。
作者简介：潘夕春(1982一)，男，硕士研究生，从事植物分子遗传学与代谢工程研究。
Tel：(023)68367146Fal：(023)68367146E—mail：xcpan@SWU．edu．cn
*通讯作者廖志华Tel：(023)68367146Fax：(023)68367146E—mail：zhliao@SWU．edu．ca
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·589·
物，其根中含有多种托品烷类生物碱[1]。其中莨菪
碱、东莨菪碱是重要的反副交感神经作用类药物，临
床上主要用作镇静剂口]，需求量不断增加。由于三分
三产地仅限于云南，是一种高海拔植物，野生资源本
来就十分稀少；近年来由于人为的滥收，导致三分三
野生资源遭到严重破坏。利用植物基因工程技术获
取高产托品烷类生物碱的三分三转基因植株，是解
决以上问题的有效途径，而首要条件是建立高效的
三分三外源基因表达系统。基于发根农杆菌的遗传
转化技术是植物基因工程中最成功的转基因方法之
一，但目前的报道多停留在利用野生型发根生产次
生代谢产物的水平上，外源基因转化的报道并不多
见。本研究通过发根农杆菌介导的遗传转化技术，将
植物高效表达载体pCAMBIAl304+与发根型质粒
pRiA4共转化到三分三组织中，建立了在三分三发
根中表达外源基因的方法，为获得三分三转基因发
根和开展基于发根的托品烷类生物碱的代谢工程奠
定了基础。
1材料与方法
1．1材料及试剂：三分三种子由贵州大学生命科学
学院张明生博士提供；Disarmed根癌农杆菌菌株
C58C1，质粒pCAMBIAl304+由本实验室保存，MS
(Murashige—Skoog)培养基、乙酰丁香酮(acetosy—
ringone，AS)(Sigma，美国)；卡那霉素(Kana—
mycin，Kan)、头孢霉素(Cefotaxime，Cef)、利福霉
素(Riferpin，RiD(北京鼎国)；Taq酶及配套PCR
试剂(上海生工)；核酸分子量标准DL2000(北京
天为时代)；荧光染料Goldview，rolB、rolC、潮霉素
基因序列特异性引物(上海赛百盛)。
1．2方法
1．2．1三分三无菌苗系统的建立：用水选法挑选饱
满的种子，40℃温水中浸泡24h，然后在流水中冲
洗2h；无菌条件下用70％酒精表面消毒2min，
0．1％HgCl。消毒10min，无菌水冲洗8次；用无菌
吸水纸吸干表面水分后，接种在MS[33固体培养基
上(pH5．8，8g／L琼脂粉作凝固剂)，置于温度为
(25±1．O)℃的恒温培养箱中暗培养；约两周后，
种子开始萌发，萌发的种子移入温度为(25±1．o)
℃、光周期为12h、光强为55／lmol／m2·S的恒温
培养箱中继续培养。苗龄约4～5周的幼嫩真叶可
用于遗传转化。
1．2．2 pCAMBIAl304+的构建及导人农杆菌
C58C1：pCAMBIAl304+由廖志华教授构建[4]，其示
意图见图1。用构建好的pCAMBIAl304+转化空
C58C1的感受态细胞，在转化平板上挑取单菌落进
行PCR验证，即获得携带pCAMBIAl304+的重组
C58C1工程菌。
1．2．3重组C58C1的活化：从一70℃超低温冰
CaMV35S表示CaMV35S启动子，NosT表示Nos终止子，RB和LB分别表示T—DNA的右边界和左边界
CaMV35SdenotesCaMV35Spromoter，NosTden tesNoterminator，RBandLBdenoterightborderandleftborderofT—DNA
图1 pCAMBIAl304+质粒示意图
Fig．1SketchmapofpCAMBIAl304+．
箱中取保存的重组C58C1，接种到YEB液体培养
基+Kan50mg／L+Rif40mg／L中，200r／min，
28。c下快速振荡培养，连续活化2次；第2次活化
至菌液A。。。一0．3左右，加入AS至终浓度为100
p-mo|／L，继续振荡培养至A。。。=0．5左右；室温下
4000r／min离心10min，弃上清液；沉淀下来的菌
体用等体积未加抗生素的MS液体培养基悬浮，加
入AS至终浓度为100ttmol／L，相同条件下振荡培
养，继续活化30min，可用于转化。
1．2．4发根农杆菌介导的三分三遗传转化体系的
建立：取苗龄约4～5周的无菌幼嫩真叶，剪成约2
cm2见方的叶片；将叶片放入已活化好的菌液中，浸
泡3～5min后吸干多余菌液；将浸泡过的叶片接种
在MS固体培养基+AS100btmol／L上，置于温度
