全 文 :中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·77·
越少,说明在没有外源性脂质提供的条件下,细胞内
源性胆固醇合成受抑制。本实验结果显示,丹参提取
物能明显抑制内源性胆固醇合成,这可能是其调血
脂的作用机制之一。
降低血浆中的胆固醇,一方面可以通过减少胆
固醇的合成,另一方面也可以促进胆固醇转化为胆
汁酸。胆汁酸是胆固醇主要的代谢去路,胆固醇与胆
汁酸形成的乳糜微团又是其排出的主要方式,正常
人每天合成胆固醇的总量40%左右在肝内转化为
胆汁酸。在这一酶促过程中,胆固醇7a一羟化酶
(CYP7A)是其限速酶。
CYP7A属于细胞色素P450酶系,存在于细胞
内质网膜上,参与内源性化合物的氧化代谢。主要受
氧化类固醇和胆汁酸的调控,从而诱导或抑制其表
达,调控机制发生在CYP7A的转录水平,主要涉及
到一些核受体,如肝X受体[-liverXreceptor,LXR
(alpha)]和类法尼酯受体(farnesoidXrec pt r,
FXR)等,CYP7A在维持胆固醇代谢内环境中发挥
着重要作用[7”]。本实验结果显示,丹参提取物对增
加CYP7AmRNA的表达有明显作用,提示通过增
加CYP7AmRNA的表达,促进胆固醇转化为胆汁
酸,从而降低血浆中的胆固醇,这可能也是其调血脂
机制之一。
消瘀片具有良好的调血脂作用,尤其是丹参提
取物,对调节胆固醇代谢十分重要,它可抑制内源性
胆固醇的合成和增加胆固醇转化为胆汁酸。
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人参总皂苷体外定向诱导CD34+细胞分化为粒系血细胞的研究
王建伟,王亚平,王莎莉,姜 蓉
(重庆医科大学基础医学院重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆400016)
摘 要:目的 研究人参总皂苷(TSPG)协同造血生长因子对CD34+细胞体外定向诱导分化为粒系血细胞的影
响。方法 应用阴性磁性分选策略,以Stemsepl”系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干/7祖细胞(HSC/
HPC),通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG诱导CD34+HSC/HPc向粒系祖细胞集落(CFU—GM)增殖与
分化的能力;在SCF+IL一3+GM—CSF+G—CSF(SIGG)液体培养体系中加入不同剂量的TSPG,检测对CD34+
HSC/HPC增殖形成CFU—GM的影响以及CD33+细胞比例的变化。结果TSPG(10~50ug/mL)均能提高
CD34+细胞形成CFU—GM的集落产率,以TSPG20ug/mL效果最为明显;不同质量浓度的TSPG协同造血生长
因子在液体培养体系中诱导CD34+细胞2周,观察粒系血细胞的分化,TSPG10~70ug/mL均可不同程度地提高
细胞总数、CFU—GM扩增倍数及CD33+细胞比例,TSPG20ug/mL是液体培养诱导CD34+细胞向粒系分化的最
佳质量浓度。结论TSPG协同造血生长因子能促进CD34+细胞定向诱导分化为粒系血细胞。
收稿日期:2006—05—22
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号38670880,30472253)
作者简介:王建伟(1968一),女,副教授,博士,硕士生导师,重庆市科技项目与科技成果评审专家,主要研究方向为天然中药对造血的调
控。Tel:(023)68485087E—mail:wangjianwei88@sohu.corn
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
关键词:人参总皂苷;CD34+细胞;分化
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2007)01—0077一04
TotalsaponinsofPanaxginsengi ducingCD34+cellstodifferentiate
intogranulocytopoieticlineageinvitro
WANGJian—wei,WANGYa—ping,WANGSha一1i,JIANGRong
(ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPh macology,SchoolofBasicMedicine,
ChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400016,China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheffectofrecombinantbetweenh matopoieticgrowthfactors
