全 文 ：·770· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
TraditHerbDrugs(中草药)，1999，30(5)：327—332．
Ei03YangXW，ZhaoJ，HattoriM．Studiesonthechemical
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东北红豆杉内生真菌的分离及产紫杉醇菌的鉴定
金涛1，王伟2，刘 军1，平文祥1，周东坡”
(1．黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨150080；
2．东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030)
东北红豆杉TaxuscuspidataSieb．etZucc．又
名紫杉、赤皮松、紫柏松，《本草推陈》记载有利尿、通
经作用，现代研究表明含有二萜类化合物，如紫杉宁
(taxinine)、紫杉宁A、紫杉宁H、紫杉宁K、紫杉宁
L等口]，另外还含有包括紫杉醇在内的紫杉烷类化
合物。紫杉醇(paclitaxel，商品名Tax01)是提取自红
豆杉植物的能够治疗多种癌症的有效药物口]。目前
已在临床上作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的
一线用药，其作用机制是抑制微管蛋白的解聚，破坏
细胞微管的功能，从而影响纺锤体的形成，抑制肿瘤
细胞的有丝分裂‘3|。由于红豆杉天然资源十分有限，
通过各种生物工程方法生产紫杉醇已经成为国内外
研究和规模开发紫杉醇的热点。通过微生物发酵法
生产紫杉醇不仅有利于保护珍稀濒危的红豆杉树
种，而且可以完全解决紫杉醇的药源问题，所以说微
生物发酵法生产紫杉醇具有十分巨大的经济效益和
广阔的开发空间。本实验主要对东北红豆杉内生真
菌的分离方法及产紫杉醇菌的鉴定进行了研究。
1材料和方法
1．1 标本：东北红豆杉树皮采样自黑龙江省穆棱林
业局。采集时注意树皮带有木质部并迅速放入无菌
材料袋，保存于实验室4℃冰箱。
1．2培养基：固体培养基包括PDA培养基[4]、查氏
培养基[4]、马丁氏琼脂培养基[4]。液体发酵培养基是
由添加维生素、金属离子的改良培养基组成[5]。
1．3 仪器与试剂：日本岛津LC一10ATvp高效液相
色谱仪，岛津SPD一10ATvp检测器，20弘L进样定量
环，日本岛津SIL一10AD自动进样器。Waters2695
液相色谱仪，ZQ2000质谱检测器(配有电喷雾电离
源)。具有显微摄影功能的OlympusBX51显微镜。
乙腈为液相色谱纯；高效液相色谱仪用水为双
蒸水；其他药品为分析纯；紫杉醇对照品购于Sigma
公司，质量分数大于99．8％，配制成质量浓度为
1．079mg／mL的对照品保存，使用时适当稀释。
1．4方法
1．4．1内生菌分离方法：所采集红豆杉的树皮切成
约0．5cm×0．5cm的小块，经75％酒精表面消毒2
min，然后用无菌水冲洗3遍左右，按3点接种法栽
种于PDA培养基平皿上，于恒温箱中28℃倒置培
养。3d后，经无菌操作挑取新长出的菌丝，划线转
接于PDA培养基平皿上，经数次划线分离，得到形
态完全一致的单菌落即纯化的内生真菌。
1．4．2液体发酵培养：菌株在28℃，120r／min的
摇床上进行培养。500mL三角瓶中培养基装置为
200mL，接种量为3％，培养周期为14d。
1．4．3发酵液中紫杉醇的薄层色谱初步鉴定：将东
北红豆杉内生真菌发酵液滤过，得到的菌丝体研磨
破壁，按质量与体积1：5的比例用醋酸乙酯萃取，
滤去菌丝的澄清滤液用同等体积的醋酸乙酯萃取3
次，将醋酸乙酯萃取液合并，50℃减压蒸干，用5
mL甲醇溶解再浓缩至o．5mL得样品液。
取硅胶适量加合适比例水研磨至均匀，倾倒于
薄层色谱板(20em×20cm)上，阴干24h后，于干
燥箱中105℃活化30min备用。取50肛L样品和5
肛L紫杉醇对照品点样于薄层色谱板上，每个样品间
距2am，放入展层剂已饱和的色谱缸中，展层剂为
收稿日期：2006—08—17
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30570025)；黑龙江省“十五”重大攻关课题(GA02C101)；黑龙江省教育厅资助项目(10533013)
作者简介：金涛’，男，博士，主要研究方向为生物制药和微生物学。Tel：13766969566E—mail：jintaoliu8@yahoo．eom．en