为(25--4_-_1-o)℃的恒温暗培养箱中，使发根农杆菌
和外植体共培养48h；共培养结束后，将外植体接
种到MS+Cef500mg／L的固体除菌培养基上，置
于温度为(25--4-_1．o)℃的恒温培养箱中暗培养。
1．2．5三分三发根的继代培养：共培养结束约一周
后，从叶片伤口边缘长出发根。发根长约5cm时剪
下，接种到MS+Cef500mg／L固体除菌培养基上
培养3周；挑选生长迅速，分支多的发根，每4周继
代一次；继代3次后，转到不含抗生素的MS固体培
养基上继续培养。在无抗生素MS培养基上不长出
万方数据
·590· 中草菊ChineseTrbditionaiandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月
农杆菌的发根系可用于PCR检测。
1．2．6三分三发根的PCR检测：上述在无抗生素
MS培养基上不长出农杆菌的发根系均用于PCR
检测。按照SDS法Is]抽提发根基因组DNA，检测合
格后用于PCR检测。rolB基因片段(423bp)的正
向引物为frolB：5，-GCTCTTGCAGTGCTAG—
ATTT一3’，反向引物为rolB：5-GAAGGTG—
CAAGCTACCTCTC一37；rolC基因片段(626bp)
的正向引物为frolC：5-CTCCTGACATCA—
AACTCGTC一37，反向引物为rrolC：5-TGCTTC—
GAGTTATGGGTACA一3’[60；潮霉素基因片段
(812bp)根据潮霉素基因序列设计，正向引物为
fhygr：5’一CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC一
3’，反向引物为rhygr：5-CGATGTAGGAGG—
GCGTGGATATG-37。PCR的反应体系均为100
ngDNA模板，5弘L10×PCR反应缓冲液，3pL25
mmol／L的MgCl2，200ttmol／LdNTPs，2．5单位的
TaqDNA聚合酶和10mmol／L的引物各1肛L，最
后用灭菌双蒸水补至总体系为50肛L。rolB和rolC
基因的PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后
开始34个循环包括94℃变性40S，55℃退火40
S，72℃反应1min，最后于72℃延伸8min；潮霉
素基因的PCR反应条件为94℃预变性5rain，然
后开始35个循环包括94℃变性45S， 5℃退火
45S，72℃反应1min，最后于72℃延伸8min。
PCR检测时均采用普通三分三DNA作为阴性对
照，重组C58C1工程菌DNA作为阳性对照。PCR
扩增产物采用0．8％琼脂糖凝胶(GoldView染
色)进行电泳检测(120V，100mA，25min)，DNA
相对分子质量标准为DL2000。电泳结束后在凝胶
成像系统(Bio—RAD)下观察分析(UV，260nm)
并拍照。
2结果与讨论
2．1 三分三无菌苗系统的建立：三分三种子较小，
外种皮较厚且木质化严重，其种子多为半饱满种子，
导致其萌发率只有10％左右。采用水选法净选后，
选取饱满的种子用于实验，萌发率提高到20％以
上。萌发后的种子在温度为(25±1．0)℃，光周期
为12h，光强为55／lmol／m2·S的恒温培养箱中生
长良好。
2．2发根农杆菌介导的三分三遗传转化体系的建
立：农杆菌介导的遗传转化是外源DNA进入植物
细胞最成功和应用最广泛的方法之一日]。本实验采
用的C58C1本来是根癌农杆菌，经“Disarmed”改造
后，保留Helper质粒，导人pRiA4质粒，改造后的
C58C1失去使植物长冠瘿组织的能力，转而使植物
长出发根[8]。在预实验中，三分三的下胚轴可以在无
激素MS培养基上再生出真根。为了避免下胚轴长
出真根而造成的实验统计误差，本实验只采用叶片
作为外植体。活化后的C58C1对三分三叶片的感染
效率非常高，所有被感染的叶片均从有伤口的部位
长出毛状根，诱导频率达到100％。被感染的叶片，
发根诱导频度(每个外植体长出的发根平均条数)
达到23．5。从图2可以看到，经过诱导后，所有发根
均从叶片上有伤口的部位长出；完好无损的部位则
不能受到发根农杆菌的感染。该现象与之前Staehel
等【9]的报道一致。 ．
2．3三分三发根的继代培养：在除菌培养基上继代
培养的发根经过3次继代后，农杆菌已基本除尽，转
到无抗生素的MS固体培养基上继续培养。4周后，
获得25个除菌彻底的发根单克隆系。从图3可以看
出三分三发根具有斜向生长，分支多，无向地性，在