andtotalsaponinsofPanaxginseng(TSPG)ongranulocytopoieticdifferentiationofpurifiedhuman
CD34+cellsderivedfromhumanbonemarrowcells.MethodsAsterilizedseparationsystemfor
purificationofCD34+hematopoieticstem/progentiorells(HSC/HPC)wasestablishedbymeansof
StemsepⅢaccordingtothestrategyofnegativeselectiononimmunomagneticseparation.Thecapacityof
variousconcentrationsofTSPGinducingCD34+cellstodifferentiateintoCFU—GMcellswasdetectedby
methylce luloseassays stems;CD34+cellswerecommittedlydifferentiatedw thvariouscombinationof
cytokinesinliquidculturesystemsandthexpandedcellnumber,CD33+cellratioandgranulocytopoietic
progenitorcellnumberweredetected:variousconcentrationsofTSPGwerethenaddedintoliquidculture
systemscontaingingSCF+IL一3+GM—CSF+G—CSF(SIGG),theelevationrateonproliferationofCD34+
cellsandtheformationofCFU—GMwereobservedandtheratioofCD33+cellsweree timated.Resuits
TSPG(10—50/生g/mL)couldincreasethecolonyyieldofCFU—GM,TSPG(20弘g/mL)didbest.Atthe
variousconcentrationsofTSPGynergizedwithematopoieticgrowthfactorsongranulocytopoietic
differentiationofCD34+cellsfortWOweeksinliquidculturesystems,TSPG(1O一70/19/mL)could
increaseth xpandedcellnumber,theamplificationmultipleoftotalCFU—GM,andCD33+cellratio;
TSPG20/19/mLwasidentifiedasthemostpotentialconcentrationforthegranulocytopoietic
differentiationofCD34+cellsin iquidculturesystem.ConclusionTSPGmaypromoteCD34+cellsto
proliferateandifferentiatetogranulocytopoieticlineagebysynergismw thhematopoieticgrowthfactors.
Keywords:thetotalsaponinsofPanaxginsengC.A.Meyer(TSPG);CD34+cells;differentiation
人参是祖国传统医学的补气要药,人参皂苷是
人参中主要有效成分。既往研究表明[1卅1人参总皂
苷(totalsaponinsofPanaxginseng,TSPG)是人
参促进血细胞生成的有效成分。TSPG在体内外均
能刺激造血祖细胞的增殖分化r2“]。本研究采用造血
细胞工程技术,以分离纯化的CD34+造血于/祖细
胞(CD34+HSC/HPC)为模型,探讨了TSPG协同
造血生长因子定向诱导对CD34+细胞分化为粒系
血细胞的作用,旨在进一步阐述人参补气生血的现
代生物学机制。
1材料与方法
1.1骨髓细胞:取胸外科无血液疾病患者切除的肋
骨骨髓,淋巴细胞分离液(Ficoll,相对密度1.077)
分离骨髓单个核细胞(MNC),RPMI一1640培养液
洗涤,用4号针头制备单细胞悬液,并计数MNC。
1.2药物:TSPG,重庆中药研究所惠赠,质量分数
95%以上,IMDM培养液配成1mg/mL的工作
液,正压滤过除菌。
1.3 主要试剂及材料:RPMI一1640、IMDM培养基
(Gibeo公司),胎牛血清(FBS,Sigma公司),马血
清(HS,军事医学科学院提供),CD33+抗体(Santa
Cruz公司),干细胞因子(SCF)、白细胞介素一3(IL一
3)、粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)、粒细胞
集落刺激因子(G—CSF)(军事医学科学院提供,使