*通讯作者周东坡Tel：13936163985E—mail：zhoudp@yahoo．com．en
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·771·
氯仿一甲醇(7：1)溶液，当前沿跑至距薄层板上端1
em处时终止色谱。将板取出晾干，用1％的香草醛
浓硫酸溶液显色，观察紫杉醇特征性蓝点出现的有
无，即可初步判定是否为产紫杉醇菌株。
1．4．4高效液相分析和质谱分析：色谱柱为日本岛
津VP—ODS柱(150mm×4．6mm，5肛m)；流动相
为甲醇一水(60：40)，用磷酸调pH3．5；体积流量
0．7mL／min；柱温为室温；检测波长227Ylm[6]。
将紫杉醇对照品展层后显色，出现蓝色斑点处
作为对照，沿展层方向刮取待测样品相应位置上
1cm2正方形面积的硅胶(未经显色剂污染)，用1
mL甲醇溶解并超声洗脱，微孔滤膜滤过后浓缩至
0．2mL得测定液，进行高效液相分析和质谱分析。
1．4．5形态研究：将菌种接种于PDA、查氏、马丁
氏固体平板上，在28℃倒置培养在2、3、4d观察。
无菌挑取PDA固体平板上的菌丝，在显微镜下观
察并进行显微测量。
2结果
2．1 薄层色谱初步鉴定：经薄层色谱筛选出一株在
紫杉醇对照品相应位置出现蓝色斑点的菌株，命名
为HDl04。
2．2 高效液相分析：将HDl04菌株发酵液萃取后
经薄层色谱得到的测定液进行高效液相分析，与图
1一A紫杉醇对照品出峰位置相比较，测定样品(图1一
B)中也存在时间相近的峰，证明有紫杉醇存在，紫
杉醇峰峰形对称，与最近峰达到基线分离，说明高效
液相色谱分离良好。将紫杉醇对照品按倍数稀释不
同质量浓度进样，以峰面积(y)为纵坐标，紫杉醇质
量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得到的标准曲
线为y一4×107x+108305，R一0．9995，同一紫杉
醇质量浓度进样3次，测得RSD为4．07％。
0 5 10 15 20 25 30 35 40
t／rain
图1 紫杉醇(A)和紫杉醇发酵提取液HPLC图
Fig．1HPLCoftaxol(A)andtaxolextract
offermentatiomliquid(B)
2．3 质谱分析：经Waters液相色谱一质谱联用分
析，保留时间32．517min的组分有紫杉醇(相对分
子质量为854)特有的准分子离子峰EM+H]+为
m／z854．9，EM-FNa]+为m／z875．9止M十K]+为
m／z892．3，证明保留时间32．517min的组分确定
为紫杉醇成分。
2．4紫杉醇产生菌的形态观察
2．4．1菌落群体形态：HDl04菌株在PDA培养基
上生长迅速，培养至3d时，菌落直径就可达约4
cm，培养至4d时菌落明显比在其他菌落大，见表
1。因此将PDA培养基作为固体形态观察培养基，
该菌在生长初期，菌落直径较小，边缘较整齐，且呈
白色绒毛状。随着培养时间的延长，菌落直径逐步变
大，至培养4d时，可达8cm，且颜色变深为绿褐色。
菌落厚度约0．3cm。
表1 HDl04菌株分别在PDA、查氏、马丁氏培养基上的
生长情况
Table1 Growths atus0fHDl04straino PDA，
Czapek，andM rtin
7
Smedia
2．4．2菌落个体形态：菌丝暗色，多分支，有隔，直
径为2～6弘m，分子孢子梗细长，多呈树状分支，小
枝常对生，顶端膨大成球型，上生分生孢子，聚集成
葡萄穗状，并呈卵圆型，参照《真菌分类学》[7]有关形
态介绍，初步判断为葡萄孢属(Botrytis)
3讨论
本实验室对产紫杉醇菌的筛选，采用薄层色谱
初步筛选和高效液相分析相结合的方法，成本较低
并十分快捷准确，对于一般实验室采用薄层色谱初
步筛选仍有较好的借鉴意义。对于紫杉醇的高效液
相分析方法，本实验室采用了王文芝测定紫杉醇、
10一去乙酰基一7一差向紫杉醇、长嘴蕨碱、10一去乙酰基
紫杉醇、浆果赤霉素Ⅲ和10一去乙酰基浆果赤霉素
Ⅲ等6种化合物的反相高效液相色谱分析法，用此
法分离紫杉醇、lo一去乙酰基一7一差向紫杉醇、长嘴蕨
碱能达到基线分离，因此用于发酵液中紫杉醇的测
定是可行的，但存在的缺点是测定时间较长，本实验
室关于新的简便快捷测定方法的研究正在进行中。
另外，通过分子生物学研究来确认HDl04菌株的种
属分类有待进一步研究，它的生长特性、培养条件和
如何提高其紫杉醇的产量将是今后研究的重点。