无激素培养基上生长十分迅速等特点，与Giri等[7]
报道的典型发根的生物学形态一致。
图2从叶片伤口处诱导出的发根
Fig．2Hairyootsinducedfromwoundedsitesofleaf
图3三分三发根单克陉
Fig．3MonoelonalhairyootofA．acutangulus
2．4 三分三发根的PCR检测与共转化发根的分
析：发根农杆菌的T—DNA插入植物基因组时，携带
的rol家族特定发根基因(因不同菌株而异)随T—
DNA插入基因组，从宿主细胞上诱导出发根。所以
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第4期2007年4月·591·
只要检测到上述rol家族的特定基因，就可以确定
被检测的单克隆系是真正的发根[1州。本实验选取
C58C1中pRiA4质粒携带的rolB和rolC两个基
因作为检测对象。在检测到rolB和rolC基因的单
克隆中，再检测pCAMBIAl304+质粒上携带的潮
霉素(hygromycin)抗性基因，就可以确认出转入
了pCAMBIAt304+的发根单克隆，进而确认出
pRiA4和pCAMBIAl304+共转化的毛状根。
为避免因除菌不彻底造成PCR结果的误差，
本实验用于检测的25个发根单克隆均已彻底除
菌。全部25个发根单克隆均检测到rolB和rolC基
因片段(图4)。在这25个检测到rolB和rolC基因
片段的发根单克隆中，检测到8个含有潮霉素基因
片段(图5)。结果表明pCAMBIAl304+与pRiA4
对三分三叶片的共转化率达到32％。
M一核酸相对分子质型标准DL2000+一作为阳性对照的
重组C58CI一一作为阴性对照的三分三普通根
T1～T3一不同的发根单克隆rolB／rolC—rolB和rolC基因
M—DL2000Marker+一positivecontrolofC58C1
transformedwithpCAMBIAl304+一一negativecontrol
ofnormalrootsT1一T3一differentmonoclonal
hairyootsrolB／rolC-rolBand Cgenes
图4三分三发根rolB和rolC基因的PCR检测
Fig．4PCRAnalysisofrolBandrolCgenes
inA．acutangulushairyoots
本实验采用共转化策略建立了基于三分三发根
的外源基因表达系统，其外源基因表达载体
pCAMBIAl304+在三分三发根中的转化率达到
32％，该载体可用于在三分三发根中同时表达多个
目的基因。该方法的建立为实现三分三及同类药源
植物产托品烷类生物碱的代谢工程，开发高产托品
烷类生物碱的发根型生物反应器提供了一种高效的
外源基因表达方法。
M一核酸相对分子质量标准DL2000+一作为阳性对照的
重组C58CI一一作为阴性对照的三分三普通根
T1～T3一不同的发根单克隆Hygr-潮霉素基因
M—DL2000Marker+一positivecontrolofC58C1
transformedwithpCAMBIAl304+一一negativeco trol
ofnormalrootsT1一T3一differentmonoclonal
hairyootsHygr—hygromycingenes
图5三分三发根潮霉素基因的PCR检测
Fig．5PCRAnalysisofhygromyeingene
inA．acutangulushairyoots
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万方数据
植物表达载体在三分三发根中的高效表达
作者： 潘夕春， 陈敏， 张磊， 廖志华， 张明生， PAN Xi-chun， CHEN Min， ZHANG Lei，
LIAO Zhi-hua， ZHANG Ming-sheng
作者单位： 潘夕春,陈敏,廖志华,PAN Xi-chun,CHEN Min,LIAO Zhi-hua(西南大学生命科学学院,三峡库
区生态环境教育部重点实验室,重庆,400715)， 张磊,ZHANG Lei(第二军医大学药学院生药
学教研室,上海 200433)， 张明生,ZHANG Ming-sheng(贵州大学生命科学学院,贵州 贵阳
550025)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(4)
被引用次数： 4次

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