用终质量浓度分别为100、2、50、20ng/mL)。
1.4 CD34+细胞的分离纯化[5]:利用StemsepTM阴
性分选系统进行分离,将4×107~8×107骨髓
MNC悬浮于含2%FBS的PBS缓冲液中,加入
antibodycocktail100/*L,0℃、30min,再加入磁性
胶体60弘L,0℃、30rain。将标记后的骨髓MNC加
入磁场中的分离柱内,缓冲液冲洗,从流出道收集
CD34+细胞群。经流式细胞仪FACSVantage
(BectonDickinsonImmunocytometrySystem,美
国)测定其纯度。
1.5 TSPG协同造血生长因子对CD34+细胞增殖
分化的影响:IMDM培养基中含12.5%HS、
12.5%FBS、5×103/mLCD34+细胞及重组细胞因
子;对照组,含细胞因子组合SCF+IL一3+GM—
万方数据
中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·79·
CSF+G—CSF;加药组,在以上细胞因子组合中加入
不同剂量的TSPG,终质量浓度分别为10、20、50、
70、100,ug/rnL。细胞因子每48h加入体系1次,均
连续加入5次;TSPG每周加入1次。上述体系接种
于24孔板中,每孔1mL,复种3孑L,37℃、5%CO。
及饱和湿度下培养2周。每周半量换液,取出细胞用
于细胞总数、CD33+细胞比例及CFU—GM祖细胞
检测。
1.6 CD33+细胞的检测:将扩增的细胞经PBS洗
涤后,用直接荧光法标记行流式细胞仪检测,每个样
品分析细胞数≥1×104个,用PC—LysysⅡ软件在
VAX3300微机(Digital,美国)上进行分析。
1.7 粒系造血祖细胞(CFU—GM)培养:体系中含
30%HS、10%BSA、SCF、IL一3、GM—CSF、G~CSF
及在此基础上分别加入1×104/mLCD34+细胞、
5×104/mL扩增细胞,IMDM及0.9%甲基纤维
素。药物组为在CD34+细胞培养体系中加入不同质
量浓度的TSPG(质量浓度同前),以不加TSPG为
对照组。所有培养均在96孔板(每孔0.2mL,复种
3~5孔),37℃、5%C0。及饱和湿度下培养14d,
计数CFU—GM。
1.8统计学方法:显著性分析用t检验。
2结果
2.1 骨髓CD34+细胞的分选、纯化与鉴定:骨髓
MNC中仅有少量细胞表达CD34+抗原,CD34+
HSC/HPC仅占1~3%,用StemsepTM系统分离纯
化可得到高纯度的CD34+细胞,经免疫细胞化学和
流式细胞术检测,其纯度为92%~94%。
2.2 TSPG诱导CD34+细胞定向分化为粒系血细
胞的作用:不同质量浓度的TSPG协同造血生长因
子诱导CD34+细胞2周,结果显示,TSPG10~70
,ug/mL均可不同程度地提高细胞总数、CFU—GM
扩增倍数及CD33+细胞比例,TSPG20/zg/mL是
液体培养诱导CD34+细胞向粒系分化的最佳质量
浓度,但TSPG100t-g/mL对细胞总数的增加有所
抑制,与对照组相比差异显著(表1)。
2.3 TSPG对CD34+细胞形成CFU—GM能力的
影响:以甲基纤维素半固体培养法检测不同剂量
TSPG诱导CD34+HSC/HPC向CFU—GM增殖能
力,结果TSPG(10~50ptg/mL)均能提高CD34+
细胞形成CFU—GM的集落产率,以TSPG20vg/
mL效果最为明显(P<0.01)(表2)。
3讨论
利用不同的细胞因子组合,使造血干/祖细胞按
表1 TSPG对人骨髓细胞中CD34+细胞定向诱导分化为
粒系血细胞的影响(髓一9)
Table1 EffectofTSPGongranulocytopoieticdifferen—
tiationofpurifiedCD34+cellsderivedfrom
humanbonemarrowcells(咒一9)
O(对照)
10
20
50
70
100
与对照组比较:’P<0.05一P
Table2 EffectofTSPGonCFU—GMcolony
formationofCD34+cells(以一12)
TSPG/(pg·mL一1)CFU—GM数/1×104个CD34+细胞
0(对照)
10
20
50
70
100
40.83±5.879
46.50士4.722‘
52.83士7.322+。
48.67±4.227。
43.50土3.082
41.33士3.204
与对照组比较:‘P
临床治疗的细胞产品。在造血干细胞移植和大剂量
化疗、放疗后患者将出现一段较长时间的粒细胞减
少和血小板减少,由此所造成的感染及出血往往成
为治疗失败的直接原因。目前针对这一现象往往采
用常规的抗感染及抗出血治疗,其结果是患者治疗
费用增高而疗效常不尽人意。虽然目前尚不清楚造
血干细胞产物中哪一部分群体与早期的造血恢复有
关,利用富集的CD34+细胞的研究提示可进行造血
重建的细胞存在于这一非成熟的细胞群体中。这样,
治疗这一细胞缺乏期的一个策略就是提供部分分化
的粒细胞和/或巨核细胞的前体细胞,这些细胞可在
输入后很快成熟,从而发挥其生理功能。利用这些扩
增的造血细胞作为目前造血千细胞治疗的补充方法
将会减轻或消除这些细胞减少症。
一项研究报道[6],回输培养3周后的外周血成
熟中性粒细胞可获得暂时的中性粒细胞恢复。这些
数据与其他的利用G—CSF动员后的异基因供者粒
细胞输注的研究结果相一致。利用PIXY321(IL一3/
GM—CSF)扩增CD34+细胞产生的中性粒细胞前体
细胞在1010的剂量下没有不良反应,还发现给予患
■
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万方数据
·80· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
者更大剂量的培养细胞可缩短中性粒细胞缺乏的时
间r7]。研究显示体外培养获得的中性粒细胞是有生
理功能的r8]。“生产”用于增加造血恢复细胞的争论
焦点在于是否能“生产”出有益于临床适合数量的细
胞。并且,维持这一数量的最佳方法是应该持续地产
生成熟的细胞,而不是一次大量地输入成熟细胞。所
以,目前人们仍在努力探索提高中性粒细胞“生产”
量的方案。本室多年来一直关注中医药,尤其是
TSPG对血发生的影响,研究表明:TSPG是人参促
进造血的主要成分。对于TSPG能否促进CFU—
GM的增殖,文献报道结论各异。黄干等[13认为
TSPG对小鼠CFU—GM的集落产率无明显影响;
但王勇等[93同样以小鼠为实验对象,却表明TSPG
对CFU—GM的刺激作用与剂量有关,TSPG在3
,ug/mL时对CF.U—GM的增殖的影响不明显,而当
质量浓度增高到20pg/mL时,CFU—GM的集落产
率明显提高;高瑞兰等E10]研究表明,人参皂苷能刺
激正常人和再障患者CFU—GM增殖;王莎莉等[3]
实验结果表明:在有外源性HGF(IL一3、Epo、GM—
CSF)存在的条件下,TSPG(20~100/19/mL)在
体外对人骨髓CFU—GM的增殖有显著促进作用,
经TSPG(50/-g/mL)诱导制备的人骨髓基质细
胞、胸腺细胞、脾细胞、血管内皮细胞、单核细胞培养
上清液同样可以促进CFU—GM的增殖,并且从调
控机制上进行了探讨,推测TSPG可通过直接和/或
间接途径刺激人骨髓细胞合成GM—CSFRa,使细胞
膜表面的GM—CSFRa数量增加,结合更多的GM—
CSF,还可以直接和/或间接地促进GM—CSFR(x和
Shc可逆磷酸化,从而调控GM—CSFR介导的信号
转导过程,最终促进CFU—GM的增殖分化。
基于以上的研究基础,直接以分离纯化的人骨
髓CD34+细胞为靶细胞,探讨TSPG对CD34十细
胞向粒系细胞分化的影响。本研究观察到,TSPG
10~70pg/mL均可不同程度地提高细胞总数、
CFU—GM扩增倍数及CD33+细胞比例,TSPG20
/-g/mL是液体培养诱导CD34+细胞向粒系分化的
最佳质量浓度。以甲基纤维素半固体培养法检测不
同质量浓度TSPG诱导CD34+HSC/HPC向
CFU—GM增殖与分化能力,结果显示TSPG(10~
50tlg/mL)均能提高CD34+细胞形成CFU—GM的
集落产率,以TSPG20/_g/mL效果最为明显。既往
研究及本研究结果表明TSPG能够协同其他细胞
因子诱导CD34+HSC/HPC向粒系细胞分化。
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白藜芦醇对多发性骨髓瘤细胞的体外抗癌作用
孙春艳,胡豫,刘新月,杨海燕
(华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所,湖北武汉430022)
摘要:目的研究白藜芦醇对多发性骨髓瘤细胞体外抗癌作用,探讨其抗癌作用的分子机制。方法用MTT法
检测白藜芦醇对骨髓瘤细胞系RPMI一8226和KM3增殖的影响;Annexin—V/PI双标流式细胞术检测白藜芦醇对
收稿日期:2006—04—30
作者简介:孙春艳(1976一),女,黑龙江省佳木斯市人,博士,主治医师,研究方向为恶性肿瘤的发病机制。
Tel:(027)62766183E—mail:ayan0618@163.com
万方数据
人参总皂苷体外定向诱导CD34+细胞分化为粒系血细胞的研究
作者: 王建伟, 王亚平, 王莎莉, 姜蓉, WANG Jian-wei, WANG Ya-ping, WANG Sha-li,
JIANG Rong
作者单位: 重庆医科大学基础医学院重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆,400016
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2007,38(1)
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本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200701029.aspx