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万方数据
·772· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
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不同生长期巴戟天中水晶兰苷量的变化
徐吉银，梁英娇，丁平+
(广州中医药大学中药学院，广东广州510405)
巴戟天是著名的四大南药之一，来源于茜草科
巴戟天属植物巴戟MorindaofficinalisHow的干燥
根。具补肾阳、强筋骨、祛风湿功效，临床用于治疗阳
痿遗精、宫冷不孕、月经不调、少腹冷痛、风湿痹痛、
筋骨痿软等症[1]。
巴戟天中含蒽醌汾引、环烯醚萜E6¨3、寡糖[8’9|、
多糖[10～13]等成分。到目前为止，对不同来源的巴戟
天中蒽醌[10,14]、寡糖m]、多糖‘9’10’12~143成分均进行过
测定研究，而对环烯醚萜类化学成分的定量测定未
见报道。据文献报道，巴戟天中的环烯醚萜类成分水
晶兰苷在巴戟天中的量较高，并具有较强的抗炎镇
痛作用[6’7’16’17|。由于对不同生长期巴戟天中水晶兰
苷的动态变化研究未见报道，因此，本实验以水晶兰
苷为指标，分别测定了不同生长期巴戟天中含水晶
兰苷的量，并研究其变化规律，为巴戟天的质量标准
的制定提供一定的参考资料。
1材料、仪器与试剂
1．1材料：所有的巴戟天样品采集于广东省德庆县
巴戟天规范化种植基地，共25个(表1)。经丁平研
究员鉴定为巴戟MoHnda硝；cinalisHow的根。凭
证标本存予广州中医药大学中药资源研究室。
1．2仪器与试剂：DionexsummitP680高效液相
色谱仪(德国)；DionexPDA100二极管阵列检测
器；ASl—100自动进样系统；Sartorius电子天平
(德国)；超声提取器(220W，55kHz)；水晶兰苷标
准品(自制，质量分数>99％)；甲醇(色谱纯，Merck
公司)；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2．1 色谱条件：色谱柱：KromalsilC18柱(150mmX
4．6mm，5肛m)，流动相：甲醇一0．4％磷酸水溶液(5；
95—28．8：71．2，15min)；体积流量：1mL／min；进
样量；10弘L；检测波长：231nm；柱温：25℃。在上述条
件下，供试品溶液中水晶兰苷色谱峰与其他峰分离良好，
峰形对称，保留时间为11．50min左右(图1)。
l
A
l
B
㈩
L——JL。
l一水晶兰苷
1-monotropein
图1水晶兰苷对照品(A)和巴戟天(B)HPLC豳
Fig．1HPLCChromatogramofmonotropelnreference
substance(A)andRadixMorindaeOfficinalis(B)
2．2样品溶液制备：取样品粉末(过40目筛)0．5
g，精密称定，置150mL带塞三角瓶中，加入80％甲
醇100mL，冷浸1h，超声处理30min，滤过，残渣
再超声提取一次。合并提取液，水浴蒸干，残渣用
80％甲醇定容至10mL。溶液用0．45肛m微孔滤膜
滤过，即得。
2．3标准曲线制备：取水晶兰苷适量，精密称定，用
甲醇溶解，配制成质量浓度为0．74mg／mL的溶液。
收稿日期：2006—08一10
基金项目：2004年广东省自然科学基金项目(04010057)；2006年广东省自然科学基金重点项目(06105061)
作者筒介：徐吉银(1978一)，男，汉族，硕士，现在中智药业集团有限公司。E—marl：twtyfkfqvey@126．corn
*通讯作者丁平，博士，研究员，主要从事中药资源与中药材质量标准的研究。 E—mail：dingpinggz@126．com
万方数据
东北红豆杉内生真菌的分离及产紫杉醇菌的鉴定
作者： 金涛， 王伟， 刘军， 平文祥， 周东坡
作者单位： 金涛,刘军,平文祥,周东坡(黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,黑龙
江,哈尔滨,150080)， 王伟(东北农业大学食品学院,黑龙江,哈尔滨,150030)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(5)
被引用次数： 11次

参考文献(7条)